ショウジョウバエ蛹内炎症性細胞動態の長期的な体内の追跡

この新しい蛹モデルの長期的なイメージングの可能性とショウジョウバエの遺伝的治療性を活用することで、この方法は創傷治癒と自然免疫の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。蛹期は、従来のショウジョウバエの創傷治癒モデルに比べて、ライブイメージングにいくつかの明確な利点があります。例えば、蛹ははるかに長い期間にわたって画像化でき、より多くの組織領域を実験的操作に利用でき、この段階ではより多くの血球が存在します。

さらに、これらの蛹の段階でRNAiを介した遺伝子不活性化の効率が大幅に向上し、多くの遺伝子を組織または時間特異的な方法でノックダウンすることができます。蛹のコレクションを設定するには、20人の処女の女性と20人の男性でバイアルをセットアップします。次に、イメージングセッションの18時間前に、バイアルから少なくとも10個の新しく形成された白い蛹を採取します。

蛹を採取するには、鉗子または細かいペイントブラシを使用して、蛹を内部のバイアル表面から取り除き、新しいフライバイアルの側面に注意深く移します。蛹が所望の時点まで発達した後、スライドガラスに取り付けられた両面粘着テープに移します。次に、明視野解剖顕微鏡で、蛹をケーシングから慎重に取り出します。

蛹の腹側がテープにしっかりとくっつくように蛹を配置します。鉗子を使用して、蛹の最も前部に最初の切開を行います。この領域の蛹のケースが中空で、蛹の組織が存在しないことを確認してください。これは、蛹の発育の初期に蛹がケース内で収縮するためです。

次に、蛹が茶色の不透明な脆いケーシングから完全に解放されるまで、鉗子またはマイクロハサミを使用して、蛹のケースを前方から後方向に慎重に引き裂くか切り開きます。これらの蛹は非常に壊れやすいことに注意してください。今、このステップ中に鉗子とマイクロハサミが蛹の表面を穿刺しないことが重要です。

周囲のケースを取り外すときは、蛹自体に触れないようにしてください。次に、損傷を受けていない蛹をヘプタン接着剤を使用してガラス底の皿に取り付けます。まず、10マイクロリットルのアリコートから準備したヘプタン接着剤のラインを堆積させます。

次に、5秒間乾燥させた後、鉗子を使用して、解剖した蛹を接着剤に慎重に移します。学習の際は、最大5匹の蛹を並べます。経験を積んだことで、さらに多くのことを準備することができます。

鉗子を使用して蛹を転がし、蛹を取り付けて、翼がカバーガラス上で平らになり、翼面の大部分がカバーガラスに直接接触するようにします。最後に、脱水症状を防ぐために、ガラス底皿の側面に蒸留水に浸した吸収性濾紙を追加します。次に、皿を覆い、レーザー誘起創傷手順に進みます。

装着した蛹を、チューナブルレーザーアブレーションシステムを搭載した広視野顕微鏡に移します。適切な色素セルを使用して、パルスUV空冷窒素励起アブレーションレーザーを目的の波長に調整します。最適な創傷のために、パルスの繰り返し率を40ヘルツに設定します。

次に、40倍または63倍の対物レンズと明視野を使用して、顕微鏡のステージコントロールを調整し、最初に負傷する蛹の蛹の翼を特定します。ガラスカバースリップに最も近い蛹の翼上皮の平面に焦点を合わせます。傷つける領域をアブレーションレーザーの既知のターゲット領域に合わせます。

これを行うには、顕微鏡接眼レンズ内の十字線マーカーを利用します。次に、顕微鏡でエネルギー密度減衰器スライドを調整して、レーザーの出力を調整します。クリックストップを利用して、設定を再現可能にします。

今、傷を作るために、手動制御のクイッククリックでアブレーションレーザーを活性化します。次に、アブレーション部位での一時的な気泡の外観を確認しますが、これは傷で正常です。傷がうまくいかない場合は、焦点面を変えてみてください。

あるいは、アッテネータースライドを使用して、目的の創傷サイズが達成されるまでレーザー出力を徐々に増やします。蛹の翼縁を傷つけた後、ガラス底の皿を適切な顕微鏡に素早く移し、タイムラプスイメージングを行います。次に、適切な画像キャプチャソフトウェアを開きます。

ソフトウェアで適切なレーザーをオンにし、その出力とゲイン/オフセットを調整して、ピクセル飽和なしで十分な蛍光信号を取得します。一般に、光退色を最小限に抑えるには、5〜20%の範囲で可能な限り低いレーザー出力が最適です。低倍率で蛹の翼全体に焦点を合わせるか、高倍率で傷口に焦点を合わせて創傷修復を調査します。

修復上皮と炎症性細胞の動員の両方を捕捉するには、まず、コントロールパネルの微調整を使用して顕微鏡をzスタックを記録するように設定します。損傷した上皮から、移動する血球を含む下の細胞外空間までスキャンします。次に、蛹の翼を通してzスライスを3ミクロンごと、またはさらに狭い間隔で記録するようにソフトウェアを設定します。

タイムラプスイメージングの場合は、少なくとも 30 秒ごとに少なくとも 1 時間、z スタックを記録します。イメージング中に光変換プローブを使用して細胞のサブセットを選択的に光変換および標識する場合は、イメージングソフトウェア内で適切なモジュールを開いて光変換を実行し、405ナノメートルレーザーを活性化します。次に、選択ツールを使用してFRAPソフトウェア内で写真変換するセルを選択します。

次に、写真変換の時間経過を 1 つの反復フレームに設定し、405 ナノメートル レーザーを 20% レーザー出力に設定します。次に、[実験の開始]をクリックして写真の変換を実行します。完了したら、FRAPモジュールを終了し、元のイメージング画面に戻ります。

そこでは、レーザーを使用中の蛍光色素に合わせ、タイムラプス記録を使用して光変換された細胞と光変換されていない細胞を画像化します。蛹形成後18時間におけるショウジョウバエの蛹の負傷した翼を、共焦点タイムラプス顕微鏡を用いて画像化した。レーザーによる蛹翅上皮の損傷は、血球と呼ばれるショウジョウバエの自然免疫細胞の創傷部位への急速な移動を刺激しました。

血球は、核マーカーと細胞質または細胞骨格マーカーの両方で標識され、それぞれそれらの形態の追跡と表示を可能にしました。血球核の軌跡を追跡すると、炎症反応の複雑な時空間ダイナミクスが明らかになります。創傷から30分以内に、損傷部位に最も近い位置にある血球が創傷への指向性移動を開始しました。

最終的に、損傷から徐々に離れて位置する血球は、創傷に向かって移動し始めます。光変換蛍光色素Kaedeを利用することにより、これらの遊走性翼血球の亜集団を選択的に標識した。この方法は、最初の創傷に動員された血球が、90分後に生成される第2の創傷に対して一時的に脱感作されることを示すために使用されています。

細胞接着体接合部内のE-カドヘリンをGFPと標識することにより、創傷エッジを容易に識別でき、これにより創傷治癒ダイナミクスの分析が可能になります。ほとんどの傷は、損傷から1時間以内に再上皮化し始めます。傷口は内側に進み、最終的には3時間以内に傷が治癒します。

この技術を習得すると、わずか10分以内に複数の蛹をライブイメージング用に準備できますが、この手順を試行する際には、蛹ケースから解剖すると、ショウジョウバエの蛹は損傷や脱水に対して非常に脆弱であることを覚えておくことが重要です。この技術の開発後、自然免疫分野の研究者が計算生物学者と協力し、より洗練された数学的モデリングを適用して、炎症細胞の動員に関与する創傷誘引シグナルの挙動を調査する道が開かれました。さらに最近では、レーザー誘発性損傷に対する応答を追跡するように代替細胞タイプも標識されており、これにより、脂肪細胞であるショウジョウバエの脂肪体細胞もこのシステム内の創傷に応答することが明らかになりました。