高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

この実験の全体的な目標は、ニューロン新生におけるニューロン活動に対する高周波刺激の影響を観察することです。この方法は、ニューロン活動の誘導や海馬のニューロン新生など、高周波脳深部刺激療法の整合した細胞および分子メカニズムにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の利点は、高周波TBSが成体脳のニューロン活動と神経新生に及ぼす強力な効果を実証できることです。

この方法は、マウス歯状回に対する高周波TBSの影響についての洞察を提供することができますが、臨床で脳障害の大脳基底核や視床下領域などの他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスを定位フレームに置きます。耳のバンドを頭に合わせ、中央の頭を支えるように優しく締めます。

耳の前方の皮膚をつかみ、頭蓋骨の約1平方センチメートルを取り除きます。次に、頭蓋骨を覆っている筋肉やその他のアタッチメントを綿棒で取り除き、頭蓋骨の表面を露出させます。次に、過酸化水素溶液を塗布して頭蓋骨を乾燥させ、矢状縫合線とラムダ縫合線を特定します。

次に、ブレグマとラムダを特定します。ブレグマ点は、核の位置を設定するための元の点として使用されます。その後、これらの2つのポイントを使用して、頭蓋骨を水平面上で水平にします。

これら2つのポイントの高さが背側腹面でほぼ同じであることを確認してください。さらに、頭蓋骨が内側の外側面で水平になっていることを確認してください。次に、自家製の2チャンネル銅マイクロワイヤー電極を定位手術フレームの回転電極ホルダーに取り付けます。

電極をブレグマの真上に置き、元のサイトとして設定します。次に、電極に触れずに、電極を頭蓋骨の上の正しい位置にゆっくりと動かします。定位手術フレームのデジタルディスプレイを使用して、前方後方、内側外側、および背腹の位置を示します。

電極挿入用の目的の部位が特定されたら、その位置に黒いマーカーで印を付けます。その後、背腹定位調整を使用して電極ホルダーを持ち上げます。次に、ドリルビットを70%エタノールで滅菌します。

ハンドヘルドマイクロマニピュレーターアシストドリルを使用して、マークされた位置に正確にバリ穴を開けます。滅菌綿棒を使用して、手術中の出血を止めます。硬膜が露出するまで穴を開け続けます。

曲がった針を使用して、穴あけ中に発生する骨のスクラップを取り除き、下にある柔らかい脳組織に損傷を与えることなく硬膜にピンホールを作ります。バリ穴が目的の位置に正しく作られていることを確認するために、電極を下げて、障害物に触れることなくバリ穴にスムーズに挿入されることを確認します。抵抗が検出されない場合は、頭蓋骨の表面から目的の深さまで電極をゆっくりと挿入します。

次に、小さなヘラを使用して歯科用セメントを塗布し、電極を所定の位置に保持します。セメントが濃くなったら、挿入された電極と他の骨ネジの周りに成形して、滑らかで滑らかなキャップを形成します。次に、電極を電極ホルダーから外します。

マウスを定位フレームから取り外し、温かいケージに戻します。マウスを自由に動かし、ケージ内で2日間回復させます。刺激を送達するには、埋め込まれた電極をリード線を介してプログラム可能な刺激装置に接続します。

ソフトウェアインターフェースを設定します。次に、HFS パラメーターを 400 ヘルツの 6 パルスの 6 列の 6 列、および刺激強度を 200 ミリアンペアに設定します。設定どおりに希望の期間HFSを配信します。

対照群では、刺激を与えずにマウスに電極を埋め込みます。CFAS染色の場合は、実験マウスを1日2回刺激します。BrdUラベリングでは、急性刺激群と慢性刺激群の両方に適切な刺激を適用します。

刺激の過程で、マウスが起きていることを確認してください。リードがねじれていないことを確認することを忘れないでください。刺激が完了したら、記録システムのコネクタにある電極ホルダーから電極ピンを慎重に外します。

CFASおよびノッチ1染色の場合、最後のHFDBSの約3時間後に、ペントバルビタールを注射してマウスに麻酔をかけ、麻酔の手術面を達成します。BrdU標識では、最後のHFDBS刺激から約12時間後に、対照マウスと刺激マウスに2時間間隔でBrdUを6回注入します。最後の注射から36時間後、マウスにペントバルビタールで深く麻酔をかけ、50ミリリットルの冷たいPBSと続いて50ミリリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドで経心的に大量に投与します。

頭を取り外し、皮膚を切開してスキルを露出させます。鉗子を使用して、頭蓋骨を少し削り取り、脳全体を慎重に取り除きます。その後、脳を4%パラホルムアルデヒドでさらに2日間ポストフィックスし、摂氏4度の30%スクロース溶液に一晩移します。

クライオスタットを使用して、脳を20ミクロンの冠状切片にスライスします。切片をブラシでスライドガラスに移して取り付け、マイナス20°Cで保管します。その後、固定剤を含まない通常のPBSにスライドを移します。

切片をPBSで3〜4回、それぞれ5分間洗浄して、余分な固定剤を取り除きます。BrdU標識基については、切片を2モルHCLで摂氏37度で30分間インキュベートし、0.1モルのホウ酸緩衝液ですすいでください。10分後、切片をPBSで2回、毎回5分間洗浄します。

その後、切片をブロッキング溶液中で室温で1時間インキュベートします。次に、切片を抗CFASポリクローナル抗体、抗ノッチOne抗体、または抗BrdU抗体と混合した切片を、摂氏4度のブロッキング溶液で一晩インキュベートします。切片をPBSで毎回10分間3回インキュベートした後、Alexa Fluor 568標識抗ラビッド、Alexa Fluor 488標識抗ヤギ、またはAlexa Fluor 488標識抗ラット二次抗体と室温で1時間インキュベー

10分間PBSで3回セクション化されました。続いて、DAPIを含む褪色防止試薬封入剤を使用して、免疫標識脳切片を覆います。切片を風乾させ、摂氏4度で光から保護して保管します。

ここに示されているのは、DGにおけるBrdU標識増殖ニューロンの生成におけるHFS治療の実験的パラダイムです。動物は、異なるパターンの刺激を受けるために、急性グループと慢性グループに分けられました。その後、両群の動物に6日目にBrdUを注射しました。8日目に、動物は麻酔をかけられ、クライオスタット切片の準備のために大量に行われました。

これは、DGでのHFDBS後のBrdU免疫蛍光染色の画像です。神経細胞産生の定量的解析により、DGの急性刺激は神経新生を増強できないことが示された。一方、DGの慢性的な刺激は、神経新生を大幅に増加させました。対照群と比較して、BrdU標識細胞の数は、同側半球と対側半球の両方で、慢性群で有意に増加しました。

これらは、PPサブ領域におけるHFDBS後のBrdU免疫蛍光染色の画像です。ニューロン産生の定量的分析は、PPの急性刺激または慢性刺激のいずれかがニューロン新生を有意に増強できなかったことを示しました。BrdU標識細胞の数は、HFS処理の有無にかかわらず比較的安定していました。

この手順を試みるときは、電極を適切に配置し、刺激をうまく送達することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、モデルに登録された神経科学の高周波刺激の分野の研究者への道を開きました。このビデオを見れば、脳深部核に高周波刺激を届ける方法についてよく理解できるはずです。