実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

この方法は、サンプルの種類、処理、植物の遺伝子型に応じて微生物群集の多様性がどのように変化するかなど、土壌、根圏、根の内部微生物叢分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、大量のサンプル数と複製が必要なフィールド実験に適していることです。この手順を実演するのは、私と、私の研究室の大学院生で研究技術者のステファニー・フットレルです。

プロトコールを開始するには、ウォッシュパンとバケツに植物サンプルの詳細を付箋でラベル付けします。ラベルの付いたバケツをプロットに運び、洗面皿を現場の確立されたワークステーションに置いておきます。プロット内の異なる領域から、プロットごとに2つの植物をランダムに選択して収集します。

次に、シャベルで30センチメートルの深さまで土を突き刺して、植物を土に固定している側根のいずれかを切り取ります。シャベルを活用して植物の根を掘り、ラベル付きのバケツに根球を置きます。バケツを現場のワークステーションに戻します。

根を振って、スペードまたはハンドヘルド分げつを使用して根から土を取り除きます。手袋を着用し、処理ステーションの近くに根を置きます。根を振った後、洗面皿で土を混ぜ、手持ちの分げつで土の塊を砕きます。

土のサンプルを入れますamp破片のないラベル付きの17.7 x 19.5cmのジッパー収納バッグに入れ、氷の上に置きます。剪定はさみを70%エタノールで滅菌します。滅菌ハサミを使用して、植物ごとに約4〜6本の根と各根の長さが約9〜12センチメートルのさまざまな根を切り取ります。

切除した根を、Silwet L-77などの界面活性剤を含む35ミリリットルのオートクレーブ滅菌リン酸塩緩衝液を含む標識された50ミリリットルのチューブに入れます。チューブを2分間振って、根茎を根の表面から解放します。発電機とボルテクサーで揺れを改善します。

70%エタノールで滅菌した鉗子で、チューブから根を取り除き、ペーパータオルで短時間拭き取り、ラベル付きの新しい50ミリリットルのチューブに入れます。根圏を含むチューブと根を含むチューブの両方を氷の上に置きます。畑で根を集めた50ミリリットルのチューブに、約35ミリリットルの50ミリリットルと0.01%トゥイーン20を加えます。

チューブを30〜60秒間渦巻きまたは振とうします。漂白剤を注ぎ、35ミリリットルの70%エタノールを加え、根をさらに30〜60秒間渦巻きまたは振とうします。振とうした後、70%エタノールを注ぎ、35ミリリットルの滅菌超純水とボルテックスを加えるか、サンプルを1分間振とうします。

水ですすぎのステップをさらに2回繰り返して、根が滅菌された超純水で合計3回のすすぎを受けるようにします。乾いた清潔なペーパータオルで根を拭き取り、サンプルごとに清潔なペーパータオルを使用します。滅菌鉗子と剪定はさみを使用して、根を約5ミリメートルの断片に切り、切断した根を清潔なラベル付きの15ミリリットルの円錐形チューブに入れ、さらに処理されるまでサンプルを摂氏マイナス80度で保存します。

フィールドからの根圏サンプルを含む50ミリリットルのチューブを20〜30秒間振とうして、サンプル全体を再懸濁します。滅菌済みの100ミクロンメッシュセルストレーナーを使用して、再懸濁したサンプルを新しい50ミリリットルのチューブにろ過します。次に、チューブを室温で5分間、3, 000倍gで遠心分離します。

すぐに上澄みを注ぎ、捨てます。根圏ペレットを氷上の50ミリリットルのチューブに入れます。次に、界面活性剤を含まない1.5ミリリットルの滅菌リン酸緩衝液を根圏ペレットに加え、それらをボルテックスしてサンプルを再懸濁します。

懸濁液を清潔でラベル付きの2ミリリットルのマイクロチューブにピペットで移します。チューブを室温で2分間、gの15,871倍で回転させます。すぐに上澄みを注ぎ、清潔なペーパータオルでチューブを排出します。

ペレットは、さらに処理されるまで摂氏マイナス20度で保管します。滅菌済みの金属ヘラを使用して、DNA抽出用の約3グラムの土壌を清潔でラベル付けされた2ミリリットルのチューブに充填し、小さな根片や破片を避けます。各サンプル間で金属スパチュラを70%エタノールですすいでください。

この土壌サンプルは摂氏マイナス20度で保管します。清潔な洗濯鍋で、土の袋を積み重ねたふるいに空にし、大きいふるいを小さなふるいの上に置き、両方のふるいを通して手動で土をふるいにかけます。ブラシを使用して、サンプル間のふるいを慎重に清掃します。

100〜125グラムのふるいにかけた土を17.7×19.5センチメートルのジッパー付き袋に入れておき、将来の土壌物理化学的およびテクスチャー分析に備えます。土の袋を摂氏4度に置いて、短期保存します。次に、液体窒素をきれいなへらときれいな乳鉢でプラスチックビーカーに注ぎます。

凍ったティッシュを乳鉢に入れ、乳棒で微粉末に挽きます。粉砕中に液体窒素を絶えず添加して、サンプルを凍結状態に保ちます。へらを使用して、粉砕された組織を清潔なラベル付きの2ミリリットルのチューブに移し、次に組織を摂氏マイナス80度で保存します。

70%エタノールと1%家庭用漂白剤で作業エリアを拭きます。マイナス20°Cの貯蔵庫から土壌サンプルを取り出し、氷のバケツで解凍します。シーリングマットカバーを96ウェル抽出プレートから取り外し、カバーを2つのペーパーワイプの間に配置して、使用しないときは清潔に保ちます。

プレートの12列を粘着性の8ウェルPCRストリップで覆い、汚染を防ぎます。無菌の風袋、スケールの上のサイズの小さい重量を量る漏斗および土の200から250ミリグラムを量る。粘着剤ストリップを慎重に持ち上げ、充填された計量漏斗のネックを適切なウェルに置き、土壌サンプルを適切なウェルにそっと導きます。

粘着ストリップを交換してウェルを覆います。このプロセスをウェルごとに繰り返し、サンプルごとに新しい滅菌漏斗を使用します。抽出プレートのシーリングマットカバーを元に戻し、DNA抽出の準備が整うまでプレートをマイナス20°Cで保管します。

マイナス20°Cの貯蔵庫から根圏サンプルを取り出し、氷のバケツで解凍します。前のセクションで行ったようにDNA抽出プレートを準備します。きれいなペーパーワイプをはかりに置き、滅菌済みの金属ヘラをはかりに風袋引きします。

スパチュラを使用して、サンプルチューブから根圏ペレットの一部を慎重にすくい取ります。根圏サンプルの200〜250ミリグラムの重量を量ります。粘着ストリップを慎重に持ち上げて、抽出プレートの最初のウェルを明らかにします。

充填されたヘラをウェルに角度をつけ、滅菌爪楊枝で根圏材料を適切なウェルにこすり落とします。金属ヘラを水ですすぎ、続いてサンプル間に70%エタノールをすすぎます。最後に、プレートが充填されるまで、プレートのすべてのウェルに対してこのプロセスを繰り返し、抽出ブランクコントロールとして1つのウェルを空にします。

この代表的なデータセットでは、サンプルタイプ間で非常に有意な違いがあり、根圏と土壌は根よりも互いに組成が類似しているように見えます。さらなる分析により、根圏と土壌の間の微生物群集の構成にも非常に有意な違いがあったことが示されています。アルファ多様性分析は、内部圏の微生物群集が土壌および根圏の群集よりも低かったことを示しています。

イネ科植物種間の多様性の唯一の有意な違いは、ビッグブルーステムとスイッチグラスのエンドスフィアサンプル間でした。相対存在量分析では、すべてのサンプルタイプでプロテオバクテリアが優勢であり、続いて放線菌が優勢であることが強調されています。土壌と根圏はアシドバクテリアとクロロフレキシが優勢ですが、根はバクテリオデテスが相対的に豊富に存在していました。

すべてのサンプルタイプのPERMANOVA分析により、植物種による微生物群集の構成に非常に有意な違いがあることが明らかになりました。このビデオを見れば、土壌、エンドスフェア、および根圏マイクロバイオームの研究で使用する一連の手順を実行する方法について十分に理解できるはずです。この教育ビデオの一部に資金を提供してくださったネブラスカ州EPSCoRおよび全米科学財団EPSCoR研究インフラストラクチャプログラムトラック1に感謝します。