拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価のためマウス尾先端採血を頻繁に
2018年7月4日
ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。
頻繁な尾端採血の全体的な目標は、覚醒していない麻酔をかけられた正常な行動マウスのLHと呼ばれる拍動性黄体形成ホルモン分泌を測定するための全血サンプルを取得することです。この方法は、マウスの黄体形成ホルモンの拍動分泌を評価するための信頼性の高いプロトコルを提供することにより、再現性のある神経内分泌学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、頻繁な取り扱いと慣れにより、急性または慢性の実験的治療後の堅牢で信頼性の高い黄体形成ホルモンの脈拍測定が保証されることです。
採血前の5週間は、月曜日から金曜日まで毎日マウスを取り扱います。最後の2週間は、土曜日と日曜日にもマウスを扱います。マウスの取り扱いは、バイオセーフティキャビネットで行ってください。
最初のマウスをケージから取り出し、キャビネット内の適切な面に置きます。この表面でマウスをそっと拘束するには、マウスの尾の付け根を持ちます。次に、もう一方の手で尾の腹面を基部から先端までしっかりとなでます。
これを合計6回行い、マウスをケージに戻します。これにより、1つのハンドリングセットが構成されます。次に、6 分間待ってから、別のハンドリング セットを実行します。
このパターンをインターセット間隔で続行し、ハンドリング・セッションごとに 4 つのハンドリング・セットを実行します。これにより、セッションごとに合計24回のテールストロークが得られます。サンプリング期間中の実験的治療に、スクラーフや腹腔内注射などの追加の取り扱い方法が含まれる場合は、取り扱いセッション中にマウスをそのような取り扱い活動に順応させます。
予定採血日の2週間前に、マウスをペアで飼育して、サンプリング期間中のマウスの混乱を最小限に抑えます。採血のために、血液保存用の0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブを準備します。チューブにラベルを付け、3マイクロリットルの血液採取の場合は、57マイクロリットルのACESバッファーを各チューブに分注します。
準備ができたら、チューブを摂氏4度で保管します。バイオセーフティキャビネットには、ピペットチップ、ゴミ箱、タイマー、実験用ログ、採血チューブが入った氷のバケツ、鋭利な滅菌ハサミ、油性マーカー、小さなガーゼなどのアイテムが用意されています。採血を開始する45分前に、最初のマウスをケージから取り出し、適切な表面に置きます。
次に、テールに印を付けて、ケージパートナーからこのマウスをすばやく識別します。次に、はさみを使用して、尾の先端の1〜2ミリメートルを取り除きます。その尾をクリップした後、先端に血滴が形成されるまで尾を慎重に撫でます。
次に、3マイクロリットルの血液を採取し、血液と先端の両方をゴミ箱に捨てます。次に、血流が止まったことを確認します。必要に応じて、滅菌ガーゼで穏やかな圧力をかけます。
その後、マウスをケージに6分間戻します。次に、45分から6分間隔で、尾をしっかりと撫でて、マウスから追加の血液サンプルを採取します。血滴が形成されない場合は、生理食塩水に浸したガーゼパッドで尾を軽くたたき、血栓を解消します。
事前サンプリング期間中は、すべての血液アリコートを廃棄します。45分後、サンプリング期間を開始します。サンプルを採取するときは、3マイクロリットルの血液を採取チューブに移し、チューブを反転して混合し、氷の上に戻します。
次に、必要なだけサンプリングを続行します。マウスを安楽死させるか、尾の血流が完全に停止したことを確認してから、マウスに清潔なケージを提供します。次に、血液サンプルをストレージボックスに移し、サンプルを分析できるようになるまで摂氏マイナス20度で保存します。
黄体形成ホルモンまたはLHは、急性の心理社会的ストレスの課題に対する反応を決定するために、頻繁な血液サンプルで測定されました。成体雌のC57黒色6匹のマウスを卵巣摘出し、血液サンプルを90分間採取して、LH拍動性分泌の治療前ベースラインを確立しました。ストレス治療のために、90分間のサンプリングでは、実験動物をげっ歯類の拘束装置に入れ、新しいケージに移しましたが、コントロールは自宅のケージに残し、拘束されていません。
分析の結果、対照動物は、サンプリング期間全体を通じて明確な明確なLHパルスを持っていたことが示されました。対照的に、拘束の心理社会的ストレスは、実験群の拍動性LH分泌を迅速かつ明確に抑制しました。この手法を使用する準備をする際には、マウスにストレスを与え、拍動性LH分泌を中断する可能性のある他の研究者による騒音や中断などの環境障害を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。
Stein博士とChen研究室の他の人々によって開発されて以来、この技術は、神経内分泌学の分野の研究者が、複雑な分子および遺伝学的ツールが実用的で利用可能な種におけるLHパルス制御を探求するための道を開き始めています。
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概要
本研究では、拘束しないマウスから血液サンプルを採取するための尾端採血プロトコルについて説明し、特に拍動性黄体形成ホルモン（LH）分泌の測定に焦点を当てます。この手法は、LHの拍動性分泌を信頼性高く評価できるように設計されており、生殖神経内分泌学の研究に寄与するものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経内分泌学
- 生殖生物学
- 動物行動学
背景
- 黄体形成ホルモンの拍動性分泌は、生殖生理学において極めて重要である。
- ホルモンの変動を正確に測定するためには、信頼性の高い採血技術が不可欠である。
- 既存の手法では、動物のストレスによる影響を十分に考慮できていない可能性がある。
- 本プロトコルは、採血中のマウスのストレスを最小限に抑えることを目的とする。
研究目的
- 拘束していないマウスにおいて、信頼性の高い尾端採血プロトコルを開発すること。
- 急性および慢性の処置に対するLHの脈管状分泌を評価すること。
- 神経内分泌学的な研究手法の精度を向上させること。
使用した手法
- 本プロトコルでは、採血前にマウスの日常的なハンドリングと馴化を行います。
- 成体雌性C57BL/6マウスを使用し、LH測定のために尾端から採血を行いました。
- 頻繁にハンドリングを行うことで、ストレスのない環境を構築しやすくなります。
- ホルモンのベースラインを確立するため、設定された期間にわたって血液サンプルを回収しました。
主要な結果
- この手法により、対照群の動物におけるLHレベルの収集に成功した。
- 拘束による心理社会的ストレスは、実験群においてLH分泌を有意に抑制した。
- ストレスによって拍動性LH分泌の信頼できる測定が最小限に抑えられたことは、本手法の有効性を裏付けている。
- 環境的な乱れがホルモン測定に影響を及ぼすことが判明した。
結論
- 本研究では、マウスにおいて正確なホルモン測定を行うための新しい手法を確立します。
- このプロトコルにより、神経内分泌学研究においてLH調節を効果的に探索することが可能になります。
- ストレスがホルモン分泌に与える影響を理解することは、生殖生理学および動物行動学へのより広範な知見に寄与します。
よくある質問
産業上の重要性
マウスの尾端から頻回に採血を行うことで、拍動性黄体形成ホルモン（LH）分泌の高解像度な評価が可能となり、神経内分泌ターゲットの検証における重要な課題を解決します。このアプローチは、ホルモン駆動経路の解析における予測の信頼性を高め、堅牢で定量的な内分泌リードアウトを提供することで、初期段階のポートフォリオ決定に寄与します。自由行動下のマウスにおいて動的なホルモンパターンを捕捉できる本手法は、創薬探索から前臨床研究へのトランスレーショナルな連続性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 拍動性LH分泌の直接測定により、神経内分泌シグナル伝達経路の解析が可能になります。
- 生理的なホルモン変動とストレス誘発性の変動を区別することで、生物学的なリスク低減を支援します。
- 生殖および神経内分泌研究プログラムに対し、機能的なターゲットバリデーションデータを提供します。
- ホルモン調節のメカニズム研究における予測の信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの内分泌学および神経生物学アッセイに供するための、検証済み動物モデルを調製する。
- アッセイ開発に適した、標準化され、再現性のある定量的なホルモン測定値を提供する。
- ホルモン分泌動態に影響を及ぼす実験的介入のスクリーニングを可能にする。
- in vivoにおける化合物または遺伝的摂動の信頼性の高い評価を支援する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 内分泌調節不全およびストレス応答を研究するための疾患関連モデルと整合します。
- 発見段階の知見から、ホルモン調節介入の前臨床検証までの連続性を確保します。
- パイプラインにおける神経内分泌ターゲットを前進させるための、リスク調整済みデータを提供します。
- トランスレーショナルバイオマーカー開発に向けた、予測的なリスク低減を強化します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、生存動物モデルにおける動的なホルモン測定を可能にすることで、基礎研究から前臨床試験までの連続的なプロセスへと組み込まれ、メカニズム研究とトランスレーショナルリサーチの両方を支援します。
- 発見生物学：神経内分泌系における仮説検証とパスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング：アッセイの準備状況および介入スクリーニングのための、再現性のある定量的なLH測定値を提供します。
- 分析：実験条件の統計的比較を支持する、時間分解能の高いホルモンデータを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：発見段階の知見を、内分泌機能およびストレス応答の前臨床モデルへと橋渡しします。
- 組織的な再利用：複数の研究プログラムにわたって、動的なホルモン評価に使用可能な再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 神経内分泌ターゲットのバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値： ホルモンサンプリングを標準化し、研究間での再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値： 堅牢で定量的な内分泌データを提供することにより、意思決定（go/no-go判断）および資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： ホルモン調節ターゲットおよび介入策について、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 動物のハンドリングおよび神経内分泌サンプリングプロトコルの専門知識が必要です。
- 高感度ホルモンアッセイおよび適切な分析インフラへのアクセスが必要です。
- 環境およびハンドリングによるストレスを最小限に抑えるため、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- さまざまなマウスモデルに適応可能ですが、系統やエンドポイントによってプロトコルの最適化が必要な場合があります。
- 実用上の制限として、データの整合性を確保するための十分な馴化期間と慎重な環境制御が必要です。
