Name: 癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: 学ぶH-Ras誘導老化におけるWI-38線維芽細胞の活性酸素種とSASP因子IL-6・IL-8の定量測定法。フローサイトメトリーとELISAを用いた高感度プロトコルで、細胞老化のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は (若い淵金) に韓国の国立研究財団 (2015R1D1A1A01060839) からの助成金によって、韓国政府 (MSIT) によって資金を供給された国立研究財団の韓国 (NRF) の助成金によって支えられた (いいえ 2016R1A2B2008887 号2016R1A5A2007009) (に Jeanho ゆん)。

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
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<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
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ここでは、我々 は H Ras 誘導する老化は WI 38 正常ひと線維芽細胞の中に細胞内 ROS レベルを監視する方法を提案しました。生細胞における細胞内 ROS レベル DCF DA の細胞膜透過性の試薬を用いて測定することができ、フローサイトメトリーします。細胞内取り込みに DCF DA 細胞内エステラーゼによってされたきちん、その後、高い蛍光 2', 7'-ジクロルフルオレッセン (DCF) を形成する活性酸素による酸化。FL1 検出器 (蛍光グリーン) を用いたフローサイトメトリーによる DCF 蛍光を検出できます。DCF DA 染色法を使用して、正常を検出した増加 ROS レベル WI 38 正常ひと線維芽細胞の細胞老化の H Ras 誘導中。このメソッドは、ROS レベルの変更を監視する細胞老化の様々 なモデルで使用できます。DCF DA ROS 誘導を測定するために使用されている染色、その他の方法ほか、酸化傷害タンパク質23と共焦点顕微鏡による活性酸素依存性蛍光染料24のレベルを監視します。したがって、さらに追加のメソッドを使...

50 年以上も前、ヘイフリック、ムーアヘッドは、正常な細胞が細胞分裂1数後の増殖能の枯渇に不可逆的な増殖停止を入力することを明らかにしました。この現象は、複製老化として今知られているし、個体老化2と強く相関すると考えられています。DNA の損傷、発癌活性化、酸化ストレスなど、さまざまな細胞のストレスを別の種類の細胞の老化を誘導するために報告されているテロメアの進歩的な侵食は複製老化の主な原因と考えられるが、「老化」や「ストレス老化」と呼ばれます。興味深いことに、時期尚早の老化は、H-ras など BRAF 遺伝子の活性化に強力な腫瘍抑制の役割を果たしています。マウス モデルと人間の組織の研究は細胞老化バイオ マーカーは前癌病変、発癌の Ras および BRAF がアクティブになりますがから開発された悪性の癌では減少した主に存在した強力な証拠を作り出した。これら病変3,4,の5。その高齢化と腫瘍抑制における役割を超えて細胞の老化は、創傷治癒、組織修復、免疫監視および萌芽期の開発6などを含む様々 な生理的プロセスで役割を果たす以前の研究で示されています。
増殖停止は、細胞の老化が7の特徴として広く研究されているが証拠の重要なボディは、その細胞内の活性酸素種 (ROS) は、細胞の老化の8にも貢献して示唆しています。ROS レベルの標高複製老化遺伝子が誘導する老化 (OIS) など、細胞の老化の様々 なタイプの中にもともと数十年前は報告された9,10。もっと直接、H2O2の致死線量と外因性治療は老化11,12誘導します。SOD1 などの活性酸素消去酵素の阻害は早期老化13も発生します。対照的に、周囲の酸素条件を低いし、ROS 清掃遅延老化10,14,15の発症の増加します。これらの結果は間違いなく ROS が重要なメディエーターまたは細胞の老化誘導の決定要因であることを示します。ただし、ROS は細胞の老化や細胞の老化中 ROS レベルを昇格する方法の誘導に貢献方法必要さらに調査。
最近の研究では、老化細胞が隣接細胞や SASP16,17を通じて組織の強力なパラクリン活動あるが明らかにしました。高齢者組織老化細胞組織の加齢に伴う機能障害を介して増殖細胞の自律的枯渇に加えて多くの経路 SASP を通じて推進します。様々 な炎症性要因、組織アーキテクチャの破壊組織恒常性が損なわれ、組織の加齢に伴う機能障害を引き起こす IL-8、TGFβ、およびマトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)、老化の細胞によって分泌されるが IL-6 など隣接するセル、および無菌性炎症18,19の老化。しかし、SASPs は、生物学的文脈によって有益な効果を持つことができます。さらに、SASPs の担体の性質は、老化細胞型と19のさらなる研究の必要性を強調し、細胞の段階に依存します。
ここでは、OIS の中に細胞内 ROS レベルを評価するため迅速・高感度のフローサイトメトリーを用いた手法について述べる。さらに、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) や ELISA を用いた SASP 因子の分析方法を紹介しています。

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>ターボフェクト</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル &β;D-ガラクトピラノシド(X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>フェロシアン化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>フェリシアン化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV 逆転写酵素</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>超高純度蒸留水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-6 ELISAアッセイ</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-8 ELISAアッセイ</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;mシリンジフィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16555パラ</td><td></td></tr><tr><td>フィルム</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度計</td><td></td><td>BioDrop 80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISAリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>EMax マイクロプレートリーダー</td><td></td></tr></tbody></table>

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

細胞の老化は、増殖能力や様々 なストレスへの暴露の枯渇に不可逆的な増殖停止の状態を考えられています。最近の研究では、開発、創傷治癒、免疫監視、加齢に伴う組織の機能不全など、様々 な生理的過程に細胞の老化の役割を拡張しています。細胞周期の停止は、細胞の老化の重要な特徴は、増加の細胞内活性酸素種 (ROS) 生産は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすことも実証されています。さらに、最近の研究では、老化細胞が隣接細胞と老化関連の分泌形質 (SASP) を通じて組織に強力な傍分泌活動を示すこと明らかにしました。細胞の老化に対する治療戦略に関する関心の急激な増加は、細胞内 ROS および、SASP など老化メカニズムの正確な理解の必要性を強調しています。ここでは、活性酸素感受性蛍光色素とフローサイトメトリーを使用して H Ras 誘導性細胞老化にともなう細胞内 ROS レベルを定量的に評価するためのプロトコルについて述べる。さらに、mRNA の発現の誘導と SASP 因子の分泌の解析のための高感度技術を紹介します。これらのプロトコルは、さまざまな細胞の老化モデルに適用できます。

H Ras 誘導する老化の例は、図 1に示します。WI 38 H RasV12 レトロ ウイルスの培養細胞への感染には、劇的な形態学的変化 (図 1 b) が誘導されます。さらに、図 1のように、SA β gal 染色活動著しく H RasV12 式に増加しました。細胞の 70% 以上を示した SA β gal H RasV12 レトロ ウイルス感染後 6 d の活動を染色、私たちや他のグループを以前報告した21 H RasV12 の式が正常に WI 38 細胞で細胞老化を誘導することを示す、22。
図 2</str...

細胞内 ROS は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすに示されています。ここでは、細胞の老化にともなう ROS レベルを定量化するための敏感な試金について述べる。伝えられる様々 な加齢に伴う機能不全に貢献する老化関連分泌形質を評価するためのプロトコルをいたします。

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

この手順の全体的な目標は、細胞老化中の細胞内ROSレベルと老化関連分泌表現型(SASP)を監視するための高感度技術を提供することです。ここでは、これらの方法が、WI-38正常なヒト線維芽細胞におけるH-Ras誘発老化中の細胞内ROSおよびSASP因子IL-6およびIL-8のレベルの増加を成功裏に明らかにすることを示しています。これらの技術により、細胞老化中の細胞内ROSレベルの変化をモニタリングし、SASP因子の発現を解析することができます。この方法の主な利点は、多くの異なる細胞老化モデルに適用できることです。したがって、この方法は、最終的には、細胞老化におけるROSとSASPの役割を理解し、その根底にある調節メカニズムを研究するのに役立ちます。その手順を実演するのは、私の研究室のYoung Yeon KimさんとJee-Hyun Umさんです。この手順は、H-Rasレトロウイルスを準備することから始めます。まず、ポリ-L-リジンでコーティングした培養皿にエコトロピックBOSC細胞を播種し、組織培養インキュベーターで摂氏37度で1日培養します。翌日、BOSC細胞にH-RasレトロウイルスDNAをトランスフェクションし、トランスフェクション試薬を用いてDNAをパッケージングします。トランスフェクションを8時間行った後、トランスフェクション培地を取り出し、8ミリリットルの新鮮な培地を加えます。48時間後にウイルス粒子を含む培地を回収し、遠心分離により細胞の破片を除去します。次に、0.45μmのシリンジフィルターでウイルス含有培地をろ過します。H-Rasレトロウイルスの収穫前日にWI-38細胞を60mm培養皿にプレートし、インキュベーターで摂氏37度で1日培養します。翌日、増殖培地を取り出し、1ミリリットルのH-Rasウイルス培地を追加します。さらに、2マイクロリットルのポリブレンストック溶液を含む1ミリリットルの成長培地を追加し、CO2インキュベーターで1日間インキュベートします。感染後24時間でウイルス培地を取り出し、PBSで細胞を2回洗浄し、増殖培地を添加します。非感染細胞を除去するには、ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムで細胞を2日間処理します。ストック溶液を希釈して、新鮮なSAベータガロン染色溶液を調製します。培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。ホルムアルデヒドを含む固定液を加え、5分間インキュベートします。固定液を細胞から取り出し、PBSで洗浄します。作りたてのSAベータガル染色溶液を皿に覆います。サンプルが乾燥しないように皿をParafilmで密封し、CO2を含まないインキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。SA β-gal陽性細胞は、核周囲領域で青色に見えます。SA β-gal染色の画像をCCDカメラで取得し、少なくとも全200個の細胞のうちSA β-gal陽性細胞の数をカウントして、SA β-gal染色細胞の割合を計算します。60mm培養皿に5番目のWI-38細胞を10回2回プレートし、前述のように細胞にH-Rasレトロウイルスを感染させることにより老化を誘導する。ROSの測定に必要な時点で、増殖培地を取り出し、PBSで一度洗浄します。トリプシン/EDTA溶液で処理して細胞を剥離し、細胞数を決定します。5番目の細胞に1×10を15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離により細胞を回収します。増殖培地を慎重に取り出し、新たに調製したDCF-DA染色培地1ミリリットルを加えます。細胞ペレットを慎重に再懸濁し、暗所で摂氏37度で30分間インキュベートします。遠心分離により細胞を採取し、PBSで一度洗浄します。細胞を1ミリリットルのPBSで再懸濁し、サンプルをFACSチューブに移します。DCF-DA蛍光シグナルは、488ナノメートルの青色レーザーを搭載したフローサイトメーターで測定できます。まず、未染色のコントロール細胞サンプルを泳動します。前方散乱光と側方散乱光のドットプロットで、生細胞を選択し、ゲーティングツールを使用して死んだ細胞と細胞の破片を排除します。次に、DCF-DA蛍光シグナルを表示するヒストグラムで、青色レーザー電圧を調整して、コントロールセルからのピークを左端に配置します。次に、DCF-DAで染色した各サンプルを実行し、少なくとも10, 000のイベントを記録します。前述のように細胞にH-Rasレトロウイルスを感染させることにより老化を誘導します。収穫の1日前に、PBSで細胞を2回洗浄します。FBSを含まないDMEMを3ミリリットル加え、組織培養インキュベーターで37°Cで1日培養します。24時間後、コンディショニングされた培地を回収し、その後のELISAのために摂氏マイナス80度で保管します。細胞をトリプシン化し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内で遠心分離により細胞を回収します。従来のRNA抽出法を用いてtotal RNAを調製し、逆転写反応により2μgのtotal RNAからcDNAを作製します。リアルタイムPCRでは、IL-6またはIL-8のフォワードプライマーとリバースプライマーを含むすべての反応に対して、SYBR Green PCR Master Mixを調製します。アクチンプライマーを含む各サンプルの反応混合物を内部コントロールとして調製します。48マイクロリットルのマスターミックスと、1〜3に希釈した2マイクロリットルのcDNA産物を96ウェル光学qPCRプレートの各ウェルに加えます。各反応を三回に分けて行います。サーマルサイクラーでリアルタイムPCR反応プログラムを設定し、リアルタイムPCRを実行します。ランが完了したら、閾値サイクル値(CT値)を収集し、アクチンレベルに標準化した後のIL-6またはIL-8のmRNAレベルを計算します。老化WI-38細胞から以前に採取したコンディショニング培地を解凍します。細胞破片を500 gで5分間遠心分離して除去します。細孔径3, 000ダルトンの遠心フィルターを使用して、馴化培地を10倍に濃縮します。適切なIL-6またはIL-8 ELISAキットを使用してELISAを実行します。まず、ELISAプレートを室温で一晩インキュベートすることにより、希釈したIL-6またはIL-8抗体でELISAプレートをよくコーティングします。各ウェルを4回洗浄した後、各ウェルにブロッキングバッファーを添加し、1時間インキュベートします。プレートを4回洗います。段階希釈したELISA標準試料または濃縮馴化培地サンプルを添加し、2時間インキュベートします。プレートを洗浄した後、サンプルを二次抗体とストレプトアビジン-HRPコンジュゲートで順次インキュベートします。各ウェルに100マイクロリットルのTMB基質溶液を加え、室温で20分間インキュベートして発色させます。停止溶液を追加して反応を停止します。各ウェルの吸光度をELISAリーダーで450ナノメートルで読み取ります。生成された標準の標準曲線をプロットします。標準曲線に従って、馴化培地中のIL-6およびIL-8の濃度を計算します。正規化後の結果をセル数にプロットします。WI-38正常ヒト線維芽細胞のH-Rasレトロウイルスへの感染は、細胞形態の劇的な変化を引き起こしました。SAβ-gal染色活性は70%以上の細胞で観察され、H-Rasの発現がWI-38細胞において6日以内に細胞老化を誘導することを示しています。DCF-DA染色解析により、H-Rasの発現も細胞内ROSレベルの有意な増加を誘導することが明らかになりました。細胞内ROSレベルの上昇は、H-Ras発現の2日後という早い時期に観察され、6日間の時点まで維持されます。代表的な老化関連分泌因子IL-6およびIL-8のリアルタイムPCR解析により、老化WI-38細胞ではIL-6およびIL-8のmRNA発現が著しく増加していることが明らかになりました。馴化培地のELISAにより、H-Ras誘導老化細胞ではIL-6およびIL-8の分泌も増加することが確認されました。がん遺伝子の発現、DNA損傷、または酸化ストレスによる細胞老化の誘導には、通常6〜8日かかります。セルの準備ができたら、適切に実行すれば2時間以内にROS測定を行うことができます。これらの技術を習得すれば、SASP因子のmRNAおよびタンパク質レベルの分析を1日以内に完了することができます。ROSレベルとSASP誘導を解析する際には、SAベータガル染色による細胞老化の確認や、必要に応じて追加の方法が重要です。さらに、ROSの増加は老化の初期段階で発生するのに対し、SASPの発症は老化が完全に確立された後にのみ検出できることを覚えておくことが重要です。これらの技術は、さまざまな細胞老化モデルに適用できます。このビデオを見れば、細胞老化中のROSレベルとSASP誘導の分析方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。...

老化がん細胞を定量化するための感度の高い方法

細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。...

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ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

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セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。...

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

このプロトコルは、パルスSILACによる老化細胞および非分裂細胞の代謝標識、非標的質量分析分析、およびタンパク質半減期の合理化された計算のためのワークフローを記述します。...

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。...

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。...

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

本プロトコルは、ヒト脂肪組織から分離された間質血管画分における老化関連ベータガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性を客観的に単細胞検出するために、反射光共焦点顕微鏡法を提示します。この方法は免疫細胞化学と互換性があり、定量評価のためのpHコントロールを組み込み、さらに従来のSA-β-gal染色よりも感度が高く主観的でない代替手段を提供します。...

脂肪間隙血管分数における反射光を用いた老化検出

本記事では、IMR-90ヒト線維芽細胞における老化期のリソソーム再構築を測定するための生細胞LysoTrackerプロトコルを紹介します。...

ヒト線維芽細胞における細胞老化の定量的評価のためのLysoTrackerを用いたリソソームプロファイリング

この方法は、老化した皮膚線維芽細胞が健康な皮膚にどのように影響を与えるかを研究します。老化はUVB曝露によって誘発され、調整培地を正常な線維芽細胞に適用します。この方法は、皮膚の老化における細胞間コミュニケーションの変化を標的とした生物活性化合物の評価に役立ちます。...

老化細胞の調整培地を用いたin vitro モデルにおける健康な細胞間コミュニケーション回復のための抗酸化剤の新規結合

学ぶH-Ras誘導老化におけるWI-38線維芽細胞の活性酸素種とSASP因子IL-6・IL-8の定量測定法。フローサイトメトリーとELISAを用いた高感度プロトコルで、細胞老化のメカニズム解明に貢献します。

癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定

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