マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

鼻電位差は、嚢胞性線維症をモデル化するトランスジェニックマウスの表現型を特徴付けるための貴重な方法です。これにより、嚢胞性線維症に対する新しいタイプの治療法の有効性を調査することができます。この技術の主な利点は、連続的に繁殖するマウスで信頼性の高い測定を提供することです。

これにより、関連する死亡率が減少し、同じ動物でテストを繰り返すことができます。ダブルルーメン鼻カテーテルを準備するには、長さ20センチメートルのポリエチレンチューブの中央を、引っ張るのに十分なほど柔らかくなるまで、炎の中を約10〜15秒間保ちます。次に、両端を引き離して、鼻プローブの長さ約15センチメートル、外径0.1ミリメートルの非常に細い毛細管を取得します。

その後、純粋なエタノールで2本の毛細血管を洗浄し、脱脂します。それらをテープで結合し、シアノアクリレート接着剤を使用して接着します。かみそりの刃でプローブの余分な長さを切り取り、長さ約8cmのダブルルーメンカテーテルを取得します。

次に、両方のルーメンに水を注入して透過性があることを確認し、先端から5ミリメートルの距離で印を付けます。その後、電解質クリームと飽和させた3モルカリウム溶液を1対1の比率で混合してクリームミックスを調製し、小さな気泡の形成を防ぎます。実験のセットアップでは、テスト中およびテスト後の低体温症を防ぐために、2つの加熱パッドを使用し、1つは測定セットアップ用、もう1つはテスト終了時に動物を回復させるボックス用です。

データメモリ、高入力インピーダンス、高分解能電圧計に接続されているコンピュータの電源を入れます。次に、データキャプチャ用のソフトウェアを開きます。電極を電圧計に接続します。

電極の先端を一緒にクリームミックスに浸します。初期電極オフセット値を確認し、値がプラスマイナス2ミリボルトより大きい場合は電極を拒否します。次に、蠕動ポンプのスイッチを入れ、ポンプチューブを鼻カテーテルの灌流内腔に挿入します。

鼻カテーテルの1つの内腔を10マイクロリットルのピペットチップを介して電解質クリームミックスで満たします。カテーテルをシリコンチューブコネクタに適合させ、コネクタにクリームミックスを充填します。その後、正極をコネクタに挿入します。

測定電極ブリッジのオフセット値を確認し、値がプラスマイナス2ミリボルトより大きい場合はブリッジを拒否します。続いて、ポンプチューブの近位出口を、鼻灌流用に選択した溶液を含むバイアルに接続します。次に、ポンプチューブの遠位出口を鼻カテーテルの灌流ルーメンに接続します。

次に、鼻カテーテルの2番目の内腔に新鮮な溶液A1を満たします。経鼻カテーテルの先端を溶液A.蠕動ポンプの方向を逆にして、10秒間の灌流に対応する鼻カテーテルの長さを埋めます。その後、吸収組織のシートを折りたたんで、マウスの頭のサポートとして使用する幅3センチメートルの枕を作ります。加熱パッドを吸収組織のシートで覆います。

次に、マウスを仰向けにして加熱パッドに置き、手足と尾をパッドにテープで固定します。その後、参照静脈カテーテルを後肢の皮下腔に挿入します。針を取り外し、シリコンチューブコネクタに合わせます。

カテーテルとコネクタにクリームミックスを充填します。次に、正の測定電極を鼻カテーテルに接続し、負の参照電極を動物の後肢の皮下腔に挿入したカテーテルに接続します。次に、カテーテルと電極を必要に応じてテープで固定し、ずれを防ぎます。

参照電極とブリッジを配置した後、IVカテーテルのコネクタ内の電極クリームミックスに鼻カテーテルの先端を浸すことにより、測定電極ブリッジオフセット値を再度確認します。安定した最終的なオフセット値を記録します。次に、マウスの耳を加熱パッドのテープで、吸収組織の2つの部分の間の空きスペースに固定します。

目に触れずに鮮やかさを固定します。口腔内の水分を吸収するには、舌を横に動かし、尖った濾紙の芯を約1cm口の中に挿入します。灌流した鼻孔から流れ出る液体を吸収するために、鼻のつま先に2枚目の濾紙を置きます。

鼻カテーテルの先端を口の中に配置して、上皮電位の陽性制御値を確認します。細い鉗子で保持し、良好な直接照明の下で、鼻先から最大4〜6ミリメートルの片方の鼻孔に鼻カテーテルを繊細に導入します。麻酔薬を注射してから5分後、動物の頭を下にして、加熱パッドを約30度ゆっくりと傾けます。

最大基礎PD値を監視します。30秒以上安定したら、4つの緩衝液を連続して1分間に10マイクロリットルで鼻粘膜の灌流を開始します。最初の溶液を10秒間灌流し、後続の各溶液を5分間、または安定した電圧に達するまで灌流します。

一時的なForskolin応答が下がり始めたら、Forskolinの灌流を停止します。評価後、マウスを加熱パッドから放します。麻酔薬拮抗薬ミックスで投与し、完全に回復するまで加熱パッド付きのリカバリーボックスに移します。

ここでは、ホモ接合体、正常マウス、およびF508欠失CFTR変異のホモ接合マウスからの代表的な鼻PDトレースと、鼻PDパラメータについて得られた個々の値を示します。アミロライド反応は、アミロライドを含む基礎緩衝塩溶液による鼻粘膜の灌流の終了時と開始時の鼻PDの値の差です。塩化物フリー反応は、塩化物を含まない緩衝塩溶液とアミロライドによる鼻粘膜の灌流の終了時と開始時の鼻 PD の値の差です。

フォルスコリン応答は、塩化物を含まない緩衝塩溶液、フォルスコリン、アミロリドによる鼻粘膜の灌流終了時と開始時の鼻PDの値の差です。総塩化物応答は、ゼロ塩化物灌流で得られた最後の 2 つのパラメーターの合計です。このプロジェクトは、マウスだけでなく、ガキ、ビッグ、フェレット嚢胞性線維症モデルでも、輸送の離脱者を探索し、提供するために使用することができます。

そして、宦官マウスモデルにおけるナトリウム輸送離脱者。プロトコルを採用することで、すべてのトランスポーターを調べることができます。げっ歯類の鼻腔での作業は、鼻顔面領域からの感覚入力の本質的な壁のために非常にデリケートです。

マウスの鼻腔内で手術する場合、麻酔による適切な死は特に困難です。