Name: 高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学ぶ高周波刺激によるマウス海馬歯状回の神経活動と神経新生の評価法。c-fos、Notch1、BrdU染色を用いて分子メカニズムを解析し、脳疾患治療への応用可能性を示す。

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(ハイタオ呉) に中国から助成金 Z161100000216154 の基礎研究の状態主要な開発プログラムから 973 (2014CB542203) プログラムの 31522029、31770929、31371149 (ハイタオ呉) に中国の助成金の国家自然科学基金を支え、北京市科学技術委員会 (ハイタオ呉) に.著者は、彼らの励ましと議論ハイタオ呉研究所のすべてのメンバーをありがとうございます。著者は、装置をデバッグでご支援威劉に非常に感謝しています。

動物実験手順、北京基礎医科学研究所 (中国・北京) のケアと実験動物の使用のための中国の政府の規制機関のガイドラインに従った。マウス (成人男性、26 〜 30 g) が収容され、12 h 光/12-h 暗いサイクル (7:00 に点灯)、下水と食品広告自由との 23 ° C の一定温度で保管します。光のサイクル中にすべての実験プロシージャを行った。
1. 手術の準備
注: カスタム電極だったハルパーンのレポート23から変更メソッドを使用して自家製。
<ol><li>並列バイポーラ電極として 2 マイクロ-銅線 (外径 200 μ m) を使用します。電極刺激用円筒電極を形成するためにお互いの周りをラップします。 注: ここでは、PP または DG 内電極の長さは、核の解剖学的深度によると変化させた。</li>
	<li>エチレン酸化物の消毒キャビネットを使用して電極を滅菌します。処理し、汚染することがなく自家製の 2 ch マイクロ ワイヤ電極を格納します。電極は、任意の外科的移植前に厳密に滅菌する必要があります。</li>
	<li>オートクレーブ手術器具。</li>
	<li>手術前に麻酔の手術面を達成するために、ペントバルビ タール (20 〜 50 mg/kg) と腹腔内、マウスを挿入します。</li>
	<li>滅菌ペニシリン G プロカイン サスペンション (75,000 U、i. m.)、感染症や痛み、それぞれ24のリスクを減らすための鎮痛エージェント (カルプロフェン、0.05 - 1 mg/kg、SC) とマウスを注入します。</li>
	<li>動物の麻酔した後に、目の乾燥を防ぐために両方の目に目の潤滑剤を適用します。つま先の摘心し、応答がないときにだけ、操作を続行応答で動物の反射により、鎮静作用の誘導と麻酔の深さを確保します。 注: 獣医軟膏は目の乾燥を防ぐために別のオプションです。</li>
	<li>電気バリカンや剃刀の刃を持つマウスの頭の上に毛皮のほとんどを剃る、70% アルコールや betadine ソリューションの 3 つの交互になるスクラブと剃毛エリアを滅菌、betadine、皮膚に乾燥後に操作を続行します。</li>
</ol>2. 高周波刺激手術25,26
注: この手順では電極は一方的背 DG または内側の PP エリア、エピソードの学習と記憶に重要な役割を持つ海馬の部分に植えられました。
<ol><li>定位脳手術フレームに麻酔下のマウスを置きます。マウスの頭を動かないように、耳バーを正しく整列させるし、すぐにそれらをインストールします。中心の頭をサポートし、マウスを少し確保して優しく耳バーを締めます。</li>
	<li>37 ± で動物の体の温度を維持するためにサーモスタットのパッドを使用して 0.5 の ° c.</li>
	<li>鉗子を使用して、マウスの耳前方の皮膚をつかみ、マウスの頭蓋骨の上に皮膚の 1 cm2の領域を削除する滅菌はさみでカットします。 注: カット皮膚の端に少量の出血を観察できます。</li>
	<li>筋肉や頭蓋骨表面を公開する綿棒と頭蓋骨を覆う他の添付ファイルを削除します。すべての骨膜、腱、結合組織から頭蓋骨の完全に識別、矢状面とラムダ縫合線をきれいに綿棒と解離性ノミを使用します。</li>
	<li>前とラムダ点を識別します。冠状縫合と、頭蓋骨の優れた中間部分の矢状縫合の交点は前があります。矢状縫合で後上の縫合の交点はラムダが目に見えるです。他の核の位置を設定するのには、元のポイントとして前を使用します。</li>
	<li>頭蓋骨の前とラムダの位置の同定後、横のレベルでこれらの 2 つの点を調整します。これらの 2 つの点の高さが (すべてのエラーは、< 0.05 mm をする必要があります), 背腹方向にほぼ同じであることを確認します。また、頭蓋骨が同じ方法26で内側外側方向に水平であることを確認します。</li>
	<li>片側手術のため、自家製 2 ch 銅マイクロ ワイヤ電極を定位脳手術フレーム回転電極ホルダーにマウントします。</li>
	<li>最初は、前のポイントの上に垂直方向に電極を置き、元のサイトとして設定。デジタルを使用して表示、前後 (ap 通信)、内側外側 (ML) を示す定位脳手術フレーム、背腹 (DV) が配置されます。 注: 電極が曲がってばかりを防ぐために操作中に頭蓋骨に電極先端部を触ください。</li>
	<li>電極を正しい位置にゆっくり移動 (図 1 a、pp、DG と AP-3.8/ML ± 3.0 の AP-2.1/ML ± 1.0 それぞれ)27タッチせず頭蓋骨の上。電極挿入の目的のサイトが見つかった、電極ホルダー高い卵割の定位調整を使用して、黒のマーカーの位置をマークします。 メモ: 定位座標に関して正確な場所はマウス緊張、重量、および性によって異なります。同性の大人のマウスを使用して、場所の変化を最小限に抑えるください。可能であれば、事前の解剖学的なスキャンは、個々 の主題の基礎27上の場所を識別するために使用ください。</li>
	<li>マイクロマニピュレーター アシスト ハンドドリルを使用して (サイズをバリ = 0.5 mm) マークした位置でバリ穴を正確にあける。掘削前に 70% のエタノールでバリの先端を滅菌します。0.8 - 1.0 ミリメートルの X と Y の位置を変更することがなく z 軸に沿って頭蓋骨を介してミニ ドリル ビットを移動します。操作中に任意の出血を止めるため滅菌綿を使用します。 注: 掘削中に過剰掘削、過度の発熱を避けるためには、掘削速度 15,000-18,000 回転/分 (RPM) は、すべて 8-10 のバリの穴からドリル ビットをよく撤回を確認します。</li>
	<li>硬膜は、公開までの掘削を維持します。曲がった針を使用して、掘削中に生成される、基になる柔らかい脳組織を損傷することがなく硬膜にピンホールを作るすべての骨のスクラップを削除します。 注: 脳組織を損傷しないように、ベントの鈍針置き換えることもできます罰金鈍い鉗子が付いて。</li>
	<li>バリ穴が目的の位置に適切に行われたことを確認するため定位脳手術フレームの調節によって電極の高さを減らすし、電極はバリの穴を介しては障害物に触れることがなくスムーズに挿入されることを確認します。もしそうならはゆっくりと電極を DG (DG PP) に内側の PP である頭蓋骨の表面に 1.8 mm DG (または PP の 3.0 mm) の深さに挿入します。 注: は、電極注入のプロセス中に脳脊髄液または滅菌綿とぎざぎざの穴からの血液流出をふき取りなさい。</li>
	<li>マイクロ ワイヤ電極を頭蓋の穴に挿入すると、小さなヘラを使用して適切な歯科用セメントと場所に保持します。セメントが濃くなると挿入された電極と素敵な滑らかなキャップを形成するネジの周り金型します。なかでも、創傷部を消毒してください。</li>
	<li>電極ホルダーから電極を外します。定位脳手術フレームからマウスを外し、暖かいケージに戻ります。 注: 手術後、彼らは完全に十分な意識と麻酔から回復してまで自分のケージに動物を返すと待ちます。</li>
	<li>マウスを自由に移動し、檻の中を 2 日間の回復することができます。注入電極を接続し、マウスでは、プログラマブル刺激を介して脳、。図 2に示されるように、ソフトウェアのインターフェイスを設定します。400 Hz で 6 パルスの 6 列車の 6 シリーズとして HFS パラメーターを設定 (図 1B列車、20 間 100 ms シリーズの間 s)28。200 μ A に刺激強度を設定します。</li>
	<li>セットとして必要な期間、HFS を提供します。刺激 2 日 x 8:00、20:00 配信します。</li>
	<li>コントロール グループのマウスの電極をインプラントし、刺激を実行しないでください。</li>
	<li>Fosの染色実験的マウスを鋭く刺激 (一日あたり 2 倍)。Brdu 細胞標識の分割実験的マウス急性刺激グループ (一日あたり 2 倍を適用) と慢性的な刺激のグループ (10 x 5 日間で、1 日あたり 2 倍を適用)。刺激の中に、マウスが目がさめているを確認します。リードがよじれていないことを確認してください。 注: プロシージャの最後の日で急性刺激群マウスは励まされて同時に。</li>
	<li>刺激が終わったら、慎重に電極ホルダーおよび記録システムのコネクタから電極ピンを外します。</li>
</ol>3. 蛍光抗体法およびブロモデオキシウリジン29を表示
<ol><li>Fosおよび notch1 遺伝子の染色は、最後の HF DBS 刺激後約 3 時間は麻酔の手術面を達成するために (20-50 mg/kg, i. p.) ペントバルビ タールを注射することによってマウスを麻酔します。</li>
	<li>Brdu 細胞標識の最後の HF DBS 刺激後約 12 時間は 2 h の間隔 (0.9% 生理食塩水、i. p. では 50 mg/kg) でコントロールして誘導マウス BrdU の 6 注射を与えます。最後の注射後 36 時間は、手術面を達成するために (20-50 mg/kg, i. p.) ペントバルビ タールを注射することによってマウスを麻酔します。</li>
	<li>心を公開し、左心室に灌流 22 ゲージ鈍針に胸郭をメスを使って切開を確認します。右のアトリウムで小切開を行います。Transcardially はそれを冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 50 mL の 1x PBS (pH 7.4) の冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の後の 50 mL の灌流します。 注: は、マウス血、生体内では置き換えられ、明確な流体を実行時に PFA に PBS を切り替えます。良い血流は肝のクリアによって判断できます。灌流固定微動が観測されている30一度停止してください。</li>
	<li>眼科用ハサミでマウスの首をはねる、皮膚を切開し頭蓋骨を公開します。鉗子を使用して、頭蓋骨を少しチップそして慎重に全体のマウスの脳を解剖します。ポスト ﬁx 追加 2 日間 4% パラホルムアルデヒドで脳と一晩で 4 ° C 30% ショ糖液に転送します。</li>
	<li>クライオスタットを使用して、20 μ m のコロナ セクションに脳を切り。転送しブラシでスライド ガラスのセクションをマウントし、-20 ° C で保存 注: 電極 misplacements または過度の機械的損傷を持つ動物は、その後の分析から除外されます。</li>
	<li>通常 PBS (0.1 M、pH 7.4) にスライドをコピーする定着剤が含まれていません。任意の余分な定着剤を削除する各 5 分の 3-4 倍の PBS とスライスを洗います。BrdU 標識グループのセクション 2 N 塩酸 37 ° C で 30 分間インキュベートし、0.1 M ホウ酸バッファーにそれらを洗い流して (pH 8.4; 10 分)。その後、洗ってスライス 2 x PBS で 5 分間。 注: 免疫染色が実行されます。</li>
	<li>ソリューション (0.5% トリトン X-100 と 0.02% アジ化ナトリウム 1x PBS で、3% ウシ血清アルブミン < BSA > 1% ヤギ血清) 室温 (RT) で 1 h のブロックでスライスを扱います。</li>
	<li>アンチfosポリクローナル抗体 (1: 500; ウサギ)、反 notch1 遺伝子の抗体 (1:50; ヤギ)、またはブロッキング液の 4 ° c で抗 BrdU 抗体 (1:800; ラット) とスライスを一晩インキュベートします。</li>
	<li>洗ってスライス 3 x pbs は、インキュベーションして Alexa Fluor 568 共役抗家兎 (1: 500)、Alexa Fluor 488 共役の反やぎ (1:1, 000) とまたは Alexa Fluor 488 共役抗ラット (1: 500) 二次抗体室温 1 時間</li>
	<li>サンプル 3 を洗って PBS (各時間 10 分) で x。DAPI を含む耐フェード試薬マウント媒体を用いた免疫標識脳のセクションをカバーしてください。空気乾燥し、4 ° C で光から保護保存スライスを聞かせてください。</li>
	<li>高分解能マルチ チャンネル (シーケンシャル) 走査共焦点顕微鏡と脳の刺激と非刺激側から海馬領域の画像を取得します。対照群と実験群の間に一貫して撮像パラメーターを設定します。</li>
	<li>隣接する電動ステージを使用して、ビューのフィールドの連続 3次元 (XYZ) を獲得し、大型複合材を作るためにそれらをステッチする適切なソフトウェアを活用して高倍率の目的 (20 X 空気目的、NA 0.45) モザイク画像を実行します。画像。 注: 真のステッチと改良されたシームレスなイメージのオプションを平滑化に、タイリング機能が含まれます。複合画像迅速かつ簡単に使用しておりますステッチ機能広域イメージを形成します。</li>
	<li>C-fosと notch1 遺伝子の染色、蛍光密度21ステッチの画像の肯定的な核定量分析を実行します。ランダムに吻側、背側、腹側海馬 DG 小で 3 エリアを選択し、画像 Jのソフトウェア (http://rsb.info.nih.gov/ij/) の31を使用して二重盲検の方法で蛍光の密度を測定します。</li>
	<li>ラベリング BrdU、二重盲検の方法で背側海馬 (前を基準にして-2.70 mm-1.70 mm) を介して掘削ポイント周りスライスを分析します。</li>
	<li>DG における BrdU 陽性ニューロンのみをカウントします。カウントの顆粒細胞の 2 セル径内に横たわっているセルが含まれてください。 注: ここでは、カウントを行った空気目的 X 40 を使用しています。ランダムに 3-5 セクションごとに動物が数えられたとカウントされた平均し DG19あたりの手段として表されます。</li>
</ol>

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著者申告するものがあります。

HF DBS 手法は、1990 年代以降多くの神経疾患の治療のための強力なツールとして広く使用されています。これまでのところ、HF DBS のランドマーク作業はパーキンソン病や本態性振戦、多くの関心とクリニックと科学的なコミュニティの両方の関心を集めているの治療。特定神経疾患、精神疾患32,33HF DBS 治療上の適用の多くのグループによって進行中の HF DBS 研究のさまざまな種類があります。これらの研究のいくつかは現在臨床試験2,34のさまざまな段階で。刺激の副作用も可逆的である気分、思考などの否定的な変更のような頭脳で完璧な配置で発生する可能性し、の変更を避けることができる HF DBS は、大きな利点をもたらす必要があります、刺激の設定。
臨床試験からの過去十年にわたって蓄積 HF DB 技術の大幅な進歩、に加えて生きて...

HF DBS は、1870 年代1から培われた脳の電気刺激のため脳神経外科技術です。1980 年代後半に HFS がパーキンソン病の潜在的な治療的介入として使用された最初と他の運動障害2。過去数十年で、HF DBS 使用されていますより広く現在治療である脳疾患の治療に従来の治療方針で。特に、HFS 電極、非常に効果的な成果、最小限の副作用の精度向上のため、HF DBS によって扱われる脳疾患の大幅増えている過去数十年3,4、 5。HF DBS をパーキンソン病 (PD)、アルツハイマー型痴呆、本態性振戦、運動疾患2,6、の他の種類の治療のため米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されているなど7。 ドーパミン作動性薬の削減 PD 患者における HF DBS8時 50% まで。運動障害の治療に加えて HF DBS はも2,9,として認知増強のため診療所で精神疾患の治療に強力な効果を示しています。10,11. HFS の他の精神疾患の治療のための研究は、さまざまな段階、患者12に多くの約束を提供することに注意してください。
多くの研究は焦点の HFS が脳13全体のローカルとリモートの両方の効果を持っていることを示している、とらえどころのない2,14のまま効果の神経学的および分子のメカニズムです。診療所で治療 HF DBS は、通常のパーキンソン病と慢性の痛みなど多くの意見がどの 1 つの可能性の間での HF DBS 治療によって生成される改善を説明する発生の治療のため長期的な方法で適用されます。現在の HFS は、変調注入の HFS 電極近傍における軸索の反復的な脱分極によって神経ネットワークの活動をおそらく。また、HF DBS は、出力ニューロンと投影のターゲットの吐出量を変更可能性があります。また、HF DBS をつながる可能性があります長期的なシナプスの変化によって、長期増強 (LTP) や長期抑圧 (LTD) などに症状の改善に貢献するかもしれない。ところ、それはまだ不明かどうか HFS inﬂuences 携帯を調節する分子のキーイベント処理など成体脳ニューロン新生の生体として。研究のいくつかの行は、齧歯動物の HFS が臨床的に応用の DBS15,16のと同様の神経応答を模倣可能性がありますを示しています。本研究では、HF DBS の基になる細胞メカニズムを理解するには、我々 最初にセットアップを生体内でHFS 方法論マウスで急性 (1 日) または慢性 (5 日間) さま。第二に、我々 は HF DBS 出産後神経と神経活動の変化を決定する化分析の方法論を設定します。
神経幹細胞から神経細胞の生産が萌芽期の開発の間に豊かなが、大人の生活の中で続けていることを考える、海馬顆粒ゾーンは細胞新生が発生する主要な領域の 1 つです。神経新生のプロセスは、多くの生理学的および病理学的要因の影響を受けます。特定のてんかんの場合は、海馬の神経新生は劇的に減少した17,18です。さらに、単一電気けいれん療法は、19海馬歯状回の神経細胞の生産を大幅に向上する可能性があります。電気生理学的活動が成体と海馬ニューロンのシナプス可塑性の調節に重要な役割を果たしていることが示唆されました。したがって、神経活動と神経新生に及ぼす HF DBS をさらに示すためには、まず実施から生じる短期的な神経活動のよく知られているマーカーは、即時初期遺伝子 (IEG) fosの免疫染色法20をが発生します。Notch1 遺伝子のシグナルが検出された HFS 配信21,22後シグナル伝達活性をモニターします。さらに、我々 は、BrdU 染色することもできます gliogenesis のマーカーが様々 な方法で HF DBS 誘導後分析をラベリング BrdU による神経の生産も検出します。
本研究では 2 つの HFS 方法は直接および間接的に海馬 DG の活性化をターゲットに適応されます。電極は DG に直接注入または DG の神経細胞をアクティブにする予測を送信内側貫通パス (PP) に移植しています。HF DBS 誘導プログラム可能な刺激は、マウスの頭の上に固定電極を連続刺激を介して提示されます。HFS の神経細胞の活性化と神経新生に及ぼす影響を決定する免疫蛍光染色と海馬 DG 地域における BrdU 組み込まれて肯定的なニューロン数c-fosと notch1 遺伝子の発現を検出後,HFS の治療。特に、HF DBS の DG における神経新生に及ぼす影響比較されます急性と慢性刺激方法または直接および間接的な刺激方法間それぞれ。

<table><tbody><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>マウス用定位頭蓋内移植</td></tr><tr><td>刺激装置</td><td>A-Mシステム</td><td>Model 3800</td><td>MultiStim 8チャンネルプログラマブルスティミュレーター</td></tr><tr><td>歯科用ドリラー</td><td>Saeshin Precision Co., Ltd</td><td>STRONG 90</td><td>穴あけおよび脳切開術用&nbsp;</td></tr><tr><td>Burr</td><td>Meisinger</td><td>HM1 005#</td><td>掘削および椎堤開術用&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1550 デジタイザー</td><td>分子デバイス</td><td>AXON 1550</td><td>高解像度データ収集</td></tr><tr><td>クライオトーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サーモクライオトーム FSE</td><td>標本の凍結切片の切断</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV-1200</td><td>日本、20倍対物レンズ付き (NA 0.45)</td></tr><tr><td>マウス手術ツール</td> F.S.T.14084-08,11254-20,16109-14 <td></td><td></td><td>ハサミ、鉗子、ボーンカッター、ホルダーなど</td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>R&Dシステム</td><td>4579</td><td>20-50mg / kg、i.p.注射</td></tr><tr><td>用ペニシリンG&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>75,000 U for i.m.</td></tr><tr><td>injection Carprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1713</td><td>5-10mg/kg, for s.c. injection</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Beijing Solarbio Sci-Tech Co.&nbsp;</td><td>P1110</td><td>組織固定用ストッキング溶液</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>pH7.4, 500ml in stocking</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>水溶性グリコールおよび樹脂の製剤</td></tr><tr><td>抗BrdU抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>希釈液:1/800</td></tr><tr><td>抗c-fos抗体</td><td>Abcam</td><td>ab209794</td><td>希釈液:1/500</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(Alexa Fluor 568)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11036</td><td>希釈:1/500</td></tr><tr><td>ロバ抗ラットIgG(Alexa Fluor 488)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>712-546-150</td><td>希釈:1/500</td></tr><tr><td>DAPI退色防止封入剤</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>抗Notch1抗体(C-20)</td><td>による</td><td>対比染色sc-6014</td><td>希釈率:1/50</td></tr><tr><td>ロバ反ヤギIgG(Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td>希釈率:1/1000</td></tr></tbody></table>

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

電気高周波刺激 (HFS)、さまざまな脳領域をターゲット注入電極を使用しては、様々 な神経疾患、精神疾患の効果的な治療法として実証されています。深部脳刺激療法 (DBS) とも呼ばれます、脳の深部で HFS 臨床試験でますます重要になってきた。高周波 (HF DBS) 外科領域の最近の進歩は大鬱病障害 (MDD)、強迫性障害 (OCD) の治療など、その他の状況にこの侵襲的手法の利用可能性を普及し始めているので上。
これらの拡大の徴候にもかかわらず HF DBS の有益な効果のメカニズムに残る謎。この問題に対処するため 1 つのアプローチはまばら HFS によってニューロンの分散のサブポピュレーションをアクティブに注入電極を使用します。それは、診療所における難治てんかんの治療のため、視床の前核の HFS がされる可能性がありますが報告されています。基になるメカニズムは増加神経新生に関連するかもしれない、神経活動を変更します。したがって、HFS 治療前後 (DG) のマウスの海馬歯状回における神経新生と同様に、神経活動の検出による生理学的変化を探究することに興味を持っております。
本稿では、直接または間接的、急性または慢性的にマウスで DG の活性化をターゲットに HFS のための方法論について述べる.さらに、述べるは、 c-fosと notch1 遺伝子の神経の活動を監視する染色とシグナル伝達活性化蛍光ブロモデオキシウリジン (BrdU) を決定するためにラベル付け、脳スライスの準備のための詳しいプロトコル、HF DBS 誘導後の新生。HF DBS 治療後神経活動と神経の活性化は、神経生物学の直接証拠と潜在的な治療上の利点を提供します。特に、この方法論を変更し、大脳基底核などの他の興味がある頭脳領域とクリニック特定の脳障害に対する視床領域をターゲットに適用できます。

次の海馬の DG のサブ領域を直接または DG を直接活性化する PP サブ領域に HF DBS 刺激定位調整を使用してを介して挿入された電極、齧歯動物の, ペントバルビ タール麻酔をかけられましたし、3 h をサンプリングc-fosと notch1 遺伝子免疫染色の最後の HF DBS 刺激。BrdU の染色、1 日または 5 日間 HF DBS 刺激の後最後の BrdU 投与後 36 h のげっ歯類脳セクションの準備のため, ペントバルビ タール麻酔されました。図 3は、 c-fosの発現も DG の同側で増加したことを示します。また、DG の側におけるc-fos発現fosの信号の表現をほとんど示さなかった人いいえ HF DBS 刺激コントロールに比べて亢進していたも。我々 はさらに、notch1 遺伝子のシグナルもできなかった大人の海馬 DG の HFS 刺激後誘導によって実証 notch1 遺伝子特定の免疫蛍光染色脳...

このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング ブロモデオキシウリジンによる定量化されます。

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

この実験の全体的な目標は、ニューロン新生におけるニューロン活動に対する高周波刺激の影響を観察することです。この方法は、ニューロン活動の誘導や海馬のニューロン新生など、高周波脳深部刺激療法の整合した細胞および分子メカニズムにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の利点は、高周波TBSが成体脳のニューロン活動と神経新生に及ぼす強力な効果を実証できることです。この方法は、マウス歯状回に対する高周波TBSの影響についての洞察を提供することができますが、臨床で脳障害の大脳基底核や視床下領域などの他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスを定位フレームに置きます。耳のバンドを頭に合わせ、中央の頭を支えるように優しく締めます。耳の前方の皮膚をつかみ、頭蓋骨の約1平方センチメートルを取り除きます。次に、頭蓋骨を覆っている筋肉やその他のアタッチメントを綿棒で取り除き、頭蓋骨の表面を露出させます。次に、過酸化水素溶液を塗布して頭蓋骨を乾燥させ、矢状縫合線とラムダ縫合線を特定します。次に、ブレグマとラムダを特定します。ブレグマ点は、核の位置を設定するための元の点として使用されます。その後、これらの2つのポイントを使用して、頭蓋骨を水平面上で水平にします。これら2つのポイントの高さが背側腹面でほぼ同じであることを確認してください。さらに、頭蓋骨が内側の外側面で水平になっていることを確認してください。次に、自家製の2チャンネル銅マイクロワイヤー電極を定位手術フレームの回転電極ホルダーに取り付けます。電極をブレグマの真上に置き、元のサイトとして設定します。次に、電極に触れずに、電極を頭蓋骨の上の正しい位置にゆっくりと動かします。定位手術フレームのデジタルディスプレイを使用して、前方後方、内側外側、および背腹の位置を示します。電極挿入用の目的の部位が特定されたら、その位置に黒いマーカーで印を付けます。その後、背腹定位調整を使用して電極ホルダーを持ち上げます。次に、ドリルビットを70%エタノールで滅菌します。ハンドヘルドマイクロマニピュレーターアシストドリルを使用して、マークされた位置に正確にバリ穴を開けます。滅菌綿棒を使用して、手術中の出血を止めます。硬膜が露出するまで穴を開け続けます。曲がった針を使用して、穴あけ中に発生する骨のスクラップを取り除き、下にある柔らかい脳組織に損傷を与えることなく硬膜にピンホールを作ります。バリ穴が目的の位置に正しく作られていることを確認するために、電極を下げて、障害物に触れることなくバリ穴にスムーズに挿入されることを確認します。抵抗が検出されない場合は、頭蓋骨の表面から目的の深さまで電極をゆっくりと挿入します。次に、小さなヘラを使用して歯科用セメントを塗布し、電極を所定の位置に保持します。セメントが濃くなったら、挿入された電極と他の骨ネジの周りに成形して、滑らかで滑らかなキャップを形成します。次に、電極を電極ホルダーから外します。マウスを定位フレームから取り外し、温かいケージに戻します。マウスを自由に動かし、ケージ内で2日間回復させます。刺激を送達するには、埋め込まれた電極をリード線を介してプログラム可能な刺激装置に接続します。ソフトウェアインターフェースを設定します。次に、HFS パラメーターを 400 ヘルツの 6 パルスの 6 列の 6 列、および刺激強度を 200 ミリアンペアに設定します。設定どおりに希望の期間HFSを配信します。対照群では、刺激を与えずにマウスに電極を埋め込みます。CFAS染色の場合は、実験マウスを1日2回刺激します。BrdUラベリングでは、急性刺激群と慢性刺激群の両方に適切な刺激を適用します。刺激の過程で、マウスが起きていることを確認してください。リードがねじれていないことを確認することを忘れないでください。刺激が完了したら、記録システムのコネクタにある電極ホルダーから電極ピンを慎重に外します。CFASおよびノッチ1染色の場合、最後のHFDBSの約3時間後に、ペントバルビタールを注射してマウスに麻酔をかけ、麻酔の手術面を達成します。BrdU標識では、最後のHFDBS刺激から約12時間後に、対照マウスと刺激マウスに2時間間隔でBrdUを6回注入します。最後の注射から36時間後、マウスにペントバルビタールで深く麻酔をかけ、50ミリリットルの冷たいPBSと続いて50ミリリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドで経心的に大量に投与します。頭を取り外し、皮膚を切開してスキルを露出させます。鉗子を使用して、頭蓋骨を少し削り取り、脳全体を慎重に取り除きます。その後、脳を4%パラホルムアルデヒドでさらに2日間ポストフィックスし、摂氏4度の30%スクロース溶液に一晩移します。クライオスタットを使用して、脳を20ミクロンの冠状切片にスライスします。切片をブラシでスライドガラスに移して取り付け、マイナス20°Cで保管します。その後、固定剤を含まない通常のPBSにスライドを移します。切片をPBSで3〜4回、それぞれ5分間洗浄して、余分な固定剤を取り除きます。BrdU標識基については、切片を2モルHCLで摂氏37度で30分間インキュベートし、0.1モルのホウ酸緩衝液ですすいでください。10分後、切片をPBSで2回、毎回5分間洗浄します。その後、切片をブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。次に、切片を抗CFASポリクローナル抗体、抗ノッチOne抗体、または抗BrdU抗体と混合した切片を、摂氏4度のブロッキング溶液で一晩インキュベートします。切片をPBSで毎回10分間3回インキュベートした後、Alexa Fluor 568標識抗ラビッド、Alexa Fluor 488標識抗ヤギ、またはAlexa Fluor 488標識抗ラット二次抗体と室温で1時間インキュベートしました。毎回10分間PBSで3回セクション化されました。続いて、DAPIを含む褪色防止試薬封入剤を使用して、免疫標識脳切片を覆います。切片を風乾させ、摂氏4度で光から保護して保管します。ここに示されているのは、DGにおけるBrdU標識増殖ニューロンの生成におけるHFS治療の実験的パラダイムです。動物は、異なるパターンの刺激を受けるために、急性グループと慢性グループに分けられました。その後、両群の動物に6日目にBrdUを注射しました。8日目に、動物は麻酔をかけられ、クライオスタット切片の準備のために大量に行われました。これは、DGでのHFDBS後のBrdU免疫蛍光染色の画像です。神経細胞産生の定量的解析により、DGの急性刺激は神経新生を増強できないことが示された。一方、DGの慢性的な刺激は、神経新生を大幅に増加させました。対照群と比較して、BrdU標識細胞の数は、同側半球と対側半球の両方で、慢性群で有意に増加しました。これらは、PPサブ領域におけるHFDBS後のBrdU免疫蛍光染色の画像です。ニューロン産生の定量的分析は、PPの急性刺激または慢性刺激のいずれかがニューロン新生を有意に増強できなかったことを示しました。BrdU標識細胞の数は、HFS処理の有無にかかわらず比較的安定していました。この手順を試みるときは、電極を適切に配置し、刺激をうまく送達することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、モデルに登録された神経科学の高周波刺激の分野の研究者への道を開きました。このビデオを見れば、脳深部核に高周波刺激を届ける方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Selvakumar, T., et al., Analysis of gene expression changes in the rat Hippocampus after Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus.J. Vis. Exp.(2015年)このビデオでは、ラットの脳に電極を埋め込んで脳深部刺激 (DBS)...

ラットモデルにおける海馬ニューロン活動に対する脳深部刺激の影響

出典: Zhao, Z. et al.高周波刺激によるマウス歯状回の活性化のための侵襲的方法J. Vis.

マウス歯状回における神経細胞の活性化と神経新生を強化するための高周波刺激

このビデオは、GABA作動性内側中隔ニューロンに光感受性イオンチャネルを持つ遺伝子操作マウスモデルでシータ振動を調節するプロトコルを示しています。このプロトコルは、光パルスを海馬に送達することにより、ニューロンの活動を同期させ、局所的な磁場電位として記録されるシータ振動を生成することを目的としています。...

マウスモデルにおけるシータ振動の選択的操作

このビデオは、マウスの脳の特定の領域で聴覚刺激を処理するニューロン活動の研究を示しています。この手法では、抑制性神経伝達遮断薬を塗布し、薬物を局所的な脳領域に適用する前後で、聴覚刺激に対するニューロンの反応を比較します。...

抑制性神経伝達物質ブロッカーの存在下での覚醒マウスにおける聴覚ニューロン応答の調査

このビデオは、マウスモデルの海馬にワイヤー電極アレイと光ファイバーを定位的に移植する様子を示しています。...

電極アレイと光ファイバーのマウス海馬への埋め込み

神経疾患のトランスジェニックおよびノックアウトマウスモデルは、正常および異常な神経生理学における遺伝子の役割を研究するために有用である。この記事では、長期増強、自由神経病理のマウスモデルを振る舞うトランスジェニックおよびノックアウトで学習と記憶を、根底にある細胞メカニズムを研究するために使用することができる方法を説明します。...

自由に行動するマウスにおける有孔質路 - 歯状回シナプスの長期増強

研究によると、陰極経頭蓋直流刺激は薬剤耐性発作に対する抑制効果を生み出すことができます。本研究では、マウスの脳切片調製において、直流刺激と発作様活動の多電極アレイ記録を評価するin...

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

このプロトコルでは、リニア シリコン プローブ マルチすねローカル...

行動中マウスの海馬における振動を制限空間録音

ここでは、マウスの化学遺伝学を用いて神経活動を慢性的に制御する2つの非侵襲的方法について説明する。点眼剤は、クロザピン-N-酸化物(CNO)を毎日提供するために使用されました。また、飲料水中のCNOの長期投与のための2つの方法についても述べた。慢性神経制御のためのこれらの戦略は、動物のストレスを軽減する最小限の介入を必要とします。...

DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

本報告では,トランスジェニックVGAT-Creマウスの電気キンドリングに基づいて側頭葉てんかんのモデルを生成する方法について述べる.Kindled...

側頭葉てんかんモデル作製のためのVGAT-CREマウスの電気的キンドリング電極の作製と移植

ミリサイズのコイルと組み合わせた低コスト脳波記録システムにより、マウス脳をin vivoで経頭的に刺激する

学ぶ高周波刺激によるマウス海馬歯状回の神経活動と神経新生の評価法。c-fos、Notch1、BrdU染色を用いて分子メカニズムを解析し、脳疾患治療への応用可能性を示す。

高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

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