Name: ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶビーズ無料光ピンセットを用いたショウジョウバエ胚の細胞力学測定法。ライトシート顕微鏡と組み合わせた最小侵襲的アプローチにより、生体内での組織硬さと張力をリアルタイムに定量化できます。

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<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li>
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光ピンセットは、非侵襲的な方法で発展途上の胚上皮に直接絶対機械計測を実行する許可します。その意味で、それは、侵襲的と磁気力と、注射を必要とする、相対的な測定を提供するまたは強い仮定に依存する推論の力、また相対提供、レーザーアブレーションなど他の方法上の利点を提示します。測定。
プロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれています。まず、対物レンズは、色収差とレーザー トラップが「下流」オブジェクトをプッシュ表示可能性があります、重要な IR レーザー トラップ画像平面のビーズのことを確認して (ステップ 2.18) で最終的に正しいです。第二に、メソッドは、細胞の接触の位置の測定に依存しています。つまり、コントラストの高い蛍光マーカーを使用することが重要。
対物レンズとレーザ光の品質は、有効なトラップに重要です。対物レンズの開口数は 1.0 を超える必要があります。トラップは効果がない場合は、レーザー光が対物レンズの背面の開口部を埋めることを確認します。
本手法は、いくつ...

萌芽期の開発は、その中に細胞や組織を将来の動物の形に変形再現性の高いプロセスです。このような変形は、セル レベル1,2では、軍のアクティブな世代を必要とする示されています。地形形成過程中に細胞や組織は、その形状を変更して、それしたがってキー関係の細胞の力学特性を評価するために、プロセス3,4の間に組織内で力を測定するには.擬 2次元のジオメトリと簡単操作に、ショウジョウバエ、特に上皮の層は広く研究されています。
テクニックの数は、われわれや他の開発中に体内の上皮の力学評価このように開発されています。我々 は上皮組織で使用される 3 つの主要な技術の概要を与えます。セル接合5,6,7,8または9,スケール大きい10,11 のローカルの機械的ストレスを明らかにすることにより、レーザー焼灼、広く使用されている方法ターゲットの力学的整合性を混乱させる地方のカットを実行することによって。カットの次拡大のダイナミクスは、ストレス前アブレーションと組織12,13のレオロジーの両方の情報を提供します。レーザーアブレーションの欠点は、ことだが、侵襲的な細胞の皮質のローカルの中断を必要とです。したがって、試練の限られた数は、1 つは組織の整合性を保持したい場合 1 つのみ実行できます。別の欠点は、開離速度は、一般的に知られていない粘性摩擦に依存なので試練だけ細胞の接触の張力の相対的な見積もりを提供です。磁気操作はまた開発し、ショウジョウバエ、磁性14の使用または ultramagnetic リポソーム15のいずれかを含むで使用されます。彼らは絶対測定16,17を提供することができますが、目的の位置にプローブの注入を要求することの意味で侵襲も。これは常に正確な注射に従順ではないシステムによって非常に難しいことができます。3 番目の手法は、完全に非侵襲的は力の推定18,19,20です。力の推論はトリプル ポイント (tricellular 接合または頂点) で力学的平衡の仮定に依存していると推論する緊張まったく細胞連絡先 (おそらく、すべての細胞圧力) によって逆問題を解くことができます。緊張、各頂点には、2 つの方程式 (X と Y) が用意されています。これにより、大規模な連立一次方程式をすべての細胞の接触の張力を評価するためにいくつかの条件の下で反転することができます。それだけ分割イメージがない余分な実験やセットアップを必要と、この方法は非常に魅力的で、その精度は調べるには、まだ、再び絶対校正測定が行われていない限り、それはのみ相対値を提供します。
これらの制限の一部を克服するために紹介するこの記事の光ピンセットのセットアップキイロショウジョウバエの胚上皮細胞のスケールで制御された力を適用する光シート顕微鏡と結合しました。光ピンセットは、単一蛋白質および細胞内小器官や細胞の21の操作で測定を含む多数の生物学的応用のために使用されています。ここで、報告は小さい少数のダース pN の範囲で応用力まだ細胞の接触のローカル変形を誘発して体内の機械計測を実行するのに十分な。通常、力を変形に関連するのに細胞の接触、kymographs の分析を通して監視の垂直偏向を使用します。重要なは、我々 のセットアップには、光ピンセットは直接細胞間の接触に力を発揮することができる、組織内の目的の場所でビーズの注入は不要です。光シート顕微鏡光学ピンセットのカップリングの照明は非常に減らされた毒性との短い時間スケールで、機械的分析のためかなり高速イメージング (フレーム数/秒) を実行することができます、サンプル画像22の平面に制限されます。
全体的にみて、光ピンセットは、ショウジョウバエ胚の in vivo 細胞の接触力制御を適用して剛性と携帯連絡先23、張力レオロジー特性などの機械情報を抽出する非侵襲的な方法24、グラデーションや異方性張力23。

<table><tbody><tr><td>イッテルビウムファイバーレーザーLP、10 W、CW</td><td>IPG</td><td>レーザーYLM-10-LP-SC</td><td>コリメータLPを含む:ビームD = 1.6 mmおよび赤色ガイドレーザー</td></tr><tr><td>&Oslash;1/2インチ光学ビームシャッター</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>小ビーム径検流計システム</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>X 変位用 1、Y 変位用</td></tr><tr><td>1D または 2D ガルボ システム リニア電源</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>検流計 電源</td></tr><tr><td>2 レンズ f = 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>リレー望遠鏡 2 ガルバ</td></tr><tr><td>レンズ f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X望遠鏡</td></tr><tr><td>レンズf = 500 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X望遠鏡</td></tr><tr><td>直角運動学楕円ミラーマウント、タップ付きケージロッド穴</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td><td>ペリスコープ</td></tr><tr><td>レーザー安全メガネ、ライトグリーンレンズ、59%可視光透過率、ユニバーサルスタイル</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg;AOI、直径50.0 mm、ホットミラー</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>多光子エミッタ HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>CompactDAQシャーシ</td><td>National</td><td>Instruments cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>Cシリーズ電圧出力モジュール</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263</td><td>アナログ出力モジュール</td></tr><tr><td>Cシリーズ電圧入力モジュール</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>アナログ入力モジュール</td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 & micro;m、赤色蛍光灯(580/605)、固形分2%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td><td>キャリブレーションビーズ</td></tr><tr><td>C++(Qt)自家製光ピンセット Olivier</td><td></td><td></td><td>BlancとClaire Chardが開発した</td></tr></tbody></table>ソフトウェア。

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

形態形成には、遺伝的パターン形成と細胞や組織をしっかり形に機械力間の調整が必要です。したがって、地形形成過程を理解するための課題は、胚発生の間に細胞の力と体内の力学的性質を直接測定するためです。ショウジョウバエの初期胚の細胞間の接触の力を直接適用することができます、光シート顕微鏡と結合した光ピンセットのセットアップを提案するここでは、いくつかのフレーム/秒の速度でイメージングしながら。この手法には、胚は、通常の光学力が行使が中間のプローブとして使用ビーズの注入を必要としない利点があります。我々 は、ステップバイ ステップのセットアップの実装の詳細し、実験から力学的情報を抽出するためのツールを提案します。細胞細胞の接触リアルタイムの変位を監視することによって張力測定を実行、細胞の接触のレオロジーを調査できます。

図 5は、トラップに正弦波の動きを課すことによって得られた実験データを示しています。トラップには、3 連続インターフェイス位置 (図 5 a)23を表示 3 のスナップショットが例示として、インタ フェースのたわみが生成されます。録画したムービーは kymograph (図 5 b) の生成に使用され、さらに分析され、サブピクセルの解像度, ガウス分布を使用してインターフェイスの位置がフレームごとに x 方向に合わせて決定します。小さい変形の政権でトラップとインターフェイスの位置に比例している (図 5)。トラップ (図 5) の相対的なインタ フェースのたわみの振幅は、界面張力や剛性にアクセス (手順 7.1 を参照)。...

光シート顕微鏡とショウジョウバエの胚でビーズなし細胞力学をプローブへの実装に結合光ピンセットのセットアップを紹介します。

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

この方法は、細胞細胞接触の特性が組織形態形成中の空間および時間でどのように変化するかを含む組織力学の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、弱侵襲性であり、軽シート顕微鏡などのライブイメージングと互換性があることです。この技術は、組織にビーズの注入を必要としません。通常、フラスを得るためにデミエールプローブとして使用され、私は興奮しています。このプロセスを実証するには、エンジニアのシャルデスと、私のレベルの地形の研究科学者ラファエル・クレメントです。まず、水平平野に光シート顕微鏡用の直立顕微鏡を設置し、光学ピンセットとして機能するようにレーザーと光学を準備します。次に、500ナノメートルの蛍光ビーズを1マイクロリットルのガラスキュベットにパイプアウトし、10ミリリットルの蒸留水を加えます。キュベットを目的のキュベットホルダーに置き、目的が水面に触れるように目的の焦点を調整します。次に、取得ソフトウェアの制御に使用する統合開発環境 QT Creator を開きます。マイクロRheoを開いて取得ソフトウェアを開きます。ライブを選択して、ライブ取得モードをオンにします。レーザーのスイッチを入れる前に、安全ゴーグルを置き、レーザーパワーを1ワットに調整し、レーザーのスイッチを入れます。ライブフィードは、レーザーの焦点に閉じ込められたビーズを表示する必要があります。必要に応じて、第2の望遠鏡レンズの位置を調整し、ビーズが焦点を合わせて観察する。また、画像内のビードを中央に配置するために、ペリスコープの操縦角度を調整する必要がある場合もあります。付属のテキストプロトコルの図3に示すように、データ取得ボードと縁石接続を準備します。光シャッターインターフェイスで、時間オープンsecパラメータを000.000、000.000に終了時間秒パラメータ、モードパラメータをシングルに、トリガパラメータをEXTに調整します。設定したら、[有効] ボタンを選択します。QTクリエイターで、オットを開きます。をクリックしてプロジェクトを開きます。aogenerator での入出力の名前を変更します。cpp ファイルは、セットアップで使用された MI カードと一致します。最後に、光ピンセットソフトウェアをコンパイルして実行します。取得ソフトウェアでは、目的の露光時間、ゲーム、2つの画像間の時間、取得する画像の数、およびレーザーのパワーを選択します。次に、光ピンセットソフトウェアで、ここで示す光ピンセットパラメータを設定し、円をトレースする。次に、AIパラメータボックス、ウェイトフォワードボックスをチェックし、レコード押しボタンを押して、画像取得を開始します。光ピンセットのスイッチを入れ、生成ボタンを選択し、トラップされたビーズが少なくとも2つの完全な円を完了できるようにし、生成

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

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原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

このプロトコルの目的は、 ショウジョウバエ 幼虫の機械的発性の改善アッセイを実行する方法を示すものです。ここでは、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

アクトミオシンの収縮性は、細胞および組織の形態形成において重要な役割を果たす。しかし、 生体内で アクトミオシンの収縮性を鋭く操作することは困難である。このプロトコルは、 ショウジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性を迅速に阻害する光遺伝学的システムを記述し、 in...

ショウ ジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性の光遺伝学的阻害と上皮圧の測定

これらのプロトコルは、制御および変異型ショウジョウバエ胚上皮におけるプリーツ状隔断接合部の組織および閉塞機能を特徴づける方法を示しています。...

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学ぶビーズ無料光ピンセットを用いたショウジョウバエ胚の細胞力学測定法。ライトシート顕微鏡と組み合わせた最小侵襲的アプローチにより、生体内での組織硬さと張力をリアルタイムに定量化できます。

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