Name: 生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶ 抗菌ペプチドの細菌膜への局在と膜透過を可視化する手法。Escherichia coliスフェロプラストとBacillus megateriumプロトプラストを用いて、膜活性薬剤の作用機序を単細胞レベルで解析する。

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研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 (NIH NIAID) 賞 R15AI079685 によって支えられました。

1. ソリューションの準備
注:エシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラストをそれぞれ生産するために手順 1.1-1.9 1.8-1.11 で説明するソリューションを準備します。
<ol><li>準備 1 M トリス-Cl、10.34 g トリス塩酸と dH2O 125 mL フラスコ 50 mL にトリスああ 4.17 g を溶解して pH 7.8。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 25 mL dH2125 mL フラスコ内 O 11.98 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することによりソリューション (20 mM MgCl2、0.7 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>ソリューション B (10 mM MgCl2、0.8 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備するには、0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) 25 mL dH2125 mL のフラスコで O に溶解します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>50 mL dH2O は、125 mL のフラスコで 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することにより 0.8 M ショ糖を準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>5 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼの準備私 (DNase 私) 0.015 g DNase 溶解 dH250 mL フラスコ O の 3 mL で。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション</li>
	<li>0.125 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の準備、0.698 g EDTA 二ナトリウムを溶解して pH 8.0 15 mL dH2O 125 mL のフラスコの中に (372.2 g/mol) を脱水します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>600 μ g/mL セファレキシンを準備するには、50 ml の dH2O 125 mL のフラスコの中のセファレキシン水和物 (365.404 g/mol) の 0.03 g を溶解します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい、4 ° C での円錐管に格納</li>
	<li>DH250 mL フラスコ O の 3 mL で 0.015 g リゾチームを溶解して 5 mg/mL リゾチームを準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション</li>
	<li>1 l の dH2O 2 L フラスコで TSB の 30 g を溶解することにより、3 w/v トリプチ醤油スープ (TSB) を準備します。因数にフラスコ 25 mL または 100 mL それぞれ大腸菌スフェロプ ラストまたはB. メガテリウムプロトプ ラスト,の準備で使用される TSB を含むソリューション。液体培地を滅菌するオートクレーブ フラスコ。滅菌 TSB は室温または 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>34.23 g ショ糖 (342.3 g/mol)、0.46 g マレイン酸 (116.07 g/mol) と 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL フラスコ 100 mL に溶解して溶液 (1 の M ショ糖、0.04 M マレイン酸、0.04 M MgCl2、pH 6.5) を準備します。6.5 に pH を調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>100 mL 3 w/v TSB と 100 mL の溶液 C 1 L のガラス瓶を混合することによってプロトプ ラスト中の 200 mL を準備します。オートクレーブ ソリューションを殺菌し、常温で保存します。</li>
</ol>2. 一晩かけて培養の準備
注: セクション 2-4 適切な無菌技術を使用してを実行します。必要な場合、細菌は潜在的な汚染を減らすために抗生物質耐性のプラスミドを含めることができます。抗生物質耐性の菌株を使用している場合は、手順 2.1、3.1-3.2 と、図 4.1-4.4 で必要な抗生物質を追加します。
<ol><li>滅菌ピペット チップを使用して、それを 3 %w/v TSB の 2-3 mL を含む 14 mL 培養管細菌の単一コロニーをピックアップして一晩かけて培養を準備します。37 ° C で 16-21 h に振りながらインキュベートします。</li>
</ol>3 グラム陰性大腸菌スフェロプ ラストの作成
<ol><li>250 mL フラスコ 25 mL 量 3 %w/v TSB で一晩文化 1: 100 を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションは 600 0.5-0.8 の光学濃度に達するまでに約 2.5 時間振りながらインキュベート nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。</li>
	<li>250 mL フラスコにこの文化 1:10 3 %w/v TSB の 30 ml を希釈し、インキュベート 37 ° C についての 1 つのセルのフィラメントを生成する 60 μ G/ml セファレキシン (347.4 g/mol) の存在下で 2.5 h に振りながら長さ 50-150 μ m、光学顕微鏡 (図 1 b) 1,000 倍の倍率で観察可能であります。</li>
	<li>1,500 × g、4 ° C で 4 分間デカントで細菌のソリューションを遠心分離によってフィラメントを収穫し、ペレットを予約、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>優しく 0.8 M ショ糖、ペレットを邪魔しないように注意されているの 1 つの mL を追加することでフィラメントを洗います。1 分間インキュベートし、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 の 150 μ L を追加 5 mg/mL リゾチームの 120 μ L、5 Mg/ml の DNase の 30 μ M トリス Cl (pH 7.8)、私は、120 μ L、それぞれ 0.125 M EDTA のペレットに注文し、10 分間室温でソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>溶液の 1 mL 徐々 に 1 分以上ソリューションに追加、ソリューションを手でゆっくり旋回しながら、マイクロ ピペットを使用して 3.5 の準備します。室温で 4 分のためのソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>4 ° C の溶液 B の 7 mL を 2 つの 15 mL の円錐管に入れます。これらの 2 つの管のそれぞれに 3.6 で、溶液の同量を追加します。1,500 × g、4 分の 4 ° C で溶液を遠心します。</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく 1-2 mL の培養上清を除くすべて削除血清ピペットを使用して、慎重に。P1000 マイクロ ピペットを使用して上下に軽くピペッティングでペレットを再懸濁します。光学顕微鏡 (図 1) を使用して 1,000 倍の倍率でサンプルを観察することによってスフェロプ ラスト形成を視覚的に確認します。</li>
	<li>-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでスフェロプ ラストを格納します。</li>
</ol>4. グラム陽性B. メガテリウムプロトプ ラストの調製
<ol><li>250 mL のフラスコで 3 %w/v TSB の 100 mL で一晩文化縮尺を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションが 0.9-の光学密度に達するまで、約 4.5 時間のため震えながらインキュベート 600 1.0 nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。</li>
	<li>液体培養を注ぎ、2 つの 50 mL の円錐管、2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、両方の円錐管から上澄みを廃棄します。2.5 mL プロトプ ラスト中でペレットを再懸濁します再懸濁のソリューションを単一の円錐管に結合しています。125 mL のフラスコで結合された再懸濁ソリューションをピペットします。</li>
	<li>5 mg/mL リゾチームの 1 mL を追加し、震えながら 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プロトプ ラスト 1,000 x 倍率球 (図 2) ではなく腫れ棒として表示される細菌などの任意の不正を指摘し、光学顕微鏡下での成長を監視します。血清ピペットを使用して、ソリューションを 15 mL の円錐管と 2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心分離機に転送します。</li>
	<li>上清をデカントし、再 5 mL プロトプ ラスト メディアでペレットを中断します。-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでプロトプ ラストを格納します。</li>
</ol>5. ペプチド溶液および膜色素イメージングのための準備
<ol><li>
ペプチド ソリューション
	<ol>
<li>アルミ箔に包まれておよび microfuge の管で FITC 800 μ L dH2O を使用して蛋白質の濃度測定を実施するために、少なくとも 1 つのトリプトファン残基を含むペプチドで BF2 P11A をラベル付けの 2 mg を溶解します。</li>
		<li>オンカラム、280 でペプチド溶液の吸光度を測定 3 通 nm。トリプトファン (5,700/Mcm) における分子吸光係数を用いたペプチド濃度を計算します。</li>
		<li>光から保護するためにアルミ箔に包まれて2O-20 ° c および microfuge の管で 100-200 μ m ストアの最終濃度に dH でペプチド濃度を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膜色素
	<ol>
<li>および microfuge の管でのディ-8-ANEPPS DMSO の 843.3 μ L で 5 mg を溶解してディ-8-ANEPPS (592.9 g/mol) の 10 の mM の在庫を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° C で保存します。</li>
		<li>および microfuge の管で 997 μ L DMSO に 3 μ L の 10 mM ディ-8-ANEPPS を追加して 0.03 mM ディ-8-ANEPPS の 1 mL を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° c および microfuge の管に格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6.大腸菌スフェロプ ラストと共焦点顕微鏡を用いたB. メガテリウムプロトプ ラストの可視化
<ol><li>スフェロプ ラストまたはポリ L リジン コーティング ガラス スライド上にプロトプ ラストの 5 μ L をピペットします。アンプ (100-200 μ M) をスライドにラベルが付いた FITC の 2 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。</li>
	<li>スライドに、膜色素・ ディ ・-8-ANEPPS (0.03 mM) の 1 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。ガラス基板カバーし、マニキュアで封印します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡とアルゴン レーザーをオンにします。アルゴン レーザーで出力電力 20% と 20% の伝送を調整します。</li>
	<li>499-532 nm と FITC 標識ペプチド放出チャネルとディ 8 ANEPPS 標識膜色素放出チャネルの 670-745 nm の発光波長範囲をそれぞれ設定します。</li>
	<li>プロトプ ラスト イメージまたは 63 X 目的としたスフェロプ ラスト (図 1および図 2)。8 ビットを取得するイメージング ソフトウェアを使用して、画像を 512 x 512 複合 z スタックから成るスフェロプ ラストやプロトプ ラストの全体の 0.5 μ m のスライス。 注: は、イメージングのスフェロプ ラストとプロトプ ラスト中の裁ち落としを通じて排出量を減らすための配慮を取る。詳細についてを参照してください。</li>
</ol>7 アンプの局在化の特性
<ol><li>イメージング ソフトウェアで複合 z スタックのイメージを開きます。スフェロプ ラストやプロトプ ラストの中央のスライスを見つけて 1 つ循環地域の利益率 (ROI) を配置 (直径 0.3 μ m)、スフェロプ ラストのプロトプ ラスト (ROI 2) センターで、スフェロプ ラストまたは測定するプロトプ ラストからの膜 (投資収益率 1)背景の蛍光性 (投資収益率 3) (図 5)。飽和ピクセルを含めることを避けてください。各 ROI の蛍光強度は、画像処理ソフトで計算できます。 注: インスタンス ペプチドは、細胞膜の完全ローカライズされていない、描画 ROI 1 ペプチドはローカライズされた膜の領域に。</li>
	<li>細胞内ペプチド蛍光強度膜ペプチドの蛍光強度の比を決定する次の式を使用します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> 注: 投資収益率 3 の蛍光強度は蛍光バック グラウンドを考慮するために 2 の投資収益率と投資収益率 1 で蛍光強度から差し引かれます。</li>
</ol>

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利害の対立が宣言されていません。

ここに示すプロトコルより急速に拡大、球形の細菌がはるかに簡単検索、向き、およびイメージのため細菌画像のより大きなサンプル サイズを取得する研究者を実現可能にします。データを収集するためにこの拡張機能は、いくつかの点で重要です。まず、ペプチドの局在パターンのより体系的な定量分析を有効化します。高画質画像のセットでのみ大きなサンプルを明らかに局在する細胞ペプチドが対移行の割合など局在パターンの動向により微妙な画像のセットが小さいから定性的な傾向を示すことができます中、膜。またより良い解決する機能膜のローカリゼーションから内部の蛍光やすくローカリゼーション パターンは時間をかけて変更方法としてどのように迅速にペプチドが細菌細胞同様と対話するを評価する時間コース研究を実施します。改良された解像度小さい細菌では実現できないペプチドの局在化の動向を検討する研究ができます。たとえば、いくつかの私たちの観測のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト、ペプチドは、膜、すなわち、ペプチド信号細菌の周り完全なまとまりのあるリングを形成していないいくつかの点状の代わりに表示の特定のセクションに合わせてローカライズする表示されます。ラベリング。他の...

抗菌ペプチド (アンペア) は、従来の抗生物質1,2,3,4、5の代わりに、彼らの潜在的な使用のため注目を集めています。アンプによって細胞膜透過や核酸など、細胞内構成要素との相互作用構造のセル内容6漏洩を引き起こす膜で細菌を殺します。、抗生物質として利用に加えてアンプを透過が適応する薬物送達アプリケーションの無停止不浸透性の細胞膜7、8を越えることができるので。我々 は、したがって、創での使用のための基盤を築くためのアクションの基本的なアンプのメカニズムを理解しようとします。
共焦点顕微鏡アクション9,10、11,12,のメカニズムに洞察力を提供する細菌細胞の蛍光に分類されたアンプの局在パターンを評価する方法を提供しています。13,14. 細菌の膜の分類、によって 1 つは蛍光に分類されたペプチドが膜または細菌の細胞の細胞内領域に局在するかどうかを決定できます。ただし、この手法は、従来の光顕微鏡の解像度の限界と可変方向スライド15上の細菌のために挑戦をイメージングすることができます細菌の小さなサイズとロッドの形状によって制限されます。
提案手法の目的は、共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識ペプチドの局在パターンの強化された可視化を有効にすることです。小型、薄型、桿菌グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を回すことによって可視化を強化拡大、球状形態に細菌と呼ばれる(グラム陰性菌) のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト (グラム陽性菌) の16,17,18,19,20,21。スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、そのサイズの増加とそのイメージングの無関係なスライドの細菌の向きは、その左右対称の形状のためイメージしやすく。また、ローカライズや透過のいずれかの膜としてアンプを特徴付けるために共焦点顕微鏡データを定量的に解析する体系的なアプローチを提案する.これらの方法を適用しやすく区別蛍光ペプチドの局在パターンに分類します。ここに示すプロトコルは、各種アンプ、セル透過ペプチドを含む以外膜活性剤のローカリゼーションを評価するために使用できます。
この手法の利点は、細胞間の異質性15、一般的に識別するために使用される他の蛍光アッセイではなく明らかにするかもしれない単一セルのレベルのアンプの作用のメカニズムに洞察力を提供することの 1 つ、アンプは、一括見積もり9,22,23,24,25を提供するだけの行為のメカニズム。スフェロプ ラストとアンプ セルへの入力を評価するためにプロトプ ラストの使用特定の有用な26彼らこそ脂質小胞24など、セルへの入力を評価するために使用されるその他のモデルよりももっと生理学的に関連する15 。

<table><tbody><tr><td>トリズマヒドロクロライド(トリスHCl)</td><td>シグマ</td><td>T3253</td><td></td></tr>トリ<tr><td>ズマベース(トリスOH)</td><td>シグマ</td><td>T1503</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム</td>シ<td>グマ</td><td>M8266</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>シグマ</td><td>S7903</td><td></td></tr>リ<tr><td>ゾチーム</td><td>シグマ</td><td>L6876</td><td></td></tr>デ<tr><td>オキシリボヌクレアーゼI</td><td>シグ</td>マ<td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>当初のプロトコール開発で Sigma 106361 を使用し、106361 ED2SS で製造中止</td></tr><tr><td>セファレキシン水和物</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL トリプチカーゼ 大豆ブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr>の<tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>は、元のプロトコル開発でSigma D8779を使用しました。D8779 は 34869 で製造中止となり、</td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm シリンジ フィルター 0.2 &mu;m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>TCS SP5 II</td><td>画像取得用</td></tr><tr><td>ライカアプリケーションスイート、アドバンスト蛍光</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td>画像処理用</td></tr></tbody></table>

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

細菌内でペプチドの局在パターンを評価する方法としての共焦点顕微鏡の使用は、従来の光顕微鏡の解像度の限界によって阻害される一般的。小さな棒状グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を変換するプロトコルを提案する特定の顕微鏡の解像度は簡単に強化できない、大きく、簡単にイメージ化された球状形態にスフェロプ ラストやプロトプ ラストと呼ばれます。この変換では、迅速かつ明確にペプチド (すなわち膜のローカライズ) 細菌の細胞膜に自分自身を申し立てるか (すなわち、透過) セルを入力する膜を通過するかどうかを決定するためのオブザーバーをことができます。このアプローチでは、ローカライズや透過膜としてペプチドを特徴付けるため体系的な方法を示します。Buforin II P11A の相互作用を観察することによりこのプロトコルの有用性を示す様々 な膜活性ペプチドや細菌の緊張のこのメソッドを使用できますが、(BF2 P11A)、エシェリヒア属大腸菌での抗菌ペプチド (AMP)スフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラスト。

細菌を拡大して、球は、簡単に、ペプチドは細菌の細胞膜にローカライズや細菌の細胞膜に容易に若しかどうかを区別できます。従来の光顕微鏡の解像度限界は膜にローカライズされた信号と重複するように見えるために、膜または通常の細菌の細胞内スペースからペプチド信号が発生するかどうかを区別するために挑戦的な、細胞内領域 (図 3 a)。対照的に、膜マーカーと簡単に細胞内のスペースの間のクリアな解像度で結果のスフェロプ ラスト (2-5 μ m) とプロトプ ラスト (2-3 μ m)、直径 1 μ m が通常、通常の細菌に比較して拡大サイズペプチドの局在 (図 3 b) を区別します。
ここでは、スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、アンプ 2 阶 P11A ラベル N ターミナル FITC の局在パターンを表示する使用されます。FITC 標識膜に...

ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ ラストペプチド細菌の相互作用。これは膜透過ペプチドとローカライズを定義する体系的な方法を提供します。

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

この方法は、ペプチドが細胞膜に局在するか、細胞膜全体にトランス位置するかという抗菌ペプチド分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。スフェロプラストとプロトプラストを使用すると、生理学的に関連性のあるモデルシステムでのペプチド局在の可視化と解析が可能となり、細菌細胞イメージングで発生する分解能の問題を回避できます。この方法は抗菌ペプチドに関する洞察を得ることができますが、細胞透過性ペプチドなどの他の膜活性剤にも適用できます。グラム陰性大腸菌のスフェロプラストとグラム陽性のB.megateriumプロトプラストは、適切な滅菌技術を使用して生物学的安全キャビネットまたは層流フードで調製する必要があります。必要に応じて、細菌株に抗生物質耐性プラスミドを含めることができ、スフェロプラストとプロトプラストはオープンラボベンチで調製できます。このビデオでは、スフェロプラストとプロトプラストをオープンラボベンチで抗生物質耐性菌株を使用して調製しています。一晩培養するには、滅菌マイクロピペットチップを使用して、固体寒天培地プレートから1つの細菌コロニーを、2〜3ミリリットルの3パーセントトリプチカーゼ大豆ブロスTSBを含む14ミリリットルの培養チューブに移し、37°Cで振とうしながら16〜21時間インキュベーションします。グラム陰性大腸菌スフェロプラストを調製するには、一晩培養物を1:100の比率で希釈し、250ミリリットルのフラスコで25ミリリットルのTSBを希釈し、細菌をさらに2.5時間振とうインキュベーターに戻します。溶液が600ナノメートルで0.5〜0.8の光学密度に達したら、新しい250ミリリットルフラスコで新鮮なTSBで培養物を1対10の比率で希釈し、セファレキシンの1ミリリットルあたり60マイクログラムの最終有効濃度で2回目の2.5時間のインキュベーションを行います。長さ約50〜150マイクロメートルのシングルセルフィラメントを作製し、1000倍の倍率で光学顕微鏡で可視化します。細菌溶液を遠心分離してフィラメントを採取し、上清をデカントします。ペレットを乱さないように注意しながら、1ミリリットルの0.8モルスクロースを穏やかに加えてフィラメントを洗浄します。1分後、ペレットを乱さずに上清を捨て、指示された試薬をそれぞれの順序でフィラメントに加えます。室温で10分後、溶液Aを手でやさしく撫でながら、1ミリリットルの溶液Aを1分間かけて徐々に加えます。室温で4分間溶液をインキュベートし、次にフィラメント懸濁液を7ミリリットルの摂氏4度の溶液B.Nextを含む2つの15ミリリットルの円錐管の間に2つの等しいアリコートに分割し、遠心分離によってフィラメントをペレット化し、アッシリアロジカルピペットを使用して、ペレットを乱すことなく上清の1〜2ミリリットルを除くすべてのものを除去します。p1000マイクロピペットを使用して、ペレットを静かに再懸濁します。サンプルの少量のアリコートを光学顕微鏡でスフェロプラスト形成を確認します。その後、スフェロプラストはマイナス20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存できます。グラム陽性B.megateriumプロトプラストを調製するには、250ミリリットルのフラスコで3パーセントTSBの100ミリリットルで1:1000の比率で一晩の細菌培養を希釈し、37°Cで4.5時間インキュベーションします。液体培養物が600ナノメートルで0.9〜1.0の光学密度に達したら、細菌を2本の50ミリリットルの円錐管に分割して遠心分離し、アッシリアロジカルピペットを使用して上清をアスペレートします。チューブあたり2.5ミリリットルのプロトプラスト培地にペレットを懸濁し、懸濁液を1つの円錐形チューブに引き込んで125ミリリットルのフラスコで培養します。1ミリリットルあたり5ミリグラムのリゾチームを培養物に加え、摂氏37度で振とうしながら1時間のインキュベーションを行います。光学顕微鏡でプロトプラストの成長をモニタリングし、球体ではなく腫れた桿体として現れる細菌などの不規則性に注意します。インキュベーションの終了時に、懸濁液を遠心分離用の15ミリリットルの円錐管に移し、ペレットを5ミリリットルのプロトプラスト培地に再懸濁します。その後、プロトプラストはマイナス20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存できます。スフェロプラストまたはプロトプラストを可視化するには、目的の懸濁液の5マイクロリットルをPoly L Lysineコーティングガラススライドに移し、続いて100〜200マイクロモルの抗菌ペプチドまたはAMPで標識された2マイクロリットルのfitcを転写します。光から保護された3分間のインキュベーション後、適切なメンブレンダイを1マイクロリットルサンプルに加えて、暗闇でさらに3分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、標識されたスフェロプラストまたはプロトプラストをガラスカバースリップで覆い、カバースリップをマニキュアで密封します。細胞をイメージングするには、共焦点顕微鏡と適切なレーザーをオンにして63倍対物レンズを選択し、適切なイメージングソフトウェアを使用して、目的の各細菌細胞全体の0.5マイクロメートルスライスで構成される8ビット512 x 512の複合Zスタック画像を取得します。蛍光標識されたAMPの局在を視覚化するには、適切なイメージング解析プログラムで複合Zスタック画像を開き、目的の最初の球状体またはプロトプラストの中心スライスを特定します。直径0.3マイクロメートルの円形の関心領域をメンブレン上に1つ、細胞の中心に1つ、細胞から離れた場所に1つ配置して、ピクセルが飽和しないように注意しながら背景蛍光を測定します。その後、各関心領域の平均蛍光強度をソフトウェアで計算できます。従来の光学顕微鏡の分解能限界により、蛍光標識されたペプチドシグナルが正常な細菌の膜から生じるのか、細胞内空間から生じるのかを区別することは困難です。シグナルがメンブレンに局在すると、細胞内空間と重なるように見えます。対照的に、正常な細菌と比較してスフェロプラストとプロトプラストのサイズが拡大しているため、膜マーカーと細胞内空間との間に明確な分解能が生じます。ペプチドの局在を区別しやすくします。例えば、蛍光標識ペプチドの膜への局在化および細胞膜を横切る転座は、先ほど示したように、共焦点蛍光顕微鏡により、大腸菌スフェロプラストとB.megaterium protoplastの両方で可視化できます。スフェロプラストまたはプロトプラストの膜および細胞内空間、およびバックグラウンドに関心領域を配置することで、AMPと相互作用する各スフェロプラストまたはプロトプラストの膜上の細胞内ペプチド蛍光強度とペプチド蛍光強度の比を計算できます。例えば、この方法を使用して、ヒストン由来の微生物ペプチド変異体と大腸菌のスフェロプラストおよびB.megateriumプロトプラストとの相互作用を可視化できます。この実験では、AMPは両方の細菌株で同様の局在パターンを示しました。野生型ペプチドと比較して転座が減少していることを強調しています。最終的に、この技術により、研究者は単一細胞レベルでのペプチド局在パターンを探索できます。目的のペプチドの作用機序に関する洞察を提供します。研究者がペプチドメカニズムの体系的な特性評価のためにより多くの画像を収集できるだけでなく、より大きなスフェロプラストとプロトプラストの画像は、小さな細菌細胞の画像よりも定量的分析に扱いやすくなります。

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

組換え体からコレステロール結合毒素ストレプトリジンOの精製方法...

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

出典: フィゲロア、DM、 et.al。 抗菌ペプチド局在を特徴付けるための細菌スフェロプラストとプロトプラストの生産と可視化 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、最初に細胞分裂を阻害してフィラメント化を誘導し、続いて細胞壁を酵素的に消化することにより、 大腸...

大 腸菌 スフェロプラストの調製

出典: Figueroa、DM、 et al. 抗菌ペプチド局在を特徴付けるための細菌スフェロプラストとプロトプラストの生産と可視化 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、グラム陽性菌Bacillus...

グラム陽性菌Bacillus megateriumからのプロトプラストの生成

出典: Bratton, B. P., 他、『 細菌細胞の三次元イメージングによる正確な細胞表象とタンパク質局在化のための研究』。 J. Vis. Exp.

蛍光イメージングによる細菌タンパク質分布の三次元可視化

出典: フィゲロア, D. ほか 抗菌ペプチドの局在を特徴づけるための細菌スフェロプラストおよびプロトプラストの生成と可視化。 J. Vis. Exp.

グラム陰性菌からの球状体生成

私たちは、細胞内タンパク質の折り畳みに固有の品質管理メカニズムを持つ大腸菌ツイン-アルギニン転座経路を使用して、抗体フラグメントの結合親和性と細胞質溶解性について抗体フラグメントのライブラリーを同時にスクリーニングする方法を提供します。...

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

プロトコルを提示大腸菌-lactococcal ・抗菌ペプチド ・ ナイシンに非正規アミノ酸類 (ncAAs) の選択的な圧力の取り込みをベースします。そのプロパティは、定義された成長媒体の目的の ncAAs...

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

挑戦している宿主細胞に細菌によって分泌されるエフェクターを監視する蛍光タンパク質ベースのアプローチ。これは蛍光タンパク質とタイプ III の分泌システムとの互換性がないのためにです。ここでは、最適化された分割 superfolder GFP...

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

蛍光タグ付き抗生物質は抗菌性の複数の側面を研究するために使用することができる強力なツールです。この記事では、蛍光タグ付き抗生物質の調製と細菌における抗生物質耐性を研究するアプリケーションについて説明します。プローブは、分光光度測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法によって細菌耐性(例えば、流出)のメカニズムを研究するために使用することができる。...

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

本プロトコルは、細胞外膜結合小胞内にパッケージされた、典型的に不溶性またはジスルフィド結合含有タンパク質を含む組換えタンパク質の細菌産生のための詳細な方法を記載する。これは、応用バイオテクノロジーや医学など、科学研究の多様な分野に適用できる可能性があります。...

大腸菌からの組換えタンパク質充填小胞の最適生産と分析

本プロトコルは、カチオン性ペプチドMel4およびペプチド模倣RK758の抗菌活性および細胞毒性の産生および評価方法を記述しています。化学合成、組換え発現、標準化された機能的アッセイを統合することで、ペプチドおよび小分子模倣者の生産と試験の効率的なワークフローを提供します。...

抗菌ペプチドおよびその模倣体の生産と試験

学ぶ 抗菌ペプチドの細菌膜への局在と膜透過を可視化する手法。Escherichia coliスフェロプラストとBacillus megateriumプロトプラストを用いて、膜活性薬剤の作用機序を単細胞レベルで解析する。

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