Name: マウス気晴らし骨形成モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T12:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: 学ぶマウス脛骨気晴らし骨形成モデルによる骨再生メカニズムの詳細解析法。カスタムメイドディストラクターを用いた外科的手法で、組織工学と硬軟組織再生の治療戦略開発に貢献します。

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著者は、この研究を完了するための励ましを提供するため加藤真紀子さんをありがとうございます。マウスの住宅の実験動物部門と医療工学研究、名古屋大学大学院医学部、また感謝します。

動物のケアと当院の利用委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。手続きの前にすべての器具を滅菌します。
1. 金型のカスタムメイドの妨害を作成するための準備
<ol><li>2 不完全なリング (外径 20 mm; 内径 10 mm)、パラフィン ワックス (145 mm × 74 mm) の 1 つのシートでのエヴァンス ワックス彫刻家を使用しての妨害の一部であるを確認します。<ol>
<li>同じ作品の 4 を作る。ガスバーナーで加熱したワックス ヘラを使用します。厚さの 5 mm. 拡大ネジや針、8 mm × 2 mm、エバンス ワックスの彫刻家 (図 1 a、1 b) にそれぞれ 5 mm × 2 mm のための提供するスペースの 4 つのリングをスタックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリコーン印象材でワックス パターンを埋め込み、樹脂リング (図 1C) のための金型を作成します。</li>
	<li>シリコーン印象材 (室温で約 5 分) を硬化後のワックス パターンを削除します。</li>
</ol>2. オーダーメイドのディス トラクターの生産
<ol><li>シリコーン型に薄く、均等に石油ゼリーを適用します。重合レジンの 3 g を混ぜるし、すぐにシリコーン型にそれを注ぐ。室温 (RT) で 5 分に設定します。</li>
	<li>重合樹脂リングを金型から外し、超硬バーと (約 1 分) のバリ除去する歯科用マイクロモータ ポーランド語。2 つの樹脂リング各特注ディス トラクターに必要です。<ol>
<li>樹脂リング (図 1D) の必要な数を作成する手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ユーティリティ ワックスと樹脂リングを修正し、透明樹脂で完全に拡大ネジの外側を保護する約 2 mm のギャップを残します。室温 5 分樹脂を設定します。重合が完了したら、拡張ねじノブ (図 1E) を削除します。</li>
</ol>3. 外科手術
<ol><li>8 週齢雄マウスを使用します。</li>
	<li>メデトミジン塩酸 0.3 mg/g で、4 mg/kg、ミダゾラム、5 mg/kg 体重でブトルファノール酒石酸の腹腔内注射で麻酔を誘導します。<ol>
<li>慎重に剃ると 10% のヨード、外科領域で消毒して、右下肢で 0.5% リドカイン塩酸塩を管理.</li>
	</ol>
</li>
	<li>縦切開 (長さ約 15 mm) 右の第 15 メスで足を下げるを作る。にべもなく骨膜のすべてを削除しないように注意して、基になる筋肉を区切ります。腓骨に容易に達するために外側からのアプローチします。腓骨をハサミでカットします。</li>
	<li>狭いの薄い滅菌ピンセットで足首をつかみ、かかとから約 5 mm の骨に穴を作るため滅菌 27 G 針を使用します。針は、皮膚、骨と順に皮膚浸透する必要があります。針が浸透し、針が約 15 mm、ニッパーでチップと根をカットします。<ol>
<li>同様に、2-3 mm 程度の近位の別の穴を作る。足首周りを保持し、同じように膝から下の 2 つの 25 G 針を渡します。針を貫通後、ニッパー (図 1F) でのヒントを根をカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>延長方向に平行になるよう、カスタムメイドのディス トラクターを配置します。針とデバイスをデバイスの溝を埋めるに十分な重合レジンで固定します。重合 (約 5 分) を完了するを待つ (図 1G)。</li>
	<li>周囲の組織を損傷しないように注意します。食塩 (1-2 mL) を適用している間非常に薄い切削ディスクを使用して脛骨の骨幹の中央をカットします。</li>
	<li>4-0 ナイロン縫合糸で傷口を閉じます。</li>
	<li>操作後すぐに鎮痛のためブプレノルフィン 0.1 mg/kg の皮下注射を与えます。ブプレノルフィン術後 7、必要に応じてその後を介してすべての 12 h を続行します。</li>
</ol>4. 気晴らしプロトコル
注: 遅延期間と気晴らし率に様々 な報告がありますが、ここでは、代表的なプロトコルが表示されます。
<ol><li>5 日間の待ち時間後、速度 0.2 mm/12 h で気晴らしを開始します。拡張機能の急速な拡大ネジに接続されているピンを使用します。拡張子ネジ (図 1E) に接続されている黄色の矢印の方向にピンを移動します。</li>
	<li>麻酔は、拡張機能の中には必要ではありません。小指と手のひら、尾を押し、人差し指と親指で拡張デバイスを修正します。</li>
	<li>(1/4 回転で 0.2 mm) の拡張子を実行します。3.2 mm のギャップの合計になります 8 日延長を続けます。</li>
</ol>5. 分析
<ol><li>撮影解析: 拡張の完了後、2.0% イソフルランを用いた全身麻酔下で腹部の骨再生を評価します。 注: 拡張デバイスの位置に関して注意しましたが、簡単な撮影と接続されているデバイスをも評価することが可能。</li>
	<li>組織学的解析: 装置を慎重に削除サンプリング中に破壊気晴らしサイトが生じないようにします。室温で 24 時間 10% 中性緩衝ホルマリンでサンプルを修正します。4 ° C で一晩モースのソリューション (クエン酸ナトリウム 10%、20% ギ酸) とめし</li>
</ol>

<ol><li>Watson, J. T. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/jaaos/Fulltext/2006/00001/Distraction_Osteogenesis.37.aspx">Distraction osteogenesis.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues%3A+Part+II.+The+influence+of+the+rate+and+frequency+of+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18184809">Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).</li>
<li>Fujio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+enhances+distraction+osteogenesis-mediated+skeletal+tissue+regeneration+through+the+recruitment+of+endothelial+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors.</a> Bone. 49 (4), 693-700 (2011).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+expression+during+mandibular+distraction+osteogenesis%3A+evidence+for+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction.</a> Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).</li>
<li>Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-+related+kinase+and+bone+morphogenetic+protein+expression+during+distraction+osteogenesis+of+the+mandible%3A+in+vivo+evidence+of+mechanotransduction+mechanism+for+differentiation+and+osteogenesis+by+mesenchymal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).</li>
<li>Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11062353">A murine model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 27 (5), 661-665 (2000).</li>
<li>Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+and+molecular+analyses+of+distraction+osteogenesis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).</li>
<li>Carvalho, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiogenesis+in+a+murine+tibial+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 34 (5), 849-861 (2004).</li>
<li>Osawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+FGFR3+promotes+bone+formation+via+accelerating+endochondral+ossification+in+mouse+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 105, 42-49 (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

大型動物実験モデルとして使用する場合既製拡張デバイスを使用できますと良い固定を取得し、拡張操作自体と拡張量評価に簡単です。ただし、マウスを実験モデルとして使用する場合は、いくつかまたはすべての装置を開発する必要は。Isefukuらとテイらデバイス、マウス モデル7、8を作成します。Carvahjoらは、既製の拡張デバイスの固定を含む方式を採用 (ディス トラクターを追跡: KLS マーティン) 合を持つワイヤー9。マウスはモデル拡張デバイスの既存の製品を使用して、固定方法を工夫することを作成することもできます。このアプローチは、拡張デバイスを製造し、拡張子を実行拡張する容量を評価する簡単になります。また、脛骨の分節欠陥モデルは、同じデバイスを使用して作成される可能性が期待されます。また、欠陥の長さは 0.2 mm の段階で調整することができます、したがって、デバイスが汎用性であると見なされます。
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仮骨延長法 (DO) は、様々 な手足の長さの不一致、骨欠損四肢奇形1などの骨格障害の確立された治療方法です。このユニークな治療戦略は、イリザロフによって提案された「緊張ストレスの原理」に基づきます。メソッドでは、成熟した骨が形成された2になるまで、待機時間、アクティブな気晴らしのため数週間、統合の数ヶ月の数日が必要です。
血流3,4機械的刺激5,6の閉塞のためにローカル低酸素の条件は、かの治癒過程で特に重要です。低酸素血症による血管新生は、酸素、栄養素、可溶性因子、血流を介してローカル組織の修復に必要な細胞を運ぶ。拡張操作による機械的刺激は、間葉系幹細胞、骨の形成、石灰化、改造の分化などの生物学的反応を引き起こします。シリアルの行う治療は、硬組織だけでなく、神経、筋肉、血管、および幹細胞移植を必要とせず、皮膚組織などの軟組織の形成を可能します。したがってはモデルは、さまざまな組織の再生を分析するための優れたモデルであると見なされます。
ウサギと犬は、DO の基本的な研究の最も広く使用される動物しかし、これらの動物に使用できるほとんどの解析ツールがありません。マウスはモデルの使用より詳細な分析を促進します。ノックアウト マウスを用いた実験に特に適しています。ただし、実験動物としてマウスを使用する場合、拡張デバイスを作成する必要があります。ここでは、現在マウス脛骨を行うモデルを開発した技工ツール以前の研究で使用されている手法を使用して作成されたカスタム メード ディス トラクターを使用します。

<table><tbody><tr><td>パラフィンワックス</td><td>YAMAHACHI DENTAL MFG. CO.</td><td>-</td><td>レジンリング用金型の調製用</td></tr>:<tr><td>ラボコーンパテ</td><td>GCコーポレーション</td> <td>-</td><td>レジンリング用金型の調製用</td></tr><tr><td>ユーティリティワックス</td><td>GCコーポレーション</td> <td>-</td><td>レジンリング用金型の調製用</td></tr><tr><td>拡張ネジ</td><td>Ortho Dentaurum</td><td>600-301-30</td><td>カスタムメイドのディストラクタ部品</td></tr><tr><td>ユニファストIII</td>.<td>ジーエシーコーポレーション</td> <td>-</td><td>即時重合樹脂 特注ディストラクタの成分</td></tr><tr><td>オルトクリスタル</td><td>NISSIN</td><td>-</td><td>透明樹脂 特注ディストラクタの成分</td></tr><tr><td>25G ニードル</td><td>テルモ</td><td>NN-2516R</td><td>特注ディストラクタ用</td></tr><tr><td>27Gニードル</td><td>テルモ</td><td>NN-2719S</td><td>特注ディストラクタ用</td></tr><tr><td>ICR マウス</td><td>中部化学 (株)</td><td></td>実験<td>動物</td></tr><tr><td>ソムノペンチル</td><td>共立製薬</td><td></td>-<td>ペントバルビタール ナトリウム</td></tr><tr><td>塩 イソフルラン</td><td>富士フイルム和光純薬 099-06571</td><td></td><td>イソフルラン吸入液</td></tr></tbody></table>

マウス気晴らし骨形成モデル

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

仮骨延長法 (DO) は、細胞移植なし骨格組織再生を含む外科手術です。行うモデルは、次の 3 つの段階: 骨切り術と外部ディス トラクター; の配置後潜伏段階気晴らし段階前記分離骨端が徐々 にかつ継続的に気を取られて;統合段階。このカスタムメイドの妨害を行うのために使用は、2 つの不完全なアクリル樹脂リングと拡大ネジで構成されます。プロセスは、シリコーン印象材と金型を作るし、カスタムメイドのディス トラクターを作成によって開始されました。歯科用レジン製シリコーン印象材の型枠に注ぎ、カスタムメイドのディス トラクターに必要な不完全な樹脂リングを作成する重合するようになりました。これらのリングは、透明樹脂を用いた拡大ネジで修正されました。この方法で作成したオーダーメイドのディス トラクターは、マウスの脛骨についていた。脛骨を修正しました、近位 25 G 針の 1 つのペアを使用してデバイスに 1 組 27 G 針の遠位, アクリル樹脂。5 日間の待ち時間後気晴らしは 0.2 mm/12 h の速度で開始されました。3.2 mm のギャップの合計で 8 日間、続けた延長します。マウスが気晴らしの後 4 週間を犠牲になった。撮影と組織の両方を使用して気晴らしギャップの骨形成が確認されました。

図 1 aおよび1 bは、パラフィン ワックスと不完全なリング (外側直径、20 mm 内側直径、10 mm; 厚み 5 mm) を提示します。シリコーン印象材に埋め込まれた 2 つのワックス パターンと樹脂リング (図 1C) の型が形成されました。重合樹脂はこの金型を投入した直後に、樹脂リング (図 1D) が得られました。カスタムメイド ディス トラクターは、2 つの樹脂リングと拡大ネジ (図 1E) を組み合わせることによって作成されました。図 2Aモデルで気晴らしの後 4 週間で典型的な撮影結果を提示します。新たに形成された骨...

カスタムメイド ディス トラクターを使用して開発されたマウス脛骨気晴らし骨形成モデルを提案します。解析対象としてマウスの使用は、研究を推進するため有利です。

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

この方法は、硬質および軟部組織再生分野における主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、マウスを使用することで骨再生の詳細な分析が可能になる点です。完全に麻酔付きの大人のマウスから始めます。慎重に剃り、10%ヨウ素溶液で外科領域を消毒します。次いで、右下肢に0.5%リドカイン塩酸塩を投与する。その後、右下肢に15ミリメートルの縦方向皮膚切開を15個のメスで行った後、下の筋肉をぶっきらぼうに分離し、すべての骨膜を取り除かないように注意する。その後、はさみでフィブラを切ります。足首を細く細い鉗子でつかみ、27ゲージの針を使ってかかとから約5ミリメートルの骨に穴を開けます。針は、その順序で皮膚、骨、および皮膚を貫通する必要があります。針が完全に貫通したら、針が約15ミリメートルになるようにニッパーで先端と根を切ります。同じ方法で、約2〜3ミリメートル近位に別の穴を作ります。次に、足首を持ち、同じように膝の下に25ゲージの針を渡します。針が貫通した後、ニッパーで先端と根を切ります。同じ方法で、約2〜3ミリメートル遠位で別の穴を作ります。カスタムメイドのディストラクタを配置して、拡張方向に平行になるようにします。針とデバイスを、デバイスの溝を満たすのに十分な重合歯科樹脂で固定します。重合が完了するまで待ちますが、約5分かかります。そして、周囲の組織に損傷を与えないように非常に注意しながら、生理食い溶液を塗布しながら非常に薄い切断ディスクを使用して脛骨の糖尿病の中間を切断する。4-0ナイロン縫合糸で傷口を閉じます。手術直後に鎮痛のためにブプレノルフィンの皮下注射を与える。遅延期間と気晴らし率に関するさまざまなレポートがありますが、ここでは代表的なプロトコルが示されています。5 日間の待機時間の後、気晴らしの手順を開始します。延長には、急速拡張ネジに取り付けられたピンを使用してください。延長ねじに付けられた黄色い矢印の方向にピンを動かします。小指と手のひらで尾を持ち、人差し指と親指で延長装置を固定します。1/4ターンの場合、黄色の矢印0.2ミリメートルの方向にピンを移動して延長を行います。8日間、12時間ごとに0.2ミリメートルの速度で延長を続け、合計3.2ミリメートルのギャップになります。この画像は、モデルの気晴らしの後4週間で典型的なX線写真の所見を示しています。気晴らしの部位に新しく形成された骨が見られる。ヘマトキシリンとエオシン染色結果がここで見られます。新たに形成された骨橋が観察され、新たに形成された骨は天然骨と容易に区別できた。カスタムメイドのディストラクタを用いて開発されたマウス脛動DOモデルを発表しました。マウスの DO モデルを使用すると、より詳細な分析が容易になります。ノックアウトマウスを用いた実験に特に適している。

Research

JoVE Journal

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マウス気晴らし骨形成モデル

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