Name: 膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ中性子小角散乱法による膜タンパク質の溶液中構造解析。デューテリウム標識と洗剤コントラストマッチングでタンパク質信号を強調し、オリゴマー状態や低分解能構造を決定する手法を解説します。

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構造分子生物学 (CSMB) とバイオのオークリッジ国立研究所のセンターで研究をサポート オフィスの生物と環境の研究-科学的なユーザー施設課の基本的なエネルギー科学のオフィス、米国部門でサポートされている機能を使用して SANエネルギー。リーバーマン ラボでの膜タンパク質の構造的な仕事は、NIH (DK091357、GM095638) によってサポートされている、NSF (0845445)。

フォルカー s. 都市、サイ ヴェンカテシュ Pingali、ケビン ・ l ・ ワイス、C. ライアンオリバー著者が中性子科学ユーザー プログラムとバイオ サポートする米国 DOE と UT バテルを通じて契約されています-オークリッジ国立研究所のこの記事で使用される楽器の SANS。
この原稿がされてポーセリンペインティングの UT-バテル、LLC は、デ-AC05-00OR22725 米国エネルギー省 (DOE) との契約の下。米国政府を保持し、パブリッシャー、パブリケーションのアーティクルを受け入れることで米国政府が発行またはこの原稿の発行済みのフォームを再現したりする非独占的、払込、取消不能、世界的なライセンスを保持することを認める他の人は、米国政府の目的のために。DOE は、DOE のパブリック アクセスの計画に従って連邦政府委託研究のこれらの結果へのパブリック アクセスを提供します。 82

構造生物学研究では、溶液散乱溶液中生体分子から (全体のサイズや形) など生化学的および構造の詳細を取得するような相補的な構造技術を活用します。SAN は、膜蛋白質の低分解能構造、現代構造生物学と生化学のコア焦点を決定するための特に魅力的な手法です。SAN に匹敵する結晶構造試験 (1 mg/サンプル) の浄化された蛋白質の量が必要です。高純度重水素化洗剤膜タンパク質研究に関連する、最近拡大の商業的利用にアクセス可能なこの水素/重水素実験膜蛋白質界面活性剤複合体のサンセリフのコンテンツを操作するための手段蛋白質信号を直接記録することができます。成功した場合、わずか数時間にわたって収集されたデータから経験的モデル分子エンベロープを計算できます。したがって、膜蛋白質の生化学者、とらわれる、および構造生物学者容易に活用できます SAN ソリューションの膜蛋白質、パートナーまたは基板、および得られたモデルを結合との複合体構造の切望された最初の 3 D モデルを取得するのSAN では、回折データを段階的に使用できます。膜蛋白質を特徴付けるための SAN のルーチン使用膜タンパク質の生化学分野の変革と創薬と開発に基本的な構造機能か...

膜タンパク質は、すべての遺伝子1の推定 30% がエンコードされ、現代の医薬品のターゲットの大多数を表します。2これらの蛋白質は、彼らの豊かさと重要性にもかかわらず重要な細胞機能を3の広い配列を行うなど、研究利用に供構造バイオインフォマティクス (RCSB) 蛋白質のための総構造の約 1% にすぎませんデータ ・ バンク。4彼らの部分的に疎水性性質のため膜結合蛋白質の構造決定が極めて挑戦でされています。5,6,7
生物物理技法の多くは、測定溶液中における同一径粒子を必要と、ネイティブ膜から膜タンパク質を分離し、生体膜の可溶性模倣これらのタンパク質の安定化は最近の研究の活発な領域をされています。数十年。8,9,これらの調査は、nanodiscs11,12,13膜,14,15 等の膜タンパク質の可溶化多くの新規両親媒性アセンブリの開発につながっている10と amphipols。16,17ただし、洗剤のミセルの使用特定の蛋白質の容解性の要件を満たすための最も一般的で簡単な方法の 1 つは。18,19,20,21,22,23,24,25残念ながら、単一の洗剤や洗剤の魔法混合現在存在満たすすべての膜蛋白質。したがって、これらの条件は経験的蛋白質ごとの固有の要件にスクリーニングする必要があります。26,27
洗剤は、ミセルと呼ばれる集合構造を形成するソリューション、臨界ミセル濃度以上で自己組み立てます。ミセルは、疎水性のアルキル鎖ミセル コアおよび水溶媒に直面してミセル シェル層に配置される親水性のヘッド グループを形成 (通常は 20 から 200 まで) 多くの洗剤モノマーの構成されます。洗剤のミセル形成挙動は古典的な疎水性効果、28およびサイズでチャールズ タンフォードによって記述され、膜タンパク質研究で一般的に使用される洗剤のミセルの形状をしています。小角散乱法を用いた特徴付けられます。29,30洗剤組織膜タンパク質についても研究されていると、きちんと洗剤のような配置でタンパク質を取り巻く洗剤の分子蛋白質界面活性剤複合体 (Pdc) の形成を期待ミセル。31
1 つは、洗剤を使用する利点は他の洗剤を組み込むことによって生じるミセル プロパティを操作できることを追加しました。多くの洗剤を示す理想的な混合と混合ミセルの選択プロパティはコンポーネントとの混合比率からも予想されます。22ただし、洗剤の存在できますまだ課題が生物物理特性の信号全体に貢献することであります。たとえば、x 線と光散乱技術、PDC の洗剤からの信号はタンパク質と実質的に区別できます。32単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 調査は通常トラップ (冷凍) 粒子に依存してください。蛋白質の構造の詳細は、特定の洗剤や洗剤を背景に追加する高濃度によってまだ隠されています。33 (洗剤を含む) 完全な PDC 構造の解釈への別のアプローチは、指定された膜タンパク質の周り洗剤を再構築しようとする計算方法で行われています。34
中性子散乱の場合は、洗剤のミセルでコア-シェル アレンジ観測散乱に寄与するフォーム ファクターが生成されます。幸いなことに、彼らは net の観測された散乱に寄与しないことなどは、ソリューション コンポーネントを変更できます。この「コントラスト マッチング」のプロセスと一致する (バッファー) の背景の散乱長密度を達成するために水素の重水素を置き換えることによって達成されます。(利用できる重水素化対応) と洗剤の賢明な選択と混合の比率を考慮しなければなりません。洗剤のミセル、洗剤を用いた重水素置換アルキル鎖 (d-尾 h 尾ではなく) を持っているが、同じヘッド グループこの置換を実行できます。洗剤は十分に混合されたので、35の集計でお越しの加重モル分率は、散乱長密度 (h 尾と尾 d) の 2 つのコンポーネントの平均。この平均コントラストが頭のグループの一貫性のある、均一の凝集構造と観測された散乱へのすべてを削除する完全に照合できます。
重水素標識アルキル鎖と化学的に同一の洗剤の分子を組み込むことによって洗剤のミセルの中性子コントラストを操作するためのプロトコルをご紹介します。19,36,37ミセル コアとシェルは、中性子散乱のユニークな機能は、一致する完全な対比ができます。35,38により大幅に洗練されたこの詳細レベルには、コントラストのマッチングを実現できます膜蛋白質の構造のそれ以外の場合不可能研究。さらに、このコントラスト マッチング方法は高分子交換反応39と油水分散剤、40または膜、41なども他の可溶化剤などの洗剤を含む他のシステムに拡張することnanodiscs、42またはブロック共重合体。この原稿が、アルキル鎖および/または頭の部分重水素置換の単一洗剤種を用いたアウトラインとして43 A 同様のアプローチは最近出版されました。置換および 2 段階用の洗剤の利用できる位置の限られた数、ここで紹介した方法と比較して37これが水素と重水素洗剤中のランダムな分布の改善に期待できます。合成洗剤は、ポーズの追加の課題を検討に必要な。
多くの場合下記のプロトコルの手順 1 と 2 が重なる品質提案を提出する最初の実験計画を行う必要がありますので。ただし、提案書の提出であるここでは中性子実験の前にこのプロセスを開始することを強調する最初のステップとして。また、提案によって示される必要があります、前提条件の手順が生化学的および物理的な特性 (安定性、純度など) 中性子研究の必要性をサポートするサンプルを持つことをする必要があります。小角中性子散乱 (SAN) の一般的な議論はこの記事の範囲を超えています。簡単なしかし徹底的な導入はカウフマン、44と包括的な教科書に焦点を当てた生物小角ソリューション散乱による材料特性評価を公開されている最近の参照作業で利用可能です。45さらにおすすめの読書は、ディスカッション セクションで与えられます。小角散乱は、散乱過程を説明する中央の量として、いわゆる散乱ベクトル Q を使用します。この資料を使用して、広く受け入れられている定義 Q = 4 π 罪 (θ)/θ が受信および散乱ビームと λ の半分の角度、λ は、オングストロームの中性子放射の波長。使用別のなどの記号、その他の定義が存在する ' の散乱ベクトルは要因 2 π かナノメートル オングストロームの代わりを使用して異なる場合があります (図 10の議論を参照してください)。

<table><tbody><tr><td>アミコンウルトラMWCO 50KDa濃縮器&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>labware</td></tr> ク<tr><td>エン酸アンモニウム二塩基</td><td>性 Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>中成分</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>中成分</td></tr><tr><td>Bioflo 310 バイオリアクターシステム</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td>機器</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>アクロス</td><td></td><td>423525000 中成分</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>IBI サイエンティフィック</td><td>IB02025</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>EMD ミリポア</td><td>3130</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>塩化コバルト (II) ア</td><td>クロス</td><td>AC21413-0050</td><td>中成分</td></tr><tr><td>硫酸銅 (II)</td><td>アクロス</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>ミディアムコンポーネント</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>中成分</td></tr><tr><td>ドリエライト ガス清浄器</td><td>W.A. ハモンド ドリエライト (株)</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム、二水和物</td><td>EMDミリポア</td><td>4010</td><td>中型成分</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>機器</td></tr><tr><td>&Auml;kta 清浄機 UPC100</td><td>GEヘルスケア&nbsp;</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>中成分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>イミダゾール</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>テクノバ</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄(III) 六水和物</td><td>MP 生化学品</td><td>ICN19404590</td><td>中成分</td></tr><tr><td>LB 寒天ミラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>中成分</td></tr><tr><td>硫酸マンガン(II) 一水和物</td><td>アクロス</td><td>AC20590-5000</td><td>中成分</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 インキュベート/冷蔵シェーカー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>備品</td></tr><tr><td>n-ドデシル-d25-&β;-D-マルトピラノシド</td><td>アナトレース</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-ドデシル-&β;-D-マルトピラノシド</td><td>アナトレース</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>中型成分</td></tr><tr><td>RC 6 プラス 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>機器</td></tr><tr><td>SIGMAFAST プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠、EDTAフリー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>中型成分</td></tr><tr><td>滅菌 25mm シリンジフィルター 0.2&micro;m PESの膜</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>のlabware</td></tr>の<tr><td>0.2&microが付いている生殖不能の使い捨て可能なびんの上のフィルター;m PESメンブレン</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>実験器具</td></tr><tr><td>スーパーデックス 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GEヘルスケア&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>Superose-12 10/300 GLコラム&nbsp;</td><td>GEヘルスケア&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Ultrospec 10 細胞密度計</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>機器</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛一水和物</td><td>アクロス</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>ミディアムコンポーネント</td></tr></tbody></table>

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

高流束同位体リアクターのオークリッジ国立研究所で生物学的中性子小角散乱装置、生体材料ナノからをカバー、バイオ燃料の処理、生物学的材料の調査に捧げられてマイクロメータ スケール。膜タンパク質の物性 (すなわちサイズと形状) を調査するためにここで提示されたメソッド (ここで MmIAP、 Methanoculleus marisnigriから膜アスパルチル プロテアーゼ) ミセル形成のソリューションで洗剤とりわけこの中性子小角散乱装置に適しています。他の生物物理学的解析技術がタンパク質洗剤複雑な構造で洗剤の貢献に対処する彼らの無力によって妨げられます。さらに、バイオ重水素化研究室へのアクセスは、大規模な耕作を準備し、タンパク質強化による散乱信号の重水素標識蛋白質を表現するためのユニークな機能を提供します。この技術は、高分解能で構造の詳細を提供しない、膜蛋白質の構造の知識のギャップには近く原子分解能を必要とせず研究の多くのアドレス指定可能な分野が含まれています。たとえば、これらの区域は、摂動、および折りたたみ/展開イベント オリゴマー状態、複雑な形成、構造変化の測定を含みます。これらの調査は、このメソッドのアプリケーションを容易に実現できます。

ビームの時間と計測器の提案は、提案する実験の有効な評価を行うことができますので、審査委員会に必要なすべての情報を明確に伝える必要があります。NSS との通信は非常に経験の浅いユーザーの示唆されました。NSS は、初期の可能性と可能性、安全性、効果の高い科学の可能性を強調するガイド提案提出を評価できます。提案で提供される情報は、背景情報と、研究の意義のコンテキストを含める必要があります。知識を獲得することになっている、これは科学の分野で現在の理解に及ぼす影響について作業、サンプル、メソッド、および採用される手順の説明該当する場合は、関連する出版物や結果をはじめとして、施設でのチームの前の生産性。中性子科学ユーザー ポータル (neutrons.ornl.gov/users) 経由でユーザーに提案書テンプレートや、提案を準備するためのヒントなどの有用な資源があります。
実験計画がしばしば提案書の提出の最初の段階の間に始まる実験直前まで完全に構想がない動的な...

このプロトコルは、低解像度第一原理計算モデルと洗剤のコントラストが一致する中性子小角散乱法を用いたソリューションの洗剤可溶化膜蛋白質の構造の詳細を取得する方法を示します。

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

この方法は、オリゴマー状態、そのサイズ、全体的な形状、溶液中の低解像度構造などの一体性膜タンパク質に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。膜タンパク質の溶液研究では、洗剤のような分子を安定化させる必要があります。この技術は、洗剤を見えなくし、膜タンパク質からのシグナルを強調するという利点があります。タンパク質の1/3以上は、多くの重要な細胞機能を実行する膜に存在するため、この技術の意味は、多くの生物学的および医学的研究の質問に及ぶ。重水素標識と中性子散乱ステップは、これらの技術の訓練を提供する機関が非常に少ないため、この方法の視覚的なデモンストレーションが重要です。まず、コントラスト変動データの解析用モジュールである「マルチ」を使用して中性子散乱長さ密度またはSLを決定します。左側のナビゲーション ペインにあるコントラストをクリックして、コントラスト モジュールを開きます。プロジェクトタイトルのテキストを入力し、サブユニット 1 とサブユニット 2 として 2 つのコンポーネントの詳細を入力します。数式テキスト ボックスに、各コンポーネントの分子式を入力します。次に、体積の下のボックスに各コンポーネントの三方オングストロームでボリュームを入力します。最後に、バッファ コンポーネントの詳細を入力します。[送信]をクリックして中性子のコントラスト計算を実行します。結果ページは、散乱長密度とコントラストマッチポイントのテーブルを提供するとともに、バッファー内の任意の割合の D2O でこれらのパラメーターを決定するための式を提供します。コンポーネントのコントラストマッチポイントに特に注意を払って、散乱パラメータを確認します。LB培地中の標的タンパク質配列に対する誘導発現ベクターを有する大腸菌細胞を、600ナノメートルまたはOD600程度の光学密度に成長させる。LB培養物を3ミリリットルの最小培地で1~20に希釈することにより、重タンパク質の過剰発現のためにスケールアップする前に大腸菌細胞を重水素標識培地に適応させる。約1個のOD600に成長させた後、50、75、および100%D2Oを含む最小培地を使用して1〜20希釈を繰り返します。一度適応したら、重水素細胞塊の収率を増加させるためにバイオリアクターで培養を成長させ続ける。D2Oの含有量が増加すると、成長率が低下します。テキストプロトコルに記載されているように、収穫、ライス、および細胞を浄化するに進みます。次に、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムを使用して、最終交換バッファーの2カラムを超える体積を有するサイズ排除カラムを平衡化する。サンプルを注入した後、目的のタンパク質に対応する分画を分離してカラムを実行する。小角中性子散乱またはSANSバックグラウンド減算のために、一致したバッファのアリコートを予約し

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

肺炎球菌から炭水化物基質結合タンパク質の豊富な生化学的および構造解析を実行するための合理化されたプロトコルが表示されます。...

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1...

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

洗剤に敏感な例として並べ替え受容体、ソーティリン、GLUT4...

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

ここでは、小角 x 線散乱 (SAXS) を高分子の構造を表す低解像度の封筒に情報を取得する利用できる方法を提案します。X 線結晶構造解析や核磁気共鳴などの高分解能構造技術と組み合わせて使用すると、小角はマルチ...

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

本プロトコルは、ヒトの健康に重要な役割を果たす2つのモデルタンパク質の構造および動態を調査するための方法を記載する。この技術は、ベンチトップの生物物理学的特性評価と中性子スピンエコー分光法を組み合わせて、タンパク質のドメイン間運動に関連する時間と長さのスケールでのダイナミクスにアクセスします。...

中性子スピンエコー分光法 による タンパク質ダイナミクスの研究

本論文では、脂質膜の中性子スピンエコー(NSE)研究におけるサンプル調製、データ削減、データ解析のプロトコルについて述べる。脂質の重水素標識は、重要な生物学的プロセスが起こるメソスコピック長および時間スケール上の異なる膜動力学へのアクセスを可能にする。...

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

中性子後方散乱分光法は、タンパク質とその水和水のps-nsダイナミクスへの非破壊でラベルフリーのアクセスを提供します。このワークフローには、アミロイドタンパク質に関する2つの研究、すなわち凝集中のリゾチームの時間分解ダイナミクスと、繊維形成時のタウの水和水ダイナミクスに関する研究が提示されています。...

タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

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ナノディスク内の膜タンパク質を安定化する技術

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