3 次元 (3 D)-高スループット ゼブラフィッシュ胚配列複写のためテンプレートを印刷
2018年6月1日
ここでは、設計し、高スループット ゼブラフィッシュ胚配列 96 ウェル プレートにそのようなテンプレートの利用に関する詳細な手順が続くテンプレートを配列複写するゼブラフィッシュ胚を作製するためのプロトコルを提案する.
この方法により、ゼブラフィッシュの胚アレイ化手順を大幅にスピードアップし、ゼブラフィッシュをハイスループットスクリーニングに真に適したものにすることができます。この技術の主な利点は、3Dプリントされたテンプレートを使用してゼブラフィッシュの胚を96または384ウェルマトリックスにプレアレイ化できることで、これにより非常に効率的なプレート調製プロセスが容易になります。最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、モジュールプレートの各ウェルに個々の胚を手動で選択してナノ粒子のスクリーニングを行い、効率を高めたいと考えていました。
Tianyuに加えて、大学院生のYue Jiangが手順を実演します。この手順は、標準の96ウェルプレートに適合する12 x 8の96ウェルレイアウトのアレイテンプレートの設計から開始します。テキストプロトコルで詳しく説明されているように。
0.1ミリメートルの精度の3Dプリンターを使用して、テンプレートを印刷します。テンプレートの主要なコンポーネントには、エントラップメントチャンバー、エントラップメントウェル、真空チャンバー、およびエアインアウトレットがあります。ゼブラフィッシュの胚の産卵を行うには、まず透明なプラスチック製の仕切りでオスとメスを分離します。
次に、産卵の1日前に、交尾ボックスごとにオスとメスの魚の2組を配置します。産卵日は、朝から仕切りを外してオスとメスの魚を混ぜます。オスとメスの魚を取り除き、細かいメッシュのストレーナーを使用してゼブラフィッシュの胚を収集します。
胚を250ミリリットルの卵水で洗います。収集した胚をホルトフレッター溶液でシャーレに移します。死んだ胚と未受精の胚を実体顕微鏡で取り除きます。
胚を摂氏28.5度のインキュベーターに入れます。受精後4時間で、胚を観察し、死んだ胚や不健康な胚を取り除きます。これで、胚は次のステップに進む準備が整いました。
テンプレートを500ミリリットルの脱イオン水で2〜3回洗ってから、乾燥オーブンに5分間入れます。次に、底部チャンバーをピースシールフィルムでテープで固定します。テンプレートの下部にある排気口から真空ポンプを接続して、シーリングフィルムでシールされたチャンバー内に負圧を発生させます。
プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、約150個の胚をテンプレートに入れます。各ウェルに1つの胚が閉じ込められるまで、テンプレート全体を水平に振ってください。このステップでは、利用可能なすべてのゼブラフィッシュの胚をチェックして確認することが重要です。
Holtfreter バッファーが非常に少ない場合は、テンプレートを振ってバッファーを追加できます。余分なホルトフレッター溶液とウェルに閉じ込められていない胚を捨てます。真空ポンプの電源を切り、外します。
標準の96ウェルプレートをテンプレートに対して逆さまに置き、両方を同時に回転させます。テンプレートの底をタップするか、空気出口を圧縮ガスダスティング缶に接続して、閉じ込められたすべての胚をテンプレートから96ウェルプレートに移します。最後に、シーリングフィルムをはがし、テンプレートを500ミリリットルの脱イオン水で上から下に3回洗浄します。
ここに示されているのは、テンプレートによって配列された96ウェルプレートの部分的な画像です。逆に、この画像は、手動で配列された96ウェルプレートの部分的な画像を示しています。手動およびアレイテンプレート法でプレーティングされた後の胚の全体的な健康状態がここに表示されます。
胚の孵化率、生存率、および奇形率に基づくと、いずれの場合も胚の全体的な健康状態に対する有意な影響は観察されませんでした。この手法を習得すると、適切に実行すれば、わずか2〜3分で1つの96ウェルプレートまたは384ウェルプレートを準備できます。開発後、この技術は、研究者がこのモデル生物の新機能を最大限に活用し、真にin vitroハイスループットスクリーニングを達成するための道を開きました。
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概要
この記事では、ゼブラフィッシュの胚の配列テンプレートを設計し製造するためのプロトコルを提示し、96ウェルプレートへの高スループットの配列を可能にします。この方法は、ゼブラフィッシュの胚の配列手順の効率を大幅に向上させます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 高スループットスクリーニング
背景
- ゼブラフィッシュは、その透明な胚のために生物学研究で広く使用されています。
- 効率的な胚の配列は、高スループットスクリーニングアプリケーションにとって重要です。
- 従来の方法は手動での選択を含み、時間がかかる可能性があります。
- 3Dプリントされたテンプレートの導入は、効率を向上させるための新しい解決策を提供します。
研究の目的
- 高スループットのゼブラフィッシュ胚配列のためのプロトコルを開発する。
- 効率的な胚配置のために3Dプリントされたテンプレートを活用する。
- ナノ粒子テストを含む様々な応用のためのスクリーニングプロセスを向上させる。
使用された方法
- 12 by 8のレイアウトを持つ3Dプリントされた配列テンプレートの設計。
- 96または384ウェルのマトリックスへのゼブラフィッシュ胚の事前配列。
- 大学院生による手順の実演。
- 実施のための詳細なテキストプロトコル。
主要な結果
- 3Dプリントされたテンプレートにより、胚の迅速かつ効率的な配列が可能になります。
- 手動の方法と比較して大幅な時間節約。
- 高スループットスクリーニング機能を促進します。
- 実験用プレートの準備における効果が実証されています。
結論
- 開発されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の配列の効率を向上させます。
- 3Dプリントされたテンプレートの活用は主要なイノベーションです。
- この方法は、高スループットスクリーニングを実施する研究者にとって有益です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High throughput zebrafish embryo arraying is a critical bottleneck in phenotypic screening and early-stage compound evaluation. The introduction of a 3D-printed template with vacuum manipulation enables rapid, reproducible preparation of multi-well plates, directly supporting scalable screening workflows. This innovation enhances operational efficiency and supports portfolio-wide compound triage in discovery-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates preparation of zebrafish embryos for hypothesis-driven compound testing.
- Enables robust phenotypic screening by standardizing embryo placement across wells.
- Supports functional target validation by facilitating high-content, parallelized assays.
Screening & Assay Development
- Delivers rapid, reproducible arraying of embryos for multi-well plate-based screening.
- Improves assay throughput and consistency, reducing manual variability.
- Enables efficient scaling to 96- and 384-well formats for compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Supports disease-relevant phenotypic assays in zebrafish embryos for translational insights.
- Facilitates continuity from early discovery to preclinical model validation.
- Reduces operational barriers to implementing high-throughput in vivo screening platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D-printed template method integrates at the interface of early discovery and screening, enabling seamless transition from embryo collection to high-throughput phenotypic assays.
- Discovery Biology: Streamlines hypothesis testing by enabling rapid setup of parallel experimental conditions.
- Screening: Provides standardized, reproducible embryo arraying for quantitative screening outputs.
- Analytics: Supports consistent measurement of phenotypic endpoints across large sample sets.
- Translational Research: Bridges early discovery and preclinical validation by enabling scalable in vivo assays.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for repeated high-throughput screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological variability in screening assays.
- Operational Value: Standardizes embryo arraying, enabling reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, high-throughput phenotypic data generation.
Implementation Considerations
- Requires access to precision 3D printing and basic vacuum instrumentation.
- Demands operator proficiency in embryo handling and template operation.
- Standardization of washing and transfer steps is critical for reproducibility.
- Adaptable to both 96- and 384-well plate formats for diverse screening needs.
- Template cleaning and maintenance are essential for sustained performance.
