Name: 生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶ新生児マウスの結腸細胞フォトラベリング法により、腸管外サイトへの免疫細胞動態を追跡する手法です。宿主とマイクロバイオームの相互作用を解明し、新生児期の免疫応答理解に貢献します。

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ニーチャ ジャイナ教は、NIH/NIAID キャリア遷移賞 1K22AI116661-01 によって支えられました。

動物のすべてのプロシージャの承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) マサチューセッツ総合病院に準拠して行った。
注意: このプロトコルは、クラス 3 b レーザー (LG3) の使用を含みます。このレーザーを動作しているとき、LG3 レーザー安全ゴーグルを使用常にする必要があります。怪我のリスクを避けるために適切な訓練と安全のガイドラインに従わなければなりません。
1. デザインとレーザーのアセンブリ
<ol><li>光発光ダイオード (LED) を接続 (405 nm、19.3 mW、ファイバー結合型 1400 mA)、LED ドライバー経由で来る 4 ピン M8 コネクタ ケーブルに接続されている LED。慎重に接続を固定するネジを締めます。</li>
	<li>オプトジェネティクス パッチ ケーブルを LED に接続する前に、コネクタを保持に LED の開放ができるように光目に見える障害物がないです。必要に応じて任意の障害物を排除し、オプトジェネティクス パッチ ケーブルを開口部に挿入する穴に吹く。</li>
	<li>オプトジェネティクス パッチ ケーブル コネクタ スリーブの両端にカニューレを挿入することによってファイバー光カニューレに接続します。パッチ ケーブルにコネクタ スリーブの他の端を接続します。 接続をセキュリティ保護がない曲げたりカニューレで光ファイバーを破るように注意する十分な圧力を適用します。 注: 壊れやすい繊維ファイバー カニューレは、レーザーが使用されていないときに保護キャップで覆われて。</li>
	<li>LED ドライバーを 0 と電流 1.2 a. に設定で連続調整ノブと連続波 (CW) モードに設定します。</li>
</ol>2. 大腸内のセルの光電
注: 雌雄マウスは出生後 1-2 日 intracolonic 405 nm の光にさらされたが 1 週齢の前に犠牲になった。
<ol><li>コンセントへのアクセスと暗い場所を確保します。LED ドライバーをコンセントに差し込みます。 注: この手順を実行最小の白色光で周囲の光にマウスの長時間露出がセルの不要な光変換を引き起こす可能性があります。赤い光は、代替として使用されます。 注意: 次の手順は、麻酔動物の使用を含みます。麻酔薬の管理では、クラス II フードまたは別の適切な清掃システムを使用して行われます。麻酔薬の吸入は、めまい、眠気、またはも無意識のうちにあります。</li>
	<li>100 %o2 [誘導] ボックスで 4-5% イソフルラン暴露によるマウスを麻酔します。(応答なし) 後肢をしっかりとつまんで適切な麻酔深度を確認します。約 2% イソフルランに鼻の円錐形によって麻酔を維持します。適切なフードや麻酔の清掃装置の使用によってハンドラー イソフルラン暴露を防ぐ。</li>
	<li>首筋に 1 を使用して intracolonic 露出のため麻酔下マウスの位置手の人差し指と親指で軽くマウスの背面。マウスを裏返し、腹部を公開します。マウスは、そのピンクの色を失うことを開始した場合またはその呼吸速度が遅いを開始した場合は、グリップを緩めます。マウスの尾をリングと小さな指の間を固定します。</li>
	<li>もう片方の手には、カニューレから保護キャップを取り外します。維持しながらマウスの正中線に平行のカニューレの長軸そっと挿入肛門からファイバー光カニューレ コロン、光ファイバーのすべて 5 mm が、マウスの内部。 注: この手順を実行ゆっくりと大腸の壁に穴を開けるように注意。分揺らすとカニューレのねじれは、コロン進出を支援します。</li>
	<li>安全ゴーグルをドンし、最大値 (すべての方法時計回り) に現在のレーザーを増やします。マウスの半透明の腹部を見ることによって紫外線の存在を確認します。 注: LG3 レーザー安全メガネは、視認性を大幅に減少します。ゴーグルを着用し、レーザーをオンに同僚 (身に着けている保護具) の支援を持っています。</li>
	<li>公開 2 分約 1 mm のカニューレの撤回の合計のためのレーザ光にコロンすべての 30 s、光にさらされる内腔領域を最大化します。2 分の最後に、レーザーをオフにします。</li>
	<li>ゆっくりとマウスからカニューレを削除します。空暖かいケージ内麻酔から回復した後、マウスを家のケージに戻ります。</li>
</ol>3. 腸管リンパ球の分離
<ol><li>ハンクの平衡塩類ソリューション/子牛血清 (HBSS/CS) バッファーの 1 L、上皮ストリップ バッファーの 200 mL、500 mL 洗浄メディアのエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 200 mL を準備-無料洗浄メディア。 注: 試薬ボリュームの 9 のサンプル サイズが計算されます。<ol>
<li>CS の 50 mL を HBSS の 950 mL に追加して HBSS/CS のバッファー (HBSS; 5 %cs) をします。氷の上保管してください。</li>
		<li>185 mL に CS、1 M DTT、0.5 M の EDTA の 2 mL、3 mL の 1 M HEPES バッファーの 200 μ L の 10 mL を追加して [HBSS; 5 %cs; 1 mM ジチオトレイトール (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) (pH 7.2 7.5)] 上皮ストリップ バッファーを準備します。HBSS。37 ° C の水浴中上皮ストリップ バッファーを配置します。</li>
		<li>HBSS 494 mL に CS の 5 mL と 0.5 M の EDTA の 1 mL を追加することによって洗浄メディア (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) を作る。室温で保管してください。</li>
		<li>HBSS 195 mL に 2 mL CS と 1 M HEPES 3 mL を追加して EDTA 無料洗浄メディア (HBSS; 1 %cs; 15 mM HEPES) を準備します。室温で保管してください。</li>
		<li>FACS バッファーを作る [リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 (pH = 7.2); 2 %cs] 490 mL の PBS に CS の 10 mL を追加しています。氷の上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>70 μ m セル ストレーナー 60 × 10 mm 培養皿の中に配置することによって組織のコレクション料理を準備します。皿に HBSS/CS バッファー (HBSS; 5 %cs バッファー 3.1.1 の手順で作った、氷に格納) の 10 mL を追加し、氷の上に置きます。</li>
	<li>安楽死、マウスを介して吸入イソフルラン麻酔薬の適切な清掃を使用しての過剰摂取 (約 3 分の露出に > 4% イソフルラン部屋の空気または 100% O2)。呼吸の明白な停止後および動きを反射、後肢の足をしっかりとつまんで深い痛みの有無を確認します (推奨鉗子を使用して)。外科はさみのペアまたは新しいストレートかみそりを使用して斬首による安楽死を確認します。 注: 頚部転位はこのステップ サイズと動物の年齢のための推奨されません。これらのメソッドは、安楽死の 2013 AVMA のガイドラインと一致しているし、MGH IACUC によって承認されました。</li>
	<li>きれいな鉗子、はさみを使用して、腹部を開くコロンを収穫します。コロンを公開するマウスの腹部の 1 側に腸を反映してください。最初 transecting (肛門) に向けてのすぐ遠位のそれによって全体のコロンを削除盲腸に到達します。その後、しっかりと把握しながら鉗子、大腸は直腸に尿道を通って削減するはさみを使用します。できるだけ肛門に近くとしてコロンをカットします。コロンを削除した後、脾臓を収穫 (4.1 4.2 下記手順を参照)。 注: 光電プロトコルのみ新生児のコロン (繊維ファイバー カニューレの 5 mm) の ~ 25% をターゲットに中、全体のコロンは細胞単独で支援するために収穫されます。</li>
	<li>大腸のうち、乾燥したペーパー タオルの上に内容をプッシュする鉗子を使用して、コロンをきれい。培養皿のカバーの貼り付けにみじん切りにコロン、ペトリ皿にセル ストレーナーにこのペーストを転送するかみそりの刃を使用して組織をホモジナイズしてください。</li>
	<li>こし器にきれいな 8 mm 長い電磁攪拌棒を追加し、9 位置磁気スターラー プレートに皿を置きます。電磁攪拌バー速度を 800 rpm にセット、室温で 5 分間細胞を孵化させなさい。バッファーを破棄し、HBSS/CS (、HBSS; 5 %cs バッファー 3.1.1 の手順で作った、氷に格納) の 10 mL を使用して洗浄を繰り返します。洗浄の最後にバッファーを破棄します。</li>
	<li>セル ストレーナーを 10 mL の prewarmed 上皮ストリップ バッファー (、HBSS; 5 %cs; 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 のステップで行われた、37 ° C の水浴中に格納された 15 mM HEPES [pH 7.2 7.5] バッファー) を追加することによって上皮細胞を解離して、3 で 30 分間 800 rpm で攪拌7 ° C の定温器。孵化の最後に、きれいな 15 mL チューブにある上皮部分で濃縮バッファーを転送します。 注: 上皮と関連付けられている細胞 (小腸上皮細胞や腸管上皮リンパ球) に放出されるバッファー、そのまま粘膜の細胞がこのステップ11セル ストレーナーのまま。<ol>
<li>遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 700 x g で豊かな腸上皮分数 (Iel)。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。3.15 の手順で使用するため氷の上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>セル ストレーナー 2 内粘膜の一部を洗って HBSS/CS と x。セル ストレーナーに HBSS/CS ソリューション (HBSS; 氷の上に格納されているステップ 3.1.1 で作られた 5 %cs バッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 5 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。</li>
	<li>サンプル 2 を洗う洗浄メディアで x。セル ストレーナーを洗浄メディア (HBSS; 1% CS 3.1.3 の手順で、室温で格納された 1 mM EDTA バッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 15 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。<ol>
<li>洗浄メディアを使用した後 3.14 の手順で使用するため氷の上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプル 2 を洗う HBSS x/CS. セル ストレーナーに HBSS/CS バッファー (HBSS; 氷の上に格納されている、手順 3.1.1 5% の CS のバッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 5 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。</li>
	<li>洗浄バッファーの EDTA 無料のティッシュを孵化させなさい。セル ストレーナーに 10 mL の洗浄バッファーの EDTA 無料 (HBSS; 1% CS 3.1.4 の手順で、室温で格納された 15 mM HEPES バッファー) を追加し、プレート攪拌しなくても室温で 10 分間インキュベートします。このステップの終わりにバッファーを破棄します。</li>
	<li>サンプル 2 を洗う HBSS/CS と x と酵素液を準備します。HBSS/CS (HBSS; 5 %cs バッファー、氷の上に格納されている手順 3.1.1) 10 mL を追加セル ストレーナーをバッファーに格納し、37 ° C の定温器で 10 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。<ol>
<li>酵素液を準備 (EDTA 無料洗浄バッファー; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL コラゲナーゼ) 2 番目の洗浄期間中: 9 mg を追加 DNase の私と 15 mg EDTA 無料 90 mL に凍結乾燥のコラゲナーゼの洗浄バッファー。室温でソリューションを保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>粘膜固有層リンパ球 (Lpl) を取得するセル ストレーナー内粘膜画分を消化します。酵素溶液 10 mL を追加 (EDTA 無料洗浄バッファー; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL コラゲナーゼ バッファー 3.12.1 の手順で行い、常温保存) セル ストレーナーを 37 ° C の定温器で 45 分間 800 rpm で攪拌し、。 注: Lpl 酵素消化後にソリューションにリリースされます。<ol>
<li>セルを含む酵素液を収集し、50 mL の円錐管に新しいセル ストレーナー フィルターを適用します。</li>
	</ol></li>
	<li>酵素液でコラゲナーゼの活性をブロックするフィルターが適用されたセルに 20 mL (1 mM EDTA; 1 %cs、HBSS バッファー 3.1.3 の手順で作られ、ストアド手順 3.9.1 で氷の上) 冷たい洗浄メディアを追加します。室温で 6 分間 700 x g でチューブを遠心します。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで Lpl を含むペレットを再懸濁します。</li>
	<li>(ステップ 3.7.1) から IEL と LPL (ステップ 3.14) から分数を組み合わせるし、フローサイトメトリーによる解析のための抗体の蛍光標識と、それらを染色 (手順 5. を参照)。 注: IEL と LPL の分数は、区画情報が必要な場合別途染色する場合があります。</li>
</ol>4. 脾臓リンパ球の分離
<ol><li>微量遠心チューブに FACS バッファーの 500 μ L を追加することによって、コレクションの管を準備します。氷の上保管してください。</li>
	<li>コロン (ステップ 3.4) を取り出したら、全体の脾臓を収穫し、コレクションの管にそれを置きます。氷の上のティッシュを格納します。</li>
	<li>電気組織ホモジナイザーを使用して、300 x g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間のサンプル約 1 分遠心遠心チューブに脾臓を均質化します。</li>
	<li>赤血球細胞の換散を実行するには、浸透圧の溶解によって細胞死を開始するアンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーの 500 μ L のサンプルを再します。サンプルは室温で 1-2 分間インキュベートし、FACS バッファーの 725 μ L で再停止しなさいそれを許可します。</li>
	<li>300 × g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間のサンプルを遠心します。500 μ L の FACS バッファーでペレットを再懸濁し、新しい微量遠心チューブに 40 μ m 携帯こし器を通ってそれをフィルターします。新しい微量遠心チューブにサンプル全体を転送し、フローサイトメトリー解析用蛍光色素標識された抗体で染色 (手順 5. を参照)。</li>
</ol>5. Dendra r+細胞を用いたフローサイトメトリーの同定
<ol><li>300 x g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間で、IEL/LPL と脾臓のサンプルを遠心します。</li>
	<li>ミックスを汚す抗体の 100 μ L にペレットを再懸濁します。FACS バッファー サンプルごとの 100 μ L に蛍光標識抗 CD45 抗体の 1 μ L を追加してミックスを汚す抗体を準備します。 メモ: 彩度をバインドが発生する最適な濃度を決定するのに実験に先立ちフローサイトメトリー用使用抗体を滴定することが重要です。</li>
	<li>35 分 (暗い場所) の氷のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>FACS バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します、室温で 5 分間 300 x g [超小型遠心分離機] でそれらを遠心分離機します。上清を吸引し、FACS バッファーの 325 μ L のサンプルを再懸濁します。流れの cytometer でサンプルを分析します。</li>
</ol>

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<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

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同定と対話し、大腸の微生物叢によって影響を受ける細胞の解析は重要であり、体の残りの部分に粘膜の微小環境からの情報を中継する方法を理解していただく必要があります。腸関連細胞遊走を勉強するための 1 つのメソッドには、その組織ホーミング パターンを決定し、12,13を機能する受信者のマウスに養子の転送が続いて腸関連細胞の分離が必要です。このアプローチは、転送された特定の細胞型のみを追跡すること、限られました。さらに、組織および浄化プロセス、細胞の分離の結果の成果物は生体内で移住性プロセスを妨げる可能性があります。最近では、楓のマウスを用いた消化管細胞をラベルする内視鏡光電プロトコルは報告された14だったこの研究では、成体マウスの白血球、腸からの広範な売買をわかりました。
当社の報告書は新生仔マウスの大腸内のラベル セルに方法について説明し、脾臓などの余分な腸への移行を追跡します。ファム摘出</s...

哺乳類の消化管では、ホスト1との共生関係にある細菌の種の数百を隠し持っています。ローカルの環境で現在の免疫細胞は、これらの微生物との共存を適用し、病原体の侵入に対する保護バリアを確立します。したがって、免疫細胞と微生物相の双方向相互作用は免疫系を教育し、病原体に免疫反応性のしきい値を設定します共生コミュニティを確立する重要です。免疫恒常性を乱す、1 型糖尿病、IBD の2,3などの免疫介在性疾患につながる消化管の炎症を抑制する規制の回路を混乱する微生物の組成、または dysbiosis、することができます変更.
期間中に腸内微生物群集は同時に免疫システムを確立し始めるユニークな発達ウィンドウ出産後すぐには、4を成熟します。生後の微生物叢は自然群集組成とよく5の変化と、安定しません。明確な解剖学的の場所に - 腸粘膜および腸の上皮6微生物叢と相互作用する免疫細胞が存在します。(これは樹状細胞、単球、マクロファージを含める) 骨髄細胞、リンパ球 (T 細胞、B 細胞、自然免疫リンパ球様細胞など) を含む腸の免疫細胞の様々 なタイプがあります。これらの細胞、造血細胞とも呼ばれる腸粘膜バリアーを維持し、恒常性を維持する機能の多数を実行します。
腸のサイトで彼らの規制機能に加え粘膜の免疫細胞はまた全身性免疫7,8,9を規制する超腸サイト宛ての微生物を運ぶかもしれない。成長の研究関心のある分野で、その機能を調査するために腸管組織から移行免疫細胞を特定する方法の必要性を強調します。ここで報告されるプロトコルは、ラベル セルの光変換蛍光蛋白質を利用市販マウス モデルを利用しています。ファム摘出マウスは遍在が不可逆的紫外線 (UV) 光10赤蛍光活性化に切り替えられる緑の蛍光 Dendra2 蛋白質を表現します。新生仔マウスの大腸に 405 nm の光を提供する繊維光学カニューレを用いて、脾臓の生まれか、コロンを通過 photoconverted 造血細胞を見つけることができますを示す.

<table><tbody><tr><td>Laser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>発光ダイオード(LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>注意:これはクラス3bレーザーです。レーザーを使用するときは、安全ゴーグルを着用する必要があります。405 nmの波長を放出し、電流は1400 mAです。ファイバー結合されています。SMAコネクタを受け入れます。https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LEDドライバ</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>レーザーを介して1200mAの定電流を駆動します。</td></tr><tr><td>https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 Optogeneticsパッチケーブル</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>SMAコネクタ付き1m長ケーブル https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>光ファイバーカニューレ</td><td>ドーリックレンズ&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm長カニューレ、外径500 & マイクロ;mと480μmの内径。NA 値は 0.5 です。フェルールは外径1.25mmのジルコニアです。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>電源</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td> LG3レーザー安全ゴーグル <td>https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 2.4Aの電流で15Vを供給し</td></tr><tr><td>ます&nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>可視光線透過率47%のオレンジレンズ https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>赤色光&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>74327-10</td><td>15 W ランプ</td></tr> <tr><td>https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences腸細胞単離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-893-1389</td><td>注意: この麻酔薬を吸入すると、めまい、眠気、さらには意識喪失を引き起こす可能性があります。この麻酔薬は、クラスIIフードで使用する必要があります。&nbsp;https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg フリー https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>カーフセラム</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M 濃度 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>注意: 飲み込むと有害で、皮膚刺激を引き起こします。 1 M 濃度 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M 濃度 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 ミクロン セル ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>マイクロマグネティックスターバー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>1451364</td><td>使用後は毎回70%エタノールですすいでください。毎回使用する前に、蒸留水で数回すすいでください。バーの長さは8mmで、八角形です。https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>マグネティックスタープレート</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>ロシュ</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL血清ピペット</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mLコニカル遠心チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mLコニカル遠心チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>シングルセル懸濁液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td>チューブ <td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>1.5 mLを保持します https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx。</td></tr><tr><td></td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>には単三電池2本が必要です。https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>ホモジナイザーのヒント&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic、0.5 mLチップ https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40ミクロンセルストレーナー</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786抗マウスCD45&nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>クローン 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razorブレード</td><td></td><td>VWR55411-050</td><td>斬首に使用します https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の photolabeling

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

腸内細菌群集は、人生の早い段階で確立され、免疫細胞の発生と機能に影響を与えます。新生児の細菌は抗生物質の使用と自己免疫疾患および炎症性疾患への感受性に影響を与える食事を含む多数の外部の影響を受けやすいです。炎症性腸疾患 (IBD) などの疾患は、腸の免疫細胞の大量流入によって特徴付けられます。ただし、免疫細胞、細菌叢によって調節が超腸内サイトでの免疫反応に影響を与える腸から移住また。したがって、識別し、遠位のサイトに腸から微生物のメッセージを運ぶことができる細胞を分類する必要があります。ここでは、新生児マウス体内移行後余分な腸のサイトで彼らを識別するための大腸のラベル セルに手法について述べる。

光ファイバー ケーブルを使用して 2 日間の古いファム切除マウスのコロンに 405 nm の光を配信しました。前の実験で 30 秒露出は最小限の細胞毒性 (図 1A)、結腸細胞の最大光電を与えるに決定しました。したがって、コロンのさまざまなセグメントの連続 30 秒露出は、プロトコルに従って行われました。レーザ露光後マウスすぐに安楽死させ、セルの光電が決定されました。合計結腸組織の単一セル準備が蛍光標識抗 CD45 抗体で染色した、光電検出、フローサイトメトリーによる解析を行った。未変換の Dendra2 グリーン (Dendra g) 蛋白質 490 と 553 nm 励起と放射の最大値は、それぞれ、photoconverted Dendra2 赤 (Dendra-r) 蛋白質は、507 と 573 nm 励起と放射のマキシマに対し FITC チャンネルで検出できます。それぞれ流れの cytometer の PE チャンネルで検出することがあります。その赤...

ここで説明されているプロトコルは、超腸サイトにコロンから移住免疫細胞を特定する新生児マウスの photolabeling アプローチを採用しています。この戦略は、初期の生活におけるホスト マイクロバイ相互作用の研究に有用になります。

生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

この手法は、細胞が微生物由来のメッセージを運んでいるか、また運んでいるとすればどの細胞であるかなど、新生児の宿主免疫とマイクロバイオームの相互作用に関する粘膜免疫学分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、乳児マウスの結腸 resident 細胞を非特異的かつ不可逆的に標識できるため、腸管外部位へのトラフィッキングパターンを特定できることです。レーザーを組み立てるには、LEDの4ピンM8コネクタケーブルを介して発光ダイオード（LED）をLEDドライバーに接続し、ネジを慎重に締めて接続を固定します。LEDのコネクタ開口部を光にかざし、目に見える遮蔽物がないことを確認します。オプトジェネティクス用パッチケーブルを開口部に挿入します。カニューレをコネクタスリーブのいずれかの端に挿入します。次に、コネクタースリーブのもう一方の端をパッチケーブルの端に取り付け、ファイバー光カニューレをファイバー光パッチケーブルに接続します。連続調整ノブを使用して、LEDドライバーを連続波モードのゼロに設定し、電流制限を1.2 ampsに設定します。レーザーの準備が整ったら、暗所にある電源にLEDドライバーを接続してください。麻酔をかけた生後10〜12日のマウスの項部を、人差し指と親指でそっと掴みます。動物を仰向けにして腹部を露出し、薬指と小指で尾を固定します。もう一方の手でカニューレの保護キャップを取り外し、ファイバーオプティックカニューレを肛門から結腸へとゆっくりと挿入します。この際、カニューレの長軸をマウスの正中線と平行に保ちながら、5 mmの光ファイバー全体がマウスの内部に入るようにします。柔軟性、直径、長さを含むカニュラの設計は、この処置を成功させるために極めて重要です。新生仔マウスは非常に脆弱であるため、結腸を穿孔しないよう細心の注意を払う必要があります。保護メガネを着用し、レーザー電流を最大値まで上げて、動物の半透明な腹部を確認してUV光が出ていることを確かめてください。管腔内で光に曝露される領域を最大化するため、30秒ごとにカニューレを約1mmずつ引き抜きます。計2分間のUV光照射後、ゆっくりとマウスからカニューレを抜き、レーザーを切断します。麻酔から回復後、マウスをホームケージに戻します。腸管リンパ球を採取するには、清潔なピンセットとハサミを用いて腹部を切開し、腸管を片側に寄せて結腸を露出させます。結腸全体を取り出すには、まず盲腸のすぐ遠位側で組織を切断し、ピンセットで結腸をしっかりと把持しながら、ハサミで尿道から直腸にかけて切断します。次に、肛門にできるだけ近い位置で結腸を切断し、腹腔から結腸全体を取り出します。ピンセットを使用して、結腸の内容物を乾いたペーパータオル上に押し出します。その後、洗浄した結腸を組織培養皿の蓋に移します。カミソリの刃

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Medicine

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

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生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling

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