蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

この方法は、細胞がどのようにDNAを複製し、どのように成長し、どのように分裂するかなど、細菌細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生きた細菌細胞を顕微鏡下で少なくとも24時間監視でき、特別な機器を必要としないことです。この方法は、ミクソコッカス・キサントスの成長と分裂に関する洞察を提供するだけでなく、他の成長の遅い細菌にも容易に適用できます。

まず、抗生物質を添加した1%CTTの500マイクロリットルのM.xanthusコロニーを滅菌チューブに再懸濁し、懸濁液全体を5ミリリットルの1%CTTを含む50ミリリットルの三角フラスコに移します。1グラムのアガロースを80ミリリットルのTPMバッファーおよび20ミリリットルの1%CTT培地と混合することにより、0.2%CTTを含む1%アガロース顕微鏡溶液を調製します。アガロースが溶けるまで溶液を電子レンジで加熱します。

ペトリ皿に約60ミリリットルの溶融アガロースを入れ、室温まで冷まします。アガロースパッドを摂氏32度で少なくとも15分間温めてから使用してください。次に、中央に穴が開いているプラスチックまたは金属のフレームに滅菌ガラスのカバースリップを置き、テープを使用してカバースリップをフレームに固定します。

指数関数的に増殖したM.xanthus細胞を10〜20マイクロリットルをカバーガラスに加えます。蛍光マイクロスフェアを細胞の基準マーカーとして追加するには、TPMバッファーを使用してマイクロスフェアを1:100に希釈します。ビーズ懸濁液をよく振って、細胞に5〜10マイクロリットルを加えます。

あらかじめ温めておいた大きな1%アガロースパッドから、カバースリップとほぼ同じ大きさの小さなパッドを切り取り、セルの上に置きます。次に、パッドの上にカバースリップを置き、蒸発を防ぎ、細胞を湿気の多い環境に維持します。顕微鏡サンプルを摂氏32度で15〜20分間インキュベートし、細胞をアガロースパッドの底に付着させてから、タイムラプス顕微鏡で記録します。

タイムラプス顕微鏡検査を行うには、顕微鏡のスイッチを入れ、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。適切な対物レンズ、適切なミラー、フィルターを選択して、位相コントラスト画像だけでなく、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、または黄色蛍光タンパク質の画像も取得します。高品質の浸漬油を対物レンズと摂氏32度で事前にインキュベートしたサンプルの底に加えます。

穴側を対物レンズに向けて、サンプルの入った金属フレームを顕微鏡ステージに置き、サンプルをステージホルダーにしっかりと固定します。ステージをZ方向に対物レンズに近づけて、細胞に焦点を合わせます。対物レンズとサンプルのオイルが接触したら、ステージをX/Y方向に動かします。

Metamorphソフトウェアに切り替えて、取得ツールを開きます。[設定] ドロップダウン リストで [位相コントラスト] を選択し、[露光時間] を 100 ミリ秒に設定します。「Show Live」をクリックし、「Bring Cell into Focal Plane」をクリックし、複数の単一セルが視野に表示されるまでステージをX/Y方向に移動します。

少なくとも1つの蛍光マイクロスフィアが視野内にあることを確認し、後で取得した画像を位置合わせします。次に、顕微鏡制御ソフトウェアの多次元取得ウィザードを開き、必要に応じて顕微鏡が複数の波長とステージ位置で画像を取得できるようにするタイムラプス実験を設定します。[メイン]タブで、[タイムラプス]と[複数の波長]をアクティブにします。

ウィンドウの左側に追加のタブが表示されます。「保存」タブと「ディレクトリの選択」をクリックして、コンピューターのハードドライブ上の空のフォルダを選択して取得した画像を保存し、「ファイルが存在する場合はベース名を増やす」を有効にして、連続するデータセットが以前のデータセットを上書きしないようにします。実験には、日付と実験のひずみ名またはタイトルを含む名前を付けます。

タイムラプスタブをクリックしてタイムラプスパラメータを調整し、[時間間隔]を20分に設定し、[期間]を24時間に設定します。タイムポイントの数は自動的に変更されます。次に、[波長]タブをクリックします。

各時点で各画像に取得する波長の数を、数値を変更して選択します。[ハードウェアにAF位置を記憶する]を選べば、波長ごとに分けて設定できます。上から [First Wavelength] タブをクリックします。

[イルミネーション] ドロップダウン リストで、[位相コントラスト] を選択します。露出に 100 ミリ秒を選択し、[取得] ドロップダウン リストで [すべてのタイム ポイント] を選択します。ドロップダウンリストで「自動公開」を無効にするには、「しない」を選択し、「オートフォーカス」のドロップダウンリストで「すべての取り込み」を選択します。

次のパラメーターを使用して、先ほど示したように、すべての波長の露出を設定します。次に、複数のステージ位置から画像を取得するには、[メイン]タブで[複数のステージ位置]をアクティブにします。「ステージ」タブをクリックし、「ライブ」ボタンをクリックして視野を確認します。

ROIが視野に入るまで、ステージをX/Y方向に移動します。X 座標と Y 座標を [ステージ] タブで保存するには、プラス記号をクリックします。新しいROIが見つかるまでステージをX/Y方向に再度移動し、プラス記号をクリックして座標を再度保存します。

必要な数のリージョンが保存されるまで続けます。保存された異なるX位置とY位置をクリックして細胞に焦点が合っていることをもう一度確認し、AFCホールドをクリックしてハードウェアオートフォーカスを開始し、実験の過程で保存されたZ位置を一定に保ちます。顕微鏡制御ソフトウェアの多次元取得ウィザードで[取得]をクリックして、タイムラプス記録を開始します。

タイムラプス録画の最初の数時点以降もセルにピントが合っていることを確認して、画像の品質を最大化し、必要に応じてピントを合わせ直します。タイムラプス動画の生成や画像位置合わせを行うには、画像解析・処理ソフトを起動してください。「Review Multi-Dimensional Data」、「Select Base File」、「Select Directory」をクリックして、画像をスタックとして開き、多次元データを含むフォルダを開きます。

データセットを確認し、[表示] をクリックします。データセットは、タイム ポイント 1 から終了まで 1 つの画像として表示されます。スタックを作成するための波長をアクティブにしてから、スタックに含める必要があるすべての画像を選択し、[画像の読み込み]をクリックします。

すべての波長に対してこの手順を繰り返し、完了したスタックを保存します。ドリフトを修正する必要がある画像のスタックをアクティブにします。[アプリ]、[自動整列] を使用して整列ツールを開きます。

画像のソースとして[スタック]をオンにし、参照平面として[最初の平面/タイムポイント]をオンにし、[ソーススタック]ボタンでスタックを選択して[適用]をクリックします。自動整列が完了したら、整列したスタックを保存します。MOVまたはAVI形式でムービーを生成するには、スタック、ムービーの作成からムービーの作成機能を開きます。

「ソーススタック」ボタンでタイムラプス録画を選択し、出力形式、フレームレート、フレーム数を選択して、「保存」をクリックします。この運動性DK1622野生型細胞を用いたタイムラプス実験では、位相差画像を5分ごとに24時間取得しました。予想通り、細胞は運動性であり、主にグループで移動していました。

非運動性Delta-mgIA細胞を用いた位相差生細胞イメージングでは、マイクロコロニー形成中に個々の細胞の増殖と分裂を追跡しました。5分間隔で24時間画像を取得した場合、1セルの解像度で235±50分の分裂間時間を定量化することができました。yfp標識タンパク質を長期間追跡しながら細胞が正常に増殖するかどうかを調べるために、ParB-YFPを発現するM.xanthus細胞を追跡しました。

ParB-YFPは当初、サブポーラ細胞領域に単一のクラスターを形成していました。細胞分裂の直前または直後に、クラスターは複製し、1つのクラスターは古い細胞極に残り、2番目のクラスターは新しい細胞極に移動しました。この実験では、FtsZ-gfpを発現する非運動性細胞は、細胞分裂の位置を決定するミッドセルにFtsZ-gfpが強く蓄積することを示しました。

FtsZ-gfpは、主に長い細胞でミッドセルにクラスターを形成しました。細胞分裂の2時間後、FtsZ-gfpは娘細胞のミッドセルに蓄積しました。一度習得すると、この技術は、Myxococcus xanthusだけでなく、他の成長の遅い細菌に対しても日常的に行うことができます。

細菌に対してこの手順を設定するときは、その細菌の特定の成長要件を満たすように寒天プレート内の増殖培地の組成を調整することが重要です。どのような細菌でも、光毒性を避けるためには、露光時間、光強度、イメージング頻度などの最適なイメージング条件を決定することが重要です。また、蛍光標識タンパク質については、光毒性や光退色を避けるためにイメージング条件を調整する必要があります。