Name: 従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶLIF-3i法による従来のヒト多能性幹細胞のナイーブ様状態への復帰法。MEF共培養とフィーダーフリー系を用いて分化効率を向上させ、系統間変動を減少させる。再生医療への応用が期待される。

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この作品は、NIH/ネイ (R01EY023962)、NIH/NICHD (R01HD082098)、RPB スタイン ・ イノベーション ・ アワードのメリーランド州の幹細胞研究基金 (2014-MSCRFE-0742 2018-MSCRFV-4048)、ノボ ノルディスク科学フォーラム賞、モーズリー財団からの助成金によって支えられました。

<ol><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Human+Naive+Pluripotency+in+the+Embryo+and+in+the+Dish%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish.</a> Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).</li>
<li>Zimmerlin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+promotes+a+stable+human+naive+pluripotent+state+with+improved+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality.</a> Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16388305">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).</li>
<li>Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24513647">Chromosome preparation from cultured cells.</a> J Vis Exp. (83), e50203(2014).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293(2011).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-activated+stem+cell+circuits+and+stromal+signals+cooperatively+accelerate+non-integrated+iPSC+reprogramming+of+human+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors.</a> PLoS One. 7 (8), 42838(2012).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).</li>
<li>Collier, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Cell+Surface+Protein+Profiling+Identifies+Specific+Markers+of+Human+Naive+and+Primed+Pluripotent+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+distinct+states+of+human+naive+pluripotency+generated+by+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming.</a> Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Pluripotent+Stem+Cells+with+In+Vivo+Embryonic+and+Extraembryonic+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.</a> Cell. 169 (2), 243-257 (2017).</li>
<li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+simultaneous+generation+of+hematopoietic+and+vascular+progenitors+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+progenitors+from+cord+blood-derived+induced+pluripotent+stem+cells+possess+augmented+capacity+for+regenerating+ischemic+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature.</a> Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).</li>
<li>Taapken, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karotypic+abnormalities+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).</li>
<li>Mitalipova, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+copy+number+of+pluripotency+and+cell+proliferation+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+during+reprogramming+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+and+selection+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.</a> Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).</li>
</ol>

生命技術とジョンズ ・ ホプキンス大学 (JHU) との間のライセンス契約の下で博士・ ザンビディス幹細胞のライセンスのための大学によって受信料の共有する権利があります。この整理の用語は、その利益相反ポリシーに従ってビジネスキャリーによって管理されます。これは、共有データと材料にジャーナル ポリシーへの著者の付着は変わりません。

LIF 3 i システムは、ひと多能性幹細胞に古典的なマウス 2i 素朴な復帰カクテル1の修正版を適用されます。(これは 2 i だけで展開できない) hPSC の自己更新タンキラーゼ阻害剤 XAV939 とこのカクテルを補うことで LIF 2i で安定させます。LIF 3i 文化では、バルクと人間着床前胚盤葉上層3のような多能性の状態に従来の hPSC の効率的な帰属をことができます。HPSC の XAV939 の作用機序が可能性があります複雑な彼らは可能性が最低でも、重要な安定化と WNT シグナル伝達経路3を介して hPSC の自己更新の増強に含める 2i 相乗効果。
従来の hPSC 文化は通常高い変数系列プライミング遺伝子発現と矛盾または減少された機能性多能性2 可能性があります...

2i (MEK/ERK と GSK3β 阻害剤) 文化システムはマウス着床前胚盤葉上層1と同類の多能性の基底状態の制服に異種血清を用いたマウス胚性幹細胞 (mESC) 文化を絞り込むに元々 開発されました。ただし、2 i は、ひと多能性幹細胞 (hPSC) 線2の維持安定をサポートしません。様々 な成長因子の添加、複合体の小さい分子や形質推定をキャプチャする報告されている最近似たような人間のような素朴な多能性分子状態2。ただしもこれらのメソッドで作成された「世間知らずのような」状態の多くは核型不安定性、エピゲノム欠陥 (親ゲノムインプリンティングの例えば、グローバル損失) を展示や分化の障害。
コントラスト、トリプルの化学的阻害剤 GSK3β、ERK およびタンキラーゼ シグナリングのカクテルと白血病抑制因子 (LIF 3 i) は従来の hPSC ライン3の幅広いレパートリーの安定した世間知らずのような復帰のため十分でした。LIF 3i 戻す素朴な hPSC (N hPSC) 正常核型を維持し、素朴な固有人間着床前胚盤葉上層の遺伝子の表現を増加した (e.g.,NANOG、 KLF2 NR5A2、DNMT3L、HERVH、ステラ (DPPA3)、 KLF17、 TFCP2L1)。MESC のような素朴な多能性リン酸化 STAT3 シグナリング増加含まれて、ERK のリン酸化、グローバル 5-メチルシトシン CpG を減少するユニークな分子および生化学的な特性の配列と LIF 3i 復帰も授与 hPSC低いメチル化、胚性幹細胞 (ESC) のゲノム広い CpG メチル-特定の遺伝子の促進者と支配的な遠位 OCT4 エンハンサー使用。また、他の世間知らずと比較して異常 hypomethylated の結果返還方法刻印ゲノム遺伝子座, LIF 3i 戻った N hPSC 刻印 CpG パターンの体系や DNA メチルトランスフェラーゼ式の損失を欠いている (などDNMT3A、DNMT1 DNMT3B)3。
従来ヒト胚性幹細胞 (hESC)、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) の送り装置か E8 フィーダー無料条件で栽培の広範な配列の直接 LIF 3i 文化は、素朴な鱗のような状態に迅速かつ一括返還を実現しました。ただし、直接 LIF 3 i 素朴な返還が遺伝的多様なドナーの背景から生じる固有のゲノムとリネージュ プライミングの変動のためのいくつかの不安定な従来の hPSC ラインで効率的にあります。
したがって、LIF 3i 手法の有用性を広げるため開発された段階的最適化と記載はほぼ従来 hESC や無料の遺伝子によるラインと普遍的な素朴な復帰をフィーダーに培養可能します。このじっさい素朴な復帰メソッドが 2 つ追加小さな分子 (LIF-5i) プロテインキナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (増強と LIF 3i カクテルを補足する従来の hPSC の一時的な初期文化ステップを採用していますpurmorphamine) 信号。LIF-5i で従来の hPSC の 1 つの初期の通路はバルク量でその後の安定した LIF 3i 復帰にそれらを適応させます。初期の LIF 5i 適応は、E8 または送り装置 (LIF-3 i だけでその後安定的、連続的な通路) の前に上に成長した従来の hPSC の初期の単一細胞のクローン増殖を大幅強化します。適応従来の hPSC ライン最初 LIF 5i で 1 つの通路に耐える以降一括クローン継 LIF 3i 条件で素朴な戻す細胞のまれな安定したコロニーのルーチンの使用の subcloning を選択しする必要がなくなります、抗アポトーシス分子または Rho 関連タンパク質キナーゼ (ロック) 阻害剤。
LIF 3i メソッドを正常に安定して拡大し、幅広いレパートリーを維持に雇われている > の 30 の独立した、遺伝的に多様な従来の hPSC ライン > 非酵素または酵素の解離のいずれを使用して 10-30 通路と染色体の誘導の証拠なしやエピゲノム異常、インプリント遺伝子の遺伝子異常を含みます。さらに、シーケンシャルの LIF 5i/LIF 3i 文化はリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させることによって従来の hPSC ラインの幅広いレパートリーの機能的な多能性を向上させるだけの素朴な復帰方法これまで報告されているとその多能性分化能が大幅に向上。素朴な復帰メソッドの LIF 3i 消去固有インター ラインの血統で、プライミング、従来の hPSC ラインの分化の変動と再生医療と細胞療法のアプリケーションの偉大なユーティリティ。

<table><tbody><tr><td>anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>561716</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti- TFCP2L1 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA029708</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-beta-Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6276</td><td>use at 1:5000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-CD146 antibody,&nbsp; PE conjugated&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody, APC conjugated</td><td>eBioscience</td><td>17-0319-42</td><td>use 2&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 microbead kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>anti-NANOG antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109250</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-NR5A2 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA005455</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4695</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9145</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td><td>Agilent</td><td>E0432</td><td>use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435A</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC1435G</td><td>use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9139</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-STELLA/DPPA3 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4388</td><td>use at a 1:50 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC4770R</td><td>use at&nbsp; a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0068</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560193</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560161</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>APEL2-Li</td><td>StemCell Technologies</td><td>5271</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere dilution buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td>dilutent for Vitronectin XF&trade; matrix</td></tr><tr><td>CF1 mouse</td><td>Charles river</td><td>023</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&amp;D System</td><td>L5283</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>confocal microscope system</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>cord blood CD34+ derived iPSC line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>also referred as 6.2 line</td></tr><tr><td>Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Countess&nbsp; cell counting chamber slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 (E8) medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Stemgent</td><td>04-0025</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Gelatin (porcine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>resuspend in water and sterilize with an autoclave</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene cryogenic vials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Stemgent</td><td>04-0009</td><td>reconstitute at 10mM in DMSO</td></tr><tr><td>recombinant human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>AF-120-14E</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4</td><td>Peprotech</td><td>120-05ET</td><td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td></tr><tr><td>recombinant human FGF-basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>1

従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

素朴なひと多能性幹細胞 (N hPSC) 機能改善された再生医療全体への影響があります。このプロトコルの目的は、効率的にリネージュ プライミング、従来人間多能性幹細胞 (hPSC) を機能改善された世間知らずのような多能性フィーダー無料またはフィーダーに依存した条件で保持される元に戻すです。復帰するこの化学世間知らずの手法では古典的な白血病抑制因子 (LIF)、GSK3β、MEK/ERK 抑制がカクテル (LIF 2 i) の時にタンキラーゼ阻害剤 XAV939 のみと補われる (LIF 3 i)。LIF 3i 生化学的解析、転写を採用し安定した多能性状態と人間着床前胚盤葉上層のエピジェネティックな機能を従来の hPSC を元に戻します。この LIF 3i メソッドは、ヒト胚性幹細胞 (hESC) と transgene 無料ひと誘導多能性幹細胞 (による) 線の広いレパートリーの中で再現性の高い最小限細胞培養操作が必要です。LIF 3i 方法では分化; 前に再プライミングの手順は必要ありません。N hPSC は非常に高い効率を直接区別できる保守核型とエピゲノム安定性 (捺印された遺伝子を含む)。、法の普遍性を向上させるため、従来の hPSC は蛋白質キナーゼ (フォルスコリン) とソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) のシグナルを増強する 2 つの追加小分子添加 LIF 3i カクテルで培養最初。この簡単な LIF 5i 適応ステップ大幅に従来の hPSC の初期のクローン性増殖を強化し、LIF-3i バルク量で一人でこうしてピッキング/subcloning 珍しい N-hPSC のための必要があるとその後素朴な復帰することができるようにその後の植民地。LIF 5i 安定 hPSCs その後に保持されます LIF 3i 抗アポトーシス分子を必要とせず単独で。最も重要なは、LIF 3i 復帰は著しくリネージュ プライミング遺伝子発現を減少させると分化のインター ライン変動をよく消去によって向上従来 hPSC の幅広いレパートリーの機能的な多能性独立した hPSC ラインの中で観察。LIF 3i 戻った N hPSC の代表的な特徴は、リネージュ プライミング対同質遺伝子 hPSC の機能比較のため、そして実験的戦略です。素朴なような状態のとおりです。

このプロトコルには、両方のフィーダーに依存し、フィーダー独立系統プライミング従来 hPSC 文化 (図 1) で LIF 3i と効率的な世間知らずのような返還が最適化されます。詳細なプロトコルに記載、アウトライン LIF 3i いずれかのフィーダーに依存または従来フィーダー無料 hPSC 条件 (例えばE8 中) から始まって順次適応。
代表結果いくつかの従来の hESC の LIF 3i の復帰のため、transgene 無料による線が図 1-3に表示されます。これらの典型的な結果は市販 hESC ライン H9、検証することができます。 または市販の transgene 無料コードの血由来 episomal によるライン (6.2) ・ ザンビディス研究室8,</s...

効率的な一括、および急速な化学復帰従来系列プライミングひと多能性幹細胞 (hPSC) の epigenomically 安定した素朴な着床前胚盤葉上層のような多能性状態にするためのプロトコルを提案します。このメソッド結果減少系統プライミング遺伝子発現と分化多能でマーク付きの改善で従来の hPSC ラインの幅広いレパートリー。

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

LIF-3i法は、従来型のヒト多能性幹細胞を、ヒト着床前上皮芽葉の生化学的、転写的、およびエピジェネティックな特徴を有するより原始的な多能性状態に戻します。この方法は、系統プライミング遺伝子発現を減少させ、独立したhPSC株間で一般的に観察される誘導分化のインターライン変動性を消去することで、従来型のヒト多能性幹細胞の機能性を向上させます。この方法を使用すると、化学的に戻されたヒト多能性幹細胞は、長期的な培養後も、インプリンティングされた遺伝子座を含め、核型およびエピジェノムの安定性を維持し、リプライミング段階を必要とせずに、より高い効率で直接分化させることができます。LIF-3i法は、初期のヒト発生生物学の研究に新しい道を開き、ヒト多能性幹細胞の分化、遺伝子ターゲティング、および種間キメラの生成を改善することで再生医療を進歩させる可能性があります。プロトコルを開始するには、有効な正常な核型を持つ従来型のヒト多能性幹細胞またはhPSCを、マウス胚由来線維芽細胞またはMEFベースのフィダー培養システムまたはフィダーフリー培養システムでの共培養で維持および増殖させます。以前に準備したゼラチン化された6ウェルプレートにMEFフィダーを少なくとも1日前に準備します。従来型のhPSC培養が約50％のコンフルエンスに達したら、標準的なhESC培養培地を、各ウェルあたり2ミリリットルの白血病抑制因子5iまたはLIF-5i培養液に置き換えます。CO2インキュベーターで、従来型のhPSCとMEFをLIF-5iで最大2日間培養および維持します。系統的安定化とLIF-3iでの安定な戻しに備えて、LIF-5i培養液を毎日取り替えます。フィダーフリーの従来型培養では、翌朝までLIF-5iのみでhPSCを一晩培養します。分離前に、LIF-5iに適応した従来型のhPSCをPBSで一度洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの細胞分離試薬を加えます。次に、CO2インキュベーターで37度で5分間プレートをインキュベートします。インキュベーション後、ピペットで細胞をゆっくりと単一細胞懸濁液に分散させます。細胞懸濁液をhESC培地で少なくとも2倍希釈し、無菌の15ミリリットル円錐管に回収し、ピペッティングでゆっくりと細胞を分散させて単一細胞懸濁液を取得します。細胞を300gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引して廃棄し、細胞ペレットを1〜2ミリリットルのLIF-5i培養液で再懸濁します。次に、細胞を数えます。事前にプレートに塗布した6ウェルのMEFプレートをPBSで2回、各ウェルあたり2ミリリットルで洗浄します。1〜2倍10の6乗の細胞を2ミリリットルのLIF-5i培養液にPBSで洗浄したMEFプレートの1ウェルに分配します。プレートをCO2インキュベーターに入れます。翌日、プレートをゆっくり

chemical-reversion-conventional-human-pluripotent-stem-cells-to-nave

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

私たちは、発生生物学からの知識と公開された研究に基づいて、ヒト胚性幹細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方からA9中脳ドーパミン作動性ニューロンを効率的に生成するための最適化されたプロトコルを開発しました。これは、パーキンソン病の疾患モデリングと細胞補充療法に役立ちます。...

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

私たちは、レンチビラールベースの再プログラムされ、特徴付けられた因子フリーのヒト誘導多能性幹細胞を導き出し、推定される臨床グレードの状態に変換するためのプロトコルを記述します。...

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal...

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

ヒト多能性幹細胞(hPSC)から分化した細胞型を生成することは、大きな治療上の約束を持っていますが、依然として困難なままです。PSCは、多くの場合、適切な信号のセットで刺激された場合でも、区別することができない固有の不能を示します。ここでは、さまざまな PSC...

DMSOを用したヒト多能性幹細胞の一過性治療による分化を促進

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

学ぶLIF-3i法による従来のヒト多能性幹細胞のナイーブ様状態への復帰法。MEF共培養とフィーダーフリー系を用いて分化効率を向上させ、系統間変動を減少させる。再生医療への応用が期待される。

従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

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