線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

この方法は、in vivoでのα-シヌクレインの凝集拡大と毒性のメカニズムの解明など、α-シヌクレイン分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、時間のかかるα-シヌクレイン予備形成フィブリルの精製を必要としないことです。この手順を実演するのは、COLAラボの大学院生であるLucia Rotaです。

手順を開始するには、均質化バッファーを調製し、氷上に保ちます。次に、テフロン乳棒ホモジナイザーを使用して、10〜15ストロークの1〜10容量の氷冷ホモジナイザーで新鮮組織または凍結組織をホモジナイズします。その後、初期ホモジネートのすべてをマイクロ遠心チューブに移し、1, 000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、得られたペレット中の核と壊れていない細胞を除去します。

その後、結果のペレットを廃棄します。次に、上清を清潔な微量遠心チューブに移し、冷蔵遠心分離機を使用して摂氏4度で20分間Gの10,000倍で遠心分離し、第2の上清とペレットを得る。次に、この上清をポリカーボネートボトルに移し、超遠心分離機と固定角ローターを使用して、摂氏4度で1時間Gの100,000倍で遠心分離します。

P100原油ペレットを500マイクロリットルの均質化緩衝液で再懸濁します。P100粗ペレットを清潔な微量遠心チューブに移し、冷蔵遠心分離機で摂氏4度で20分間Gの10,000倍で遠心分離します。20分後、上清を捨て、100マイクロリットルの均質化緩衝液でP100を再懸濁します。

次に、サンプルを氷上で2秒間超音波処理し、摂氏マイナス80度で保存します。ウェスタンブロットを行うには、垂直電気泳動装置上に4〜20%トリス-グリシンポリアクリルアミドゲルのグラジエントをキャストします。1マイクログラムのミクロソーム関連α-シヌクレイン画分を変性サンプルバッファーに溶解し、ゲルにロードします。

別のウェルに、5マイクロリットルのタンパク質標準マーカーをロードします。タンパク質マーカーがゲルの末端に達するまで、トリスグリシンSDSランニングバッファーでゲルを100ボルトで泳がせます。次に、塩基性炭酸塩バッファーを使用してタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移します。

サンプルは、200ミリアンペアに設定された一定の電力で冷蔵室に一晩保管します。翌日、5%脱脂粉乳を含むPBS-Tでメンブレンをオービタルシェーカーで室温で30分間ブロックします。その後、PBS-Tでメンブレンを短時間すすぎます。

1 から 5, 000 で SIN-1 とメンブレンをインキュベートするか、または 1 から 5, 000 で P-Ser129 α-synuclein 抗体を PBS-T の 2.5% 無脂粉乳で一晩、寒冷室または冷蔵庫で 4 °C のオービタルシェーカーでインキュベートします。翌日、オービタルシェーカーでPBS-Tを使用してメンブレンを室温で10分間洗浄します。膜を抗マウスまたは抗ウサギHRP標識二次抗体と1〜3,000で、PBS-T中の2.5%無脂粉乳中で、オービタルシェーカーで室温で1時間インキュベートします。

その後、オービタルシェーカーでPBS-Tを使用して室温で10分間3回メンブレンを洗浄します。通常の化学発光キットでシグナルを取得します。ニューロンを治療するには、3つの異なる疾患トランスジェニックマウスの脊髄から得られたミクロソーム関連α-シヌクレイン凝集体を引っ張り、元の均質化バッファーで希釈した1マイクログラム/マイクロリットルの溶液を用意します。

次に、培地の3分の1を取り除き、新しいニューロン培地と穏やかに交換します。プールされたミクロソーム関連α-s凝集体を1マイクログラム細胞培地に加えます。インキュベーター内のニューロンを摂氏37度に戻します。

3日に1回、1週間に1回、培地を交換することなく、新鮮な培地の3分の1をサンプルに加えます。1週間の治療後、培地の3分の1を取り除き、2%B27、10マイクログラム/ミリリットルのゲンタマイシン、および2ミリモルのグルタミンを含む新しい培地と穏やかに交換します。.細胞を固定する前に、1週間にわたって3日ごとに繰り返します。

免疫蛍光法を行うには、化学ドラフト内で、ニューロンを2%パラホルムアルデヒドとPBSで5%スクロース溶液に15分間、振とうせずに室温で固定します。15分後、固定液を取り出し、ニューロンをPBSで3回短時間洗浄します。次に、PBS中の0.3%の非イオン性サーファクチンでニューロンを室温で5分間透過処理します。

次に、ニューロンをPBSで3回簡単に洗浄します。ニューロンを3%FBSおよびPBSと室温で30分間、眼窩シェーカー上でインキュベートし、非特異的な結合部位をブロックします。その後、3%FBSおよびPBSに溶解した適切な一次抗体とニューロンを、オービタルシェーカーで4°Cの冷蔵室または冷蔵庫で一晩インキュベートします。

翌日、抗体溶液を取り出し、PBSで細胞を短時間3回洗浄します。次に、3%FBSおよびPBSに溶解した適切な蛍光二次抗体とニューロンを、室温の暗所で1時間、オービタルシェーカー上でインキュベートします。抗体溶液を取り出し、PBSで3回短時間洗浄します。

次に、眼窩シェーカー上の室温でDAPI溶液でニューロンを室温で15分間染色します。15分後、抗体溶液を取り出し、PBSで3回短時間洗浄します。カバースリップは、フェード防止封入剤を使用してスライドに取り付けます。

この研究では、罹患したA53Tトランスジェニックマウスのプールされたミクロソーム関連α-シヌクレイン凝集体を皮質ニューロンまたは海馬ニューロンの培養培地に1マイクログラム投与すると、凝集体特異的α-シヌクレイン抗体に陽性のα-シヌクレイン封入体の時間依存的な形成が誘導されます。2日間の処理後、これらの凝集体は小さな散在する点状に現れ、後の時点でより豊富になります。2週間後、α-シヌクレイン封入体は、神経突起パターンに従って神経細胞培養全体に大きく広がり、シナプス前および神経突起マーカーと部分的に共局在する長く成熟したビーズ状構造に似ています。

この手順を試みる際には、ミクロソーム関連α-シヌクレイン凝集体のマイクログラムの比率を播種されたニューロンの密度に調整し、α-シヌクレイン封入体が豊富な組織からミクロソーム関連α-シヌクレイン凝集体を単離することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、罹患したトランスジェニックマウスのミクロソーム関連α-シヌクレイン凝集体を精製し、初代ニューロンの治療薬としてα-シヌクレイン封入体の形成を誘導する方法を十分に理解できるはずです。