炎症性サイトカインの脳内注射による広範囲にわたる大脳皮質脱髄のラットモデル

この手順の全体的な目標は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に対するサブ臨床免疫を用いたラットモデルにおける両大脳半球の皮質の広範囲な脱髄を生成し、続いて移植されたカテーテルを介してサイトカインの関心脳注射を行うことである。この方法は、多発性硬化症などの脳の炎症性脱髄疾患の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、白い物質のプラグを導くことなく、両方の大脳半球の皮質に炎症誘発灰白質脱髄を生成することができるということです.

この技術の意味は、多発性硬化症の進行型で主に観察される皮質脱髄のメカニズムのより良い理解にまで及ぶ。この手順を開始するには、カテーテルとカテーテルキャップを入口で組み立てます。次に、カテーテルをメスで2ミリメートルの長さに切ります。

次に、電気剃毛を使用して耳の間に麻酔ラットの頭を剃ります。ラットを立体的なフレームに入れ、耳の棒と一口プレートを使用して頭を固定します。頭部が水平であることを確認し、指または鉗子で圧力をかけ、その安定性を確認します。

その後、手術中に角膜の乾燥を防ぐために潤滑点眼薬を塗布し、任意の外科的光暴露を防ぐために不透明な材料で目を覆う。次に、70%エタノールと10%ポビトンヨウ素複合体の塗布を交互に行って、剃毛領域を清掃する。カテーテルを埋め込むには、中線に沿って長さ約2センチの縦切開を行います。

その後、ブルドッグクランプを使用して、皮膚を側面に保持します。綿の先端アプリケーターを使用して血液を除去します。その後、骨膜を取り除き、綿の先端アプリケーターで組織をきれいにし、頭蓋骨を露出させ、約1分間乾燥させます。

次に、解剖学的ランドマーク、ラムダ、ブレグマ、内側縫合糸を特定します。立体性フレームにドリルを取り付けたら、ドリルビットの先端をブレグマに開始点として配置します。ブレグマから後部2ミリメートル、内側縫合糸まで横に2.4ミリメートル移動します。

次に、この位置でカテーテルの直径0.5ミリメートルの穴を開けます。最初の穴から数ミリメートル離れたアンカーねじのために、直径1.3ミリメートルの穴をさらに3つ開きます。滅菌PBSの約1〜2ミリリットルで灌漑によって骨粉塵を除去し、頭蓋骨をきれいにします。

その後、アンカーねじを2~3回完全に締め付けます。頭蓋骨の表面に垂直な最初の穴から2ミリメートルの長さのカテーテルを挿入します。カテーテルを保持しながら、少し歯科用セメントを塗布し、カテーテルを安定させるために歯科硬化光への短時間の露出で重合させます。

次に、カテーテルの周りに多くの歯科用セメントを塗布し、ネジを固定し、歯科用硬化光で歯科用セメントを約15〜30秒間固め、セメントが硬化していることを確認する。移植後、前に縫合を再ソーブル縫合糸で皮膚を閉じ、後部をカテーテルに近づけます。次に、解毒剤混合物を皮下に注入する。

次に、予防的抗生物質治療のための皮下注射により2.5%エンフロフロキサシンを投与する。動物を変性ケージに戻し、低体温症を避けるために赤外線を塗布して1〜3時間観察してください。エンフロキシシン治療を繰り返し、手術の翌日に注射による痛みの軽減のために皮下1ミリグラムでカルプロフェンを投与する。

免疫混合物を調製するには、2つの10ミリリットルの低ロックチップガラス注射器を3ウェイストップコックの短い腕に接続し、3番目の出口を長いアームで閉じます。次に、IFAの1ミリリットルと50マイクログラムのrMOGを一緒にピペットする。そして、滅菌PBSで2ミリリットルの最終体積に混合物を調整します。

希釈したIFAとrMOGの混合物をオープンシリンジに入れ、反対側のピストンの緩い圧力を維持しながらピストンを穏やかに挿入します。ピストンを白く粘性になるまで前後に押し出して、一方のシリンジからもう一方のシリンジに駆動して、接種を乳化させます。次に、3ウェイストップコックのオープンショートアームに1ミリリットルの低ロックシリンジを固定し、接種器でそれを満たします。

すべての接種物を1ミリリットルの注射器に分配し、注射まで氷の上に保管します。続いて、21ゲージ針を用いて一時的なイオブルラン麻酔下の尾部ベースで、IFAとrMOG混合物の200マイクロリットルを皮下に注入する。脳内サイトカイン注射の場合は、コネクタカニューレの長さを2ミリメートルに調整します。

サイトカイン混合物を1ミリリットルシリンジに充填します。次に、コネクタカニューレにシリンジを接続します。次に、カニューレをサイトカイン混合物で満たし、気泡を作り出さないようにします。

次に、プログラム可能なシリンジポンプにシリンジを取り付け、毎分0.2マイクロリットルの速度で注入するようにプログラムします。ポンプを起動し、カニューレの先端に気泡の形成を避けるために動作し続けます。その後、入口でカテーテルキャップを取り外します。

コネクタカニューレをカテーテルに差し込み、ネジで締めます。次いで、ポンプを停止する前に10分間注射を進めます。カテーテルの中にカニューレを20分間放置し、注入されたボリュームが完全に拡散できるようにします。

その後、コネクタカニューレを外し、真空効果を避けるためにゆっくりと取り外します。カテーテルキャップを入口に取り付け直し、ねじ込みます。ケージ内の麻酔から回復する動物を許可します。

皮質脱髄はPLPのための免疫細胞化学によるサイトカイン注入後の異なる時点で評価することができる。図6Aは、移植されたカテーテルを介してのみ無菌PBSを受けたモギー免疫制御動物における15日目の無傷のPLP免疫反応性を示す。サイトカイン注射後1日目には、MOGプライム動物で既に脱髄が検出できた。

しかし、カテーテル化された領域の近くにあるだけである。PLP免疫反応性は、サイトカイン注射後のある日、対側皮質にそのまま残る。3日目には、イプシラテラ皮質に広がるPLP免疫反応性の喪失が徐々に増加することが観察された。

3日目には対側皮質脱髄も検出できますが、アンカースクリューの下の領域に制限されています。日9〜15の間に、脱髄は両方の半球の皮質の大部分に影響を与える。皮質脱髄は、部分的な髄鞘のみの両方の半球のサイトカイン注射後最大30日間持続する。

図6Jは、脳内サイトカイン注射後の皮質灰質におけるPLP損失の定量を示す。このビデオを見た後、ミエリンタンパク質に対する過臨床免疫を使用して灰色物質の脱髄を生成する方法をよく理解し、続いて移植されたカテーテルを介してサイトカインの脳内注射を行う必要があります。この動物モデルは、多発性硬化症の進行型の研究で研究者を助けることができる,層灰色物質脱髄は全体のマークである。

埋め込まれたカテーテルは、注射誘発外傷を引き起こすことなく、前臨床試験を受けている潜在的な治療薬の脱髄または脳間送達の複数のラウンドを可能にする。