生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

この方法は、ペプチドが細胞膜に局在するか、細胞膜全体にトランス位置するかという抗菌ペプチド分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。スフェロプラストとプロトプラストを使用すると、生理学的に関連性のあるモデルシステムでのペプチド局在の可視化と解析が可能となり、細菌細胞イメージングで発生する分解能の問題を回避できます。この方法は抗菌ペプチドに関する洞察を得ることができますが、細胞透過性ペプチドなどの他の膜活性剤にも適用できます。

グラム陰性大腸菌のスフェロプラストとグラム陽性のB.megateriumプロトプラストは、適切な滅菌技術を使用して生物学的安全キャビネットまたは層流フードで調製する必要があります。必要に応じて、細菌株に抗生物質耐性プラスミドを含めることができ、スフェロプラストとプロトプラストはオープンラボベンチで調製できます。このビデオでは、スフェロプラストとプロトプラストをオープンラボベンチで抗生物質耐性菌株を使用して調製しています。

一晩培養するには、滅菌マイクロピペットチップを使用して、固体寒天培地プレートから1つの細菌コロニーを、2〜3ミリリットルの3パーセントトリプチカーゼ大豆ブロスTSBを含む14ミリリットルの培養チューブに移し、37°Cで振とうしながら16〜21時間インキュベーションします。グラム陰性大腸菌スフェロプラストを調製するには、一晩培養物を1:100の比率で希釈し、250ミリリットルのフラスコで25ミリリットルのTSBを希釈し、細菌をさらに2.5時間振とうインキュベーターに戻します。溶液が600ナノメートルで0.5〜0.8の光学密度に達したら、新しい250ミリリットルフラスコで新鮮なTSBで培養物を1対10の比率で希釈し、セファレキシンの1ミリリットルあたり60マイクログラムの最終有効濃度で2回目の2.5時間のインキュベーションを行います。

長さ約50〜150マイクロメートルのシングルセルフィラメントを作製し、1000倍の倍率で光学顕微鏡で可視化します。細菌溶液を遠心分離してフィラメントを採取し、上清をデカントします。ペレットを乱さないように注意しながら、1ミリリットルの0.8モルスクロースを穏やかに加えてフィラメントを洗浄します。

1分後、ペレットを乱さずに上清を捨て、指示された試薬をそれぞれの順序でフィラメントに加えます。室温で10分後、溶液Aを手でやさしく撫でながら、1ミリリットルの溶液Aを1分間かけて徐々に加えます。室温で4分間溶液をインキュベートし、次にフィラメント懸濁液を7ミリリットルの摂氏4度の溶液B.Nextを含む2つの15ミリリットルの円錐管の間に2つの等しいアリコートに分割し、遠心分離によってフィラメントをペレット化し、アッシリアロジカルピペットを使用して、ペレットを乱すことなく上清の1〜2ミリリットルを除くすべてのものを除去します。

p1000マイクロピペットを使用して、ペレットを静かに再懸濁します。サンプルの少量のアリコートを光学顕微鏡でスフェロプラスト形成を確認します。その後、スフェロプラストはマイナス20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存できます。

グラム陽性B.megateriumプロトプラストを調製するには、250ミリリットルのフラスコで3パーセントTSBの100ミリリットルで1:1000の比率で一晩の細菌培養を希釈し、37°Cで4.5時間インキュベーションします。液体培養物が600ナノメートルで0.9〜1.0の光学密度に達したら、細菌を2本の50ミリリットルの円錐管に分割して遠心分離し、アッシリアロジカルピペットを使用して上清をアスペレートします。チューブあたり2.5ミリリットルのプロトプラスト培地にペレットを懸濁し、懸濁液を1つの円錐形チューブに引き込んで125ミリリットルのフラスコで培養します。

ミリリットルあたり5ミリグラムのリゾチームを培養物に加え、摂氏37度で振とうしながら1時間のインキュベーションを行います。光学顕微鏡でプロトプラストの成長をモニタリングし、球体ではなく腫れた桿体として現れる細菌などの不規則性に注意します。インキュベーションの終了時に、懸濁液を遠心分離用の15ミリリットルの円錐管に移し、ペレットを5ミリリットルのプロトプラスト培地に再懸濁します。

その後、プロトプラストはマイナス20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存できます。スフェロプラストまたはプロトプラストを可視化するには、目的の懸濁液の5マイクロリットルをPoly L Lysineコーティングガラススライドに移し、続いて100〜200マイクロモルの抗菌ペプチドまたはAMPで標識された2マイクロリットルのfitcを転写します。光から保護された3分間のインキュベーション後、適切なメンブレンダイを1マイクロリットルサンプルに加えて、暗闇でさらに3分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、標識されたスフェロプラストまたはプロトプラストをガラスカバースリップで覆い、カバースリップをマニキュアで密封します。細胞をイメージングするには、共焦点顕微鏡と適切なレーザーをオンにして63倍対物レンズを選択し、適切なイメージングソフトウェアを使用して、目的の各細菌細胞全体の0.5マイクロメートルスライスで構成される8ビット512 x 512の複合Zスタック画像を取得します。蛍光標識されたAMPの局在を視覚化するには、適切なイメージング解析プログラムで複合Zスタック画像を開き、目的の最初の球状体またはプロトプラストの中心スライスを特定します。

直径0.3マイクロメートルの円形の関心領域をメンブレン上に1つ、細胞の中心に1つ、細胞から離れた場所に1つ配置して、ピクセルが飽和しないように注意しながら背景蛍光を測定します。その後、各関心領域の平均蛍光強度をソフトウェアで計算できます。従来の光学顕微鏡の分解能限界により、蛍光標識されたペプチドシグナルが正常な細菌の膜から生じるのか、細胞内空間から生じるのかを区別することは困難です。

シグナルがメンブレンに局在すると、細胞内空間と重なるように見えます。対照的に、正常な細菌と比較してスフェロプラストとプロトプラストのサイズが拡大しているため、膜マーカーと細胞内空間との間に明確な分解能が生じます。ペプチドの局在を区別しやすくします。

例えば、蛍光標識ペプチドの膜への局在化および細胞膜を横切る転座は、先ほど示したように、共焦点蛍光顕微鏡により、大腸菌スフェロプラストとB.megaterium protoplastの両方で可視化できます。スフェロプラストまたはプロトプラストの膜および細胞内空間、およびバックグラウンドに関心領域を配置することで、AMPと相互作用する各スフェロプラストまたはプロトプラストの膜上の細胞内ペプチド蛍光強度とペプチド蛍光強度の比を計算できます。例えば、この方法を使用して、ヒストン由来の微生物ペプチド変異体と大腸菌のスフェロプラストおよびB.megateriumプロトプラストとの相互作用を可視化できます。

この実験では、AMPは両方の細菌株で同様の局在パターンを示しました。野生型ペプチドと比較して転座が減少していることを強調しています。最終的に、この技術により、研究者は単一細胞レベルでのペプチド局在パターンを探索できます。

目的のペプチドの作用機序に関する洞察を提供します。研究者がペプチドメカニズムの体系的な特性評価のためにより多くの画像を収集できるだけでなく、より大きなスフェロプラストとプロトプラストの画像は、小さな細菌細胞の画像よりも定量的分析に扱いやすくなります。