従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

LIF-3i法は、従来型のヒト多能性幹細胞を、ヒト着床前上皮芽葉の生化学的、転写的、およびエピジェネティックな特徴を有するより原始的な多能性状態に戻します。この方法は、系統プライミング遺伝子発現を減少させ、独立したhPSC株間で一般的に観察される誘導分化のインターライン変動性を消去することで、従来型のヒト多能性幹細胞の機能性を向上させます。この方法を使用すると、化学的に戻されたヒト多能性幹細胞は、長期的な培養後も、インプリンティングされた遺伝子座を含め、核型およびエピジェノムの安定性を維持し、リプライミング段階を必要とせずに、より高い効率で直接分化させることができます。

LIF-3i法は、初期のヒト発生生物学の研究に新しい道を開き、ヒト多能性幹細胞の分化、遺伝子ターゲティング、および種間キメラの生成を改善することで再生医療を進歩させる可能性があります。プロトコルを開始するには、有効な正常な核型を持つ従来型のヒト多能性幹細胞またはhPSCを、マウス胚由来線維芽細胞またはMEFベースのフィダー培養システムまたはフィダーフリー培養システムでの共培養で維持および増殖させます。以前に準備したゼラチン化された6ウェルプレートにMEFフィダーを少なくとも1日前に準備します。

従来型のhPSC培養が約50％のコンフルエンスに達したら、標準的なhESC培養培地を、各ウェルあたり2ミリリットルの白血病抑制因子5iまたはLIF-5i培養液に置き換えます。CO2インキュベーターで、従来型のhPSCとMEFをLIF-5iで最大2日間培養および維持します。系統的安定化とLIF-3iでの安定な戻しに備えて、LIF-5i培養液を毎日取り替えます。

フィダーフリーの従来型培養では、翌朝までLIF-5iのみでhPSCを一晩培養します。分離前に、LIF-5iに適応した従来型のhPSCをPBSで一度洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの細胞分離試薬を加えます。次に、CO2インキュベーターで37度で5分間プレートをインキュベートします。

インキュベーション後、ピペットで細胞をゆっくりと単一細胞懸濁液に分散させます。細胞懸濁液をhESC培地で少なくとも2倍希釈し、無菌の15ミリリットル円錐管に回収し、ピペッティングでゆっくりと細胞を分散させて単一細胞懸濁液を取得します。細胞を300gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を吸引して廃棄し、細胞ペレットを1〜2ミリリットルのLIF-5i培養液で再懸濁します。次に、細胞を数えます。事前にプレートに塗布した6ウェルのMEFプレートをPBSで2回、各ウェルあたり2ミリリットルで洗浄します。

1〜2倍10の6乗の細胞を2ミリリットルのLIF-5i培養液にPBSで洗浄したMEFプレートの1ウェルに分配します。プレートをCO2インキュベーターに入れます。翌日、プレートをゆっくりと揺らし、付着していない細胞を持ち上げ、培養液を吸引し、2ミリリットルのLIF-5i培養液で培養液を交換します。

3〜5日間または細胞が60〜70％コンフルエンスになるまで、この手順を毎日繰り返します。このプロトコルは、顕著な分化や異常な核型を持つヒト多能性幹細胞の調製が慎重に除外される限り、広範なヒト胚性および誘導多能性幹細胞株の急速かつ大量の無謬なような戻しをサポートします。初期のLIF-5i適応の後、生物安全キャビネットで、または培養が60〜70％コンフルエンスになるまで、安定したLIF-3i培養を3〜4日ごとに分離します。

培養液を廃棄し、LIF-5i-LIF-3i培養の各ウェルを、PBSを2ミリリットルゆっくりと加えて洗浄します。PBSを廃棄し、細胞剥離溶液を1ミリリットル加えます。CO2インキュベーターで37度で5分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞懸濁液を収集し、未処理のhESC培地を2倍希釈で加え、ピペッティングでゆっくりと細胞を分散させて単一細胞懸濁液を取得します。懸濁液を無菌の15ミリリットル円錐管に移します。細胞を300gで5分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。

ペレットをLIF-3i培養液で再懸濁し、細胞を数えます。次に、LIF-3i培養の定期的な分離のために、ゼラチン化された6ウェルプレート上の照射済みMEFに、各ウェルに2倍10の5乗の細胞をプレートします。初期のLIF-5iに適応した培養では、初期の高密度をLIF-3i MEFに設定します。

N-hPSCのLIF-3i培養液での連続的な大量分離を維持するために、個々のヒト多能性幹細胞株を最適化し、必要に応じて高い初期播種密度に調整する必要があります。LIF-5iに適応したhPSCを、LIF-3i培養液で新しいPBSで洗浄し、照射済みMEFフィダープレートに再プレートおよび分配します。LIF-3i培養液を毎日交換します。

機能研究または凍結保存にN-hPSCを使用する前に、LIF-3i培養液で少なくとも4〜7連続の大量分離を行うようにN-hPSCを分離します。N-hPSCの分離回数を従来の培養液またはLIF-3i培養液のいずれかで記録します。免疫蛍光染色およびウェスタンブロットにより、活性化されたリン酸化および総異性体のSTAT3およびErk1/2の発現が検出されました。これらは分子的多能性の重要なマーカーです。

ヘマトキシリンおよびエオジン染色の腫瘍微小切片は、3つの胚葉すべてへの強力な分化を示し、構造の整った外胚葉、中胚葉、内胚葉の系統が観察されました。このビデオを見て、LIF-5iからLIF-3iへのシーケンシャルな万能化学的方法を使用して、従来型のヒト多能性幹細胞を大量で効率的に無謬な状態に戻す方法について十分な理解が得られるはずです。このプロトコルを試みる前に、正常な核型に適合する低分離の従来型のヒト多能性幹細胞株から始めることが重要です。

従来型のヒト多能性幹細胞培養は、開始前に主に未分化で、自発的に分化した細胞がほとんど含まれている必要があります。初期の短いLIF-5i適応段階は、従来型のヒト多能性幹細胞のクローン増殖を大幅に高め、後にLIF-3iのみで大量に無謬に戻すことを可能にし、�