データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため
November 3rd, 2018
MDS の診断は非有益な細胞遺伝学または形態学的条件の不在で難しいです。MFC では、MDS の診断プロセスを改良を助けることができます。臨床練習のために便利になる、MFC 分析が十分な特異性と感度、パラメーターに基づく必要があります、データは異なる事業者間再現する必要があります。
この方法は、骨髄異形成症候群や骨髄細胞系統における成熟異常と共に進化する他の造尿疾患などの骨髄疾患の診断における重要な質問に答える助けとなる。この手法の主な利点は、その分析と解釈における研究者の主観性を低下させる点である。この方法は、骨髄異形成の最も差別的なパラメータを示す洞察を提供することができます。
これは、通常の骨髄細胞集団との差を定量化することができます。手順を実証することは、私たちの研究室の博士研究員であるティファニー・ピコットです。15ミリリットルの円錐管に10ミリリットルの洗浄バッファーを含む10ミリリットルの洗浄バッファーと1本の洗浄バッファーの600マイクロリットルと、洗浄ごとに10ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーを混合することから始めます。
2回目の洗浄後、ペレットを400マイクロリットルの新鮮な洗浄バッファーで再懸濁し、350マイクロリットルの細胞懸濁液を5ミリリットルのポリプロピレンFACSチューブに移し、パネル全体のバックボーン抗体を含む。細胞を十分に混合した後、ピペット等量の細胞抗体溶液を3つの新しいポリプロピレンチューブに入れ、必要に応じて各チューブの最終体積を200マイクロリットルまで新鮮な洗浄バッファーで持ち込みます。次に、目的の細胞表面マーカーに対して適切な量の抗体を混合して添加し、室温で30分間インキュベーションを行い、光から保護する。
インキュベーションの終わりに、混合して2ミリリットルの溶解溶液を加え、室温で10分間インキュベーションし、光から保護します。遠心分離によって細胞を採取し、ペレットを邪魔することなく、各チューブに最後の50マイクロリットルの上澄み物を除いてすべてを捨てます。残りの上清中のペレットを緩やかに混合して再中断し、各サンプルに新鮮な洗浄バッファーを2ミリリットル加えます。
2回目の洗浄後、上清を捨てて、各チューブに約50マイクロリットルの残留体積を残し、ペレットを乱さずに放置する。すぐに分析するために、混合してPBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。フローサイトメーターでサンプルを読み取るために、まずフローサイトメーターソフトウェアで新しい実験を開き、名前、サンプルの種類、日付に従って実験の名前を変更します。
3つのチューブに新しい標本を作成し、実験レイアウトの各チューブで使用する抗体を指定します。サイトメーターの設定を開き、アプリケーション設定を選択して、月次設定で取得した値を適用します。新しいグローバルワークシートを開き、単一細胞を腺球状、単球、爆風、リンパ球の集団に合わせて適切なドットプロットを作成します。
報酬コントロール用の新しいグローバル ワークシートを作成します。次に、各チューブから500,000個のイベントを取得し、中程度の取得率で、その技術的検証後にfcs 3.0ファイルとしてデータをエクスポートする。新しい分析を開始する前に、好中球、単球、有核赤線系分、および分析ファイルを inp 形式で、正常骨髄データを含む cyt ファイルをダウンロードします。
次に、データをデスクトップに保存します。好中球の成熟をデータベースに保存するために、まずInfinicytソフトウェアを開き、次に好中球の成熟データに対応するcytファイルを開きます。APS グラフに成熟経路を描画し、好中球の成熟経路をデータベースに保存します。
解析する必要がある好中球系統成熟の fcs ファイルを開きます。プロファイルタブから好中球成熟 inp ファイルをアップロードします。この系統の分析は3つのステップに分かれています。
CD34陽性、好中球をコミットした爆風の選択から始めます。この目的のために、7つのゲートの交点を使用して、CD34陽性、CD117陽性、HLADR低、CD10陰性、CD13陽性、CD11 b-陰性事象の選択を可能にする。CD117陽性、CD34陰性好中球前駆体の選択で分析を続ける。
より成熟した好中球細胞の選択で分析を続ける。次に、単球系線細胞の解析を示す。APS グラフに成熟経路を描画します。
成熟感を示す矢印が未熟、単球細胞、CD14陰性、IREM2陰性、成熟単球、CD14陽性、IREM2陽性に向かっていることを確認する。単球系の成熟経路をデータベースに保存します。解析する必要がある単球系の成熟のために fcs ファイルを開きます。
単球系分分析のプロファイルをアップロードします。単球系の細胞を同定するために、CD64陽性高、CD117陽性、CD117陰性、HLADR陽性事象の選択を可能にする4つのゲートの交点を使用する。これらのイベントを、人口階層ツリーの単球タブに割り当てます。
NRC データベースに保存する必要がある NRC cyt ファイルを開きます。APS グラフに成熟経路を描画し、核となる赤細胞の成熟経路をデータベースに保存します。解析する必要がある fcs ファイルを開きます。
有核赤細胞の分析のテンプレートをプロファイルからアップロードします。この系統の解析は2つのステップに分かれています。CD34陽性の選択から始まり、エリスロイドは爆発を犯した。
ここでは、7つのゲートの交点を使用して、CD34陽性、CD117陽性、HLADR低、CD105陽性、CD33陽性、CD36陽性、CD71陽性事象の選択を可能にする。これらのイベントを母集団階層の NRC タブに割り当てます。CD34陽性エリスロイドが爆発を確認できないように取り除きます。
より成熟したエリスロイド細胞を同定するには、CD45陰性とCD45陽性低、サイドスキャッタ低、CD36陽性高、CD71陽性高の判別を可能にする4つのゲートの交点を使用する。次に、CD36ハイサイド散乱低血小板を有核赤血球から取り出し、この集団をNRCタブに割り当てる。骨髄区画における骨髄腫成熟を評価するために、評価する必要がある場合から目的の系統に対応するcytファイルを開く。
母集団階層ツリーの中等球のタブに割り当てられたイベントのみを表示します。APSグラフに成熟経路を描画し、正常骨髄で好中球の成熟に対応するデータベースをロードし、データを比較します。データが少なくとも部分的に互換性がある場合、ソフトウェアは正規化された成熟差分図とパラメータバンドを作成して成熟の違いを視覚化します。
骨髄区画における単球成熟を比較するために、単球データベースを含む正常な骨マローからのデータを持つ新しいケースについて、単球系に対応するcytファイルを開く。母集団階層ツリーの単球タブに割り当てられたイベントのみを表示し、APS グラフに成熟経路を描画します。通常の骨マローで単球成熟に対応するデータベースをロードし、データを比較します。
骨髄区画中の有核赤細胞成熟を比較するために、新しい症例に対して、正常な骨髄からのデータをNRCデータベースに含めて、NRCの系統に対応するcytファイルを開く。母集団階層ツリーの NRC タブに割り当てられたイベントのみを表示します。そして、APSグラフに成熟経路を描きます。
正常な骨髄でNRC成熟に対応するデータベースをロードし、データを比較します。次に、新しいファイルとデータベースに含まれるデータの差の有意性を視覚化するために、[正規化された成熟の差] をクリックしてズームします。フロー サイトメトリクス データ分析で階層分類アルゴリズムを使用するメソッドは、セルの母集団の重複にカウントされないため、主観的で本質的に不正確であることを覚えておいてください。
骨髄系正常成熟データベースに対してMDSであると疑われるサイトペニアの新しい症例の評価により、細胞学的または細胞原性異常のない場合であっても、好中球、単球、およびNRC系統の異常発現成熟抗原の同定が可能になる。この手順を試みる間、フローサイトメトリックデータを標準化された方法で取得し、毎月のサイトメーター設定設定、毎日のチェック、使用前に抗体を厳密にピペットにし、染色時間を尊重することを忘れないでください。この手順に従って、コンパスのような別のメソッドを実行して、異なるケースグループを比較し、特定のケースグループの最終的なタイピック刻印など、追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、不確定な可能性のクローン造形の場合、異形成プロセスに確実に関連する最終的なタイプの変化を特定するために、骨髄細胞成熟パターンを探求することに興味を持つ研究者のための道を開いた。健全なドナーからのデータの数を増やしてデータベースを更新すると、分析の堅牢性が向上する可能性があることに注意してください。
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概要
この記事では、骨髄異形成症候群（MDS）の診断プロセスを強化するための多パラメータフローサイトメトリー（MFC）の使用について説明します。臨床応用におけるMFC分析における特異性と感度の重要性を強調します。
主要な研究要素
科学の分野
- 血液学
- 骨髄系疾患
- 診断技術
背景
- MDS診断は形態学的基準なしでは困難です。
- 非情報性の細胞遺伝学が診断プロセスを複雑にします。
- MFCはMDS診断プロセスを改良する可能性があります。
- オペレーター間のデータの再現性が重要です。
研究目的
- 骨髄系疾患の診断におけるMFCの有効性を評価すること。
- 骨髄異形成症の最も判別力のあるパラメータを特定すること。
- 分析と解釈における主観性を減少させること。
使用された方法
- 主要な細胞サンプルを洗浄バッファーと混合すること。
- サンプル準備のための遠心分離の実施。
- 正常な骨髄細胞集団との違いの定量化。
- ポストドクターフェローによる手順の実演。
主な結果
- MFCは骨髄細胞集団の違いに関する洞察を提供します。
- この技術は調査者の主観性を減少させます。
- 判別力のあるパラメータの定量化を可能にします。
- 臨床的有用性のためにデータの再現性が強調されます。
結論
- MFCはMDSの診断精度を向上させることができます。
- 特異性と感度は臨床応用にとって重要です。
- 広範な臨床使用のためにさらなる検証が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
