Name: マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶマウスの鼻潜在的違い測定法でCFTRやENaCなどのイオン輸送体機能を評価し、嚢胞性線維症の新規治療法有効性を検証する。同個体での繰り返し測定が可能で、信頼性の高いデータを得られる。

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著者が原稿を批判的に編集教授 j. Lebacq をありがちましょう。Cftrtm1Eur (F508del CFTR (FVB/129) のホモ接合体マウスは欧州経済共同体が欧州の連携アクション EU FP6 の嚢胞性線維症の研究のためのサポートと、エラスムス MC、ロッテルダム、オランダによって開発されました。LHHM-CT-2005-018932。

研究は、研究 (CEE n ° 86/609) 動物用欧州共同体規則に一致して UCL (2017/UCL/MD/015) の動物研究の倫理委員会によって承認されました。調査官は、動物実験の科学的な目的に使用される動物の保護に関する指令 2010年/63/EU 欧州議会及び理事会 2010 年 9 月 22 日の次の修飾されています。
1. 事前テストの評価と管理
<ol><li>ダブル ルーメン鼻カテーテルを準備します。 注: 鼻カテーテルはダブル ルーメン キャピラリー チューブ、ソリューション、持続灌流に使用されている 1 つのルーメンとして行われます、なり他の測定として 1 つのチャネルします。<ol>
<li>ポリエチレン管 (内径 2.0 mm; 3.0 mm 外径; の部分、20 センチぐらいの中央部を加熱します。図 1) (10-15 秒) を引っ張るために十分に柔らかくなるまでガス ・ バーナーの炎で。</li>
		<li>離れて適切な長さ (~ 15 cm) と鼻プローブ (図 1b) の外径 (~0.1 mm) の非常に薄いキャピラリー チューブを取得する 2 つの端を引き出します。</li>
		<li>きれいと純粋なエタノールと 2 つこのような毛細血管を脱脂、テープ (図 1c) でそれらを結合、接着剤、シアノアクリ レート系接着剤を使用して一緒にそれら。</li>
		<li>かみそりの刃や約 8 cm (図 1d) のダブル ルーメン カテーテルの最適な長さを取得するメスとプローブの余分な長さを切り取る。</li>
		<li>透過性を確認する両方のルーメンを通して水を注入します。</li>
		<li>先端から 5 mm でマークを適用します。 注: プローブが挿入され、鼻孔にマークまですべての測定は、鼻腔内の同じサイトに作られています。</li>
		<li>ドライ ボックスにダブル ルーメン カテーテルを格納します。 注: こと使用される 6 - 10 回テスト直後に適切に洗浄する場合です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリーム色のミックスを準備します。<ol>
<li>電解質クリームと飽和 3 M KCl 溶液 (ボリューム/)、1:1 の比率で小さな空気の泡の形成を回避する優しく混ぜます。 注: クリーム色のミックスは、図 1に示すよう銀/塩化銀電極、測定および参照電極橋を構築する使用は。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> 図 1: プローブの電極とブリッジで。図は前に、(a) と暖房と引っ張って (b)、(c) ダブル ルーメン カテーテル (d)、シリコーン チューブ コネクタ (e)、(f) 電極の 2 つの毛細血管部分を接合テープ後にポリエチレン管を示します。画像の鮮明さ、コネクタはクリーム色のミックスで満たされているではないです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ソリューション ラベル</td>
			<td>ソリューションの概要</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>基底緩衝塩類溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>塩素フリー バッファー塩溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M アミロライド原液</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>フォルスコリン 10-3 M 原液</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 在庫、マウスの鼻の PD のテストのためのソリューションです。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>塩</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子の重量</td>
			<td>グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>マグネシウム塩化物水和物 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸水素二カリウム (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 2: 基底の組成は、食塩 (ストック溶液) をバッファリングします。
<ol start="3"><li>ソリューションを準備します。<ol>
<li>実験的プロトコル (表 1) に必要な 4 つの貯蔵液を準備します。<ol>
<li>(原液 A 基底バッファー溶液を調製します。表 2)・塩素フリー バッファー溶液 (ストック溶液 B;表 3)室温で純粋な水に塩を混ぜて。7.4 (範囲 7.0 7.6) の pH、低い pH に 1 N の HCl を上げる 1 N NaOH を使用して pH を調整します。(275 mOsm/L) 溶液の浸透圧の変化を確認します。</li>
			<li>6 ヶ月 3 ヶ月またはの冷凍ペットボトルの 4 ° C でラベル付きのガラス瓶に格納します。</li>
			<li>10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) を準備するには、10 mL の純水にアミロライド塩酸の 26.6 mg を追加します。70 ° C で 5 ~ 10 分の混合物を熱します。アミロライドは光に敏感で、ソリューション C 暗いコンテナーにしてください。コンテナーにラベルを付けるし、最大 3 カ月の 4 ° C で保存します。</li>
			<li>24.36 mL 純水にフォルスコリン 10 mg を追加して 10-3 M フォルスコリン ソリューション (原液 D) を準備します。フォルスコリン原液の 0.1 mL 因数をラベル付けし、6 ヶ月の-20 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>A1、B1、B2 の新鮮なソリューションを準備 (表 4)。<ol>
<li>新鮮なソリューション A1 を準備 (基底のバッファリングされた塩水プラス10-4 M アミロライド) 基底塩溶液 (原液 A) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーにラベルを付けるし、準備の 24 h 内で使用します。</li>
		<li>新鮮なソリューション B1 準備 (塩化バッファー ソリューションプラス10-4 M アミロライド) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーをラベルし、準備の 24 時間以内に使用します。</li>
		<li>新鮮なソリューション B2 準備 (塩素フリー バッファー塩水プラス10-4 M アミロライドと 10-5 M フォルスコリン) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M 0.1 mL を追加アミロライド ソリューション (原液 C)、10-3 M フォルスコリン液 (原液 D) 0.1 mL です。コンテナーをラベルし、準備の 2 時間以内に使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>塩</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子の重量</td>
			<td>グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸ナトリウム (ナトリウム塩)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸カルシウム (無水粉末)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸水素二カリウム (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: 塩化物自由の組成はバッファー溶液 (ストック溶液 B) です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> 図 2: 鼻粘膜の血流中のマウスの位置。図 (a) 加熱パッド、電圧計 (b)、後肢 (c) 近 (d)、遠位 (e) アウトレットの蠕動性ポンプ枕 (f)、皮下のスペースに挿入された参照電極とベッドシーツ (g)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2. 評価・ テスト時の管理
<ol><li>実験のセットアップを準備します。<ol>
<li>低体温症を防ぐためには、テストの前後に生理温測定のセットアップ (18.8 x 37.5 cm; ための 1 つを維持 2 つの加熱パッドを使用します。図 2)、およびもう片方が (15.5 × 15.5 cm) ボックスの動物が回復テストの終わりに置かれます。</li>
		<li>データ メモリ高入力インピー ダンスに接続してデータ収集用のソフトウェアを搭載するコンピューターに切り替える (&gt; 1012Ω) と高解像度 (0.1 mV) 電圧計 (図 2b)。</li>
		<li>電極を電圧計に接続します。図 2cに示すように、鼻カテーテルと、後肢で皮下のスペースに挿入されたカテーテルに否定的な電極に肯定的な測定電極を接続します。</li>
		<li>クリーム色のミックスで一緒に電極の先端を浸しなさい。初期の電極のオフセット値を確認します。場合は、値が (±) 2 mV より大きい電極を拒否 (理想的には 0 mV)。</li>
		<li>蠕動性ポンプに切り替え、ポンプ チューブの挿入位置を図 2に示すようします。</li>
		<li>バイアル鼻潅流 (図 2d) 選択した液ポンプ チューブの近位のコンセントに接続します。鼻カテーテル (図 2e) の血流腔ポンプ チューブの遠位部のコンセントに接続します。</li>
		<li>10 μ L ピペット チップ電解質クリーム ミックスで 1 つ鼻カテーテル内腔を埋めます。シリコーン チューブ コネクタ (図 1e) カテーテルの適応、クリーム色のミックスでコネクタを埋める、コネクタ (図 1f) の肯定的な電極を挿入します。測定電極ブリッジのオフセット値を確認します。(±) 2 mV よりも大きい場合、値は、ブリッジを拒否 (理想的には 0 mV)。</li>
		<li>新鮮なソリューション A1 で 2 番目鼻カテーテル内腔を埋めます。A. 逆蠕動性ポンプの方向 10 に対応する鼻カテーテルの長さに合わせてソリューションを含むバイアルに鼻腔カテーテルの先端を浸し灌流の s。 注: これにより、10 の基底の PD 値の記録 s アミロライドを適用する前に。参照電極 (図 1) のコネクタ内のクリーム色のミックスで鼻カテーテルの先端を浸しなさい。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス イベントを処理を開始します。<ol>
<li>腹腔内 (ip) ルート17で注入する麻酔薬の正確な線量を計算するマウスの重量を記録します。</li>
		<li>麻酔導入を促進するために腹腔内麻酔前投薬 (0.45 x 10 mm) 26 G 針を使用して注入: 5 mg/mL ミダゾラムの 50 μ L の固定投与量。5 分待ちます。</li>
		<li>麻酔のミックスを準備 (フェンタニル、メデトミジン、ドロペリドール 0.05、0.40、および 20 mg/kg の濃度で最終的な体重、それぞれと 0.375 μ g の用量固定でクロニジン) できるように最適な安定した麻酔深度 (ステージ III、平面 2)17.腹腔内、麻酔ミックス量を注入し、クロニジンのボリュームを挿入します。 注: 15 分後マウスが眠っていると麻酔は少なくとも 30 分間続くことができます。</li>
		<li>ように 3 cm 幅 '枕' (図 2f) マウスの頭のためのサポートとして (図 2、) の加熱パッドの上の部分をカバーする組織を吸収するシートを折る。</li>
		<li>組織 ('ベッド シート'; を吸収するシートを加熱パッドをカバーします。図 2g). その加熱パッド背中でマウスを置きます。手足と尻尾 (図 2) をテープします。</li>
		<li>後肢肢の皮下の空間参照の静脈のカテーテル (図 1g) を挿入します。針を除去し、シリコン チューブ コネクタ (図 1e、2 c) を適応します。</li>
		<li>カテーテルを記入し、コネクタ クリームをミックスし、コネクタ (図 1f) に否定的な電極を挿入します。</li>
		<li>任意変位を防ぐために、必要に応じてテープでカテーテルと電極を固定します。参照電極とブリッジの配置後、IV カテーテルのコネクタ内部電極クリーム ミックスで鼻カテーテルの先端を浸すことによって測定電極ブリッジのオフセット値をもう一度確認します。(理想的には (±) 2 mV 以下) 安定した最終的なオフセット値を記録します。</li>
		<li>空き ('枕' (図 2f) と 'ベッド シート'; 組織を吸収の 2 つの部分の間に加熱パッドを「優しい」テープでマウスの耳を修正します。(図 2g))。目に触れることがなくヒゲ (硬い毛が鼻の穴近くの成長) を修正します。</li>
		<li>口腔内から流体を吸収するには、舌横に (図 3、) の移動し、ろ紙 (パイプ; の先のとがった芯を挿入図 3b) 口の中に約 1 cm。液不足灌流の鼻孔を吸収するには、フィルター紙 ('ハンカチ'; の 2 番目の部分を配置します。図 3c) は、鼻の先端で開催。</li>
		<li>口の内側と接触して鼻カテーテルの先端を配置することによって上皮の可能性の肯定的な制御の値を確認します。 注: 読み取りは安定と-10 間の範囲をする必要があります mV と-20 mV。</li>
		<li>鼻から mm 6 ヒント繊細な最大 4 - 1 つの鼻孔に鼻カテーテルを紹介微細鉗子と良い直接照明の下でそれを保持しています。 注: 最大の安定したベースライン PD 値17,20を与える位置に中間の鼻コンチャに鼻 PD カテーテルがあります。</li>
		<li>麻酔薬の注射後 5 分軽く傾斜加熱パッド下に動物の頭部約 30 °。最大の基底の PD 値を監視します。</li>
		<li>それが約 30 の期間にわたって安定したが s、10 μ L の一定の速度で、鼻の粘膜を灌開始/分、連続 4 バッファー ソリューション (A、A1、B1、B2)。10 のための最初のソリューション (ステップ 1.3.1.1) を灌流 s と各次のソリューション (手順 1.4) 5 分または安定した値に達するまで。フォルスコリンの過渡応答の起動時に下がってフォルスコリン (B2) を灌を停止します。</li>
		<li>記録データの 1 秒間隔を選択します。灌流を開始時にデータの記録を開始します。コンピューターの画面に時間の関数としてデータを表示します。</li>
		<li>停止データ キャプチャ ソリューション B2 による血液灌流の終わりに。スプレッドシート ファイルとしてデータを保存します。</li>
		<li>最終的なオフセット値を減算して正しいデータ。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> 図 3: 場所の鼻カテーテルとフィルター ペーパー加熱パッドの上でマウスの位置。図では、横 ()、パイプ (b) とハンカチ (c) を入れて舌を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 事後テストの評価と管理
<ol><li>加熱パッドからマウス ボタンを離します。</li>
	<li>'ベッド シート' マウスで鼻を拭く (図 2g)。</li>
	<li>ナロキソン、競争力のあるモルヒネ拮抗薬で、アチパメゾール、メデトミジン特定の解毒剤 (2 mg/kg 体重) の固定投与量 (4 μ g) から成る麻酔拮抗薬のミックスを腹腔内注入します。</li>
	<li>完全復旧、通常 1 ~ 2 時間後に観察されるまで [回復] ボックスより小さい加熱パッドにマウスを置きます。 注: UCL 研究室で約 10% 死亡率、主にソリューションのテスト中に鼻腔内灌流の bronchoaspiration に関連が観察される性別や遺伝子型に関係なく。</li>
</ol>

<ol><li>Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bioelectric+potential+difference+across+respiratory+epithelia+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).</li>
<li>Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+in+vivo+measurement+of+the+ion+transport+defects+in+cystic+fibrosis+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium.</a> European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).</li>
<li>Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nasal+potential+difference%3A+techniques+and+protocols+for+assessing+efficacy+of+gene+transfer+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis.</a> Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).</li>
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本稿の目的は、自発的に呼吸マウス イオン運送者、主に CFTR と ENaC の整合性をテストするために必要な時間の長さのためのソリューションの持続灌流の下鼻の PD を測定するための適切なプロトコルを記述するためです。プロトコルのすべての手順は、フル動物の回復と良い品質と再現性のあるデータを確保するため慎重に最適化されています。特定、重要な手順で麻酔の評価と管理、適正な動物、中およびテスト後のケアします。
ここで平面 2 カクテルの混合物を適用することによって達成することができる麻酔への露出の III 期使用17を示した前の研究は負の変力作用効果と瞬き、瞳孔とペダルの不在で通常呼吸と関連回収反射。麻酔の深さのこのレベルで鼻カテーテル保管できる場で鼻腔の持続灌流と測定電極の橋として使用するため良い耐性を持つ。また、参照電極の橋として皮下の空間におけるカテーテルの挿入は、痛みの反応または有害な影響の兆候がない続いた。齧歯動物で動作の制御の nasofacial 地域からの感覚入力の重要な役割に対して-à-に対し...

ほぼ三十年の電気潜在的な違い (PD) 測定は、遠位気道1の代表者として、鼻の粘膜で表される膜イオン輸送体の機能の状態を評価して使用されています。細胞膜に局在する両方多動的テスト2,3、鼻 PD により嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 活動の機能解剖と上皮細胞、気道表面の水和反応で重要な役割を発揮します。鼻の PD テストの主要な臨床応用は、CF、欧州諸国で出生数 2,500 のうち 1 の平均発生率と白人の人口で最も一般的な致命的な遺伝疾患の診断で支援するためにです。テストは長い減衰、oligo またはモノラル症候性フォーム、人生の後半は、通常診断 CF と輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の診断に有用証明しました。気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症4。最近では、基本的な「CFTR の治療の変調の clinometric 評価欠陥5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,,1516は CF の新しい治療法の臨床試験に鼻の pd を使用しました。臨床設定でテストは、新しい CF ターゲット療法18,19,20,21の生物活性の調査を許可するようにマウス17に適応されています。マウスの技術はデリケート、齧歯動物および人間の間鼻の領域のサイズの種に関連した解剖学的差異と主にげっ歯類における nasofacial 領域からの感覚入力の重要な役割に基づいてます。訓練を受け、熟練のオペレーター、専用装置および供給を必要があります。
CF は外分泌腺の多全身性疾患、慢性呼吸器疾患患者の臨床像を支配します。環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を符号化する遺伝子で突然変異によって引き起こされる-CFTR 塩化物チャネル22を規制。までに、2,000 以上 CFTR の遺伝子変異は識別された23をされています。最も一般的な変異24,25CF の対立遺伝子のほぼ 90% は、(F508del CFTR) 蛋白質のポリペプチドの鎖の位置 508 にフェニルアラニンの削除に対応しています。CFTR 蛋白質は、純粋なオーミック小さなコンダクタンス塩化物チャネルです。CFTR が他輸送のメカニズム、特に、ENaC26,27を調節するかなりの証拠があります。不良電解質輸送の削減 CFTR 依存塩化コンダクタンス増加 ENaC 依存性ナトリウム コンダクタンスは、CF 上皮細胞の特徴です。電気化学の勾配優遇塩化物フラックスとイソプロテレノール (細胞内 cAMP を増加させる β アドレナリン作動薬) やフォルスコリン (アデニルに応えて縮小または廃止再分極によって元の欠陥を反映します。シクラーゼ アゴニスト、臨床使用のために承認されない)。後者の欠陥は、鼻の粘膜 (より否定的な PD) とアミロライド、ENaC28を阻害する利尿薬に対する反応の亢進の基底過分極に反映されます。
CF マウス モデルは CF 研究で頻繁に使用されているし、CF 病理解剖で非常に貴重されています。今日では、少なくとも 15 のモデルは記述されている29、3 つのうち、最も臨床的に関連する F508del の突然変異30,31,32のホモをされています。これら 3 系統30ロッテルダムのエラスムス大学で開発されたの 1 つは約 20 年間大学カトリック大学・ デ ・ ルーヴァン (UCL の) 研究室で使用されています。Cftrtm1Eurモデル30 CF 病の中期多臓器の病態を検討し、新しい治療戦略18,19,20の有効性をテストするのには非常に有用であることを証明しています。 21。中または後早期に多数の問題が発生する (< 24 h) マウスの鼻の PD テスト。本稿では、鼻潅流ソリューションの気管支吸引を避けるために、鼻カテーテルその場で持続灌流とメジャーの維持に必要な麻酔の十分な深さを説明します。テストの終わりに動物の世話、説明などの動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる麻酔薬の解毒剤の併用投与もします。完全に、これらの手順は、自発的に呼吸マウス、テスト関連の減らされた死亡率と同じ動物でテストを繰り返しで信頼性の高い測定を許可します。鼻の PD テスト、CF と野生型マウスから得られた代表的なデータは表示され説明.
マウス鼻 PD テスト プロトコルは 3 つのセッションで報告: 評価と管理、試験中に、前後。事前テストの評価と管理は、ダブル ルーメン鼻カテーテル ・連続鼻灌流用のソリューションの準備のプロトコルは詳細で説明されます。評価および管理部分がテスト、中には実験のセットアップとマウスの処理は細かく解剖しました。最後に、動物の回復を改善するために、テストの最後に動物の管理を説明します。

<table><tbody><tr><td>ポルテックスポリエチレンチューブ&nbsp;</td><td>スミスメディカル、ハイス、ケント、イングランドCT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500;内径2.0mm、内径3.0mm</td>、<td>鼻腔プローブ用毛細管を調製</td></tr><tr><td>電極クリーム</td><td>パーカー、ニュージャージー州フェアフィールド、米国</td><td>電極ブリッジを構築するための</td><td>Reduxクリーム</td></tr><tr><td>Ag/AgCl電極</td><td>生物医学、クリントンタウンシップ、ミシガン</td>州、米国 <td>JNS BNT131-1,0</td><td>測定および参照電極</td></tr><tr><td>塩酸アミロライド</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>灌流溶液</td><td></td></tr><tr>を調製するためのA7410<td>forskolin</td><td>Sigma、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>F6886</td><td>灌流溶液を準備するために</td></tr><tr><td>Knick Portamess電圧計</td><td>Elektronisch Me&beta;ger&auml;te、ベルリン、ドイツ</td><td>Portavo 904</td>電<td>位差を測定するための</td>pH</tr><tr><td>Paraly SW 112ソフトウェア&nbsp;</td><td>Elektronisch Me&beta;ger&auml;te、ベルリン、ドイツ</td><td>Paraly SW112ソフトウェアは</td><td>、電位差データ</td></tr><tr><td>midazolamを</td>キャプチャする&nbsp;<td>マイラン、Hoeilaart、ベルギー</td><td>麻酔</td><td>薬前投薬フェン</td></tr><tr><td>タニル</td><td>ヤンセン Cilag、ベルケム、ベルギー</td><td>フェンタニル-ヤンセン 0.05 mg/ml</td><td>麻酔薬として機能する</td></tr><tr><td>メデトミジン</td><td>オリオン ファーマ、エスポー、フィンランド</td><td>ドミトール 1 mg/ml</td><td>麻酔薬</td></tr>ドロ<tr><td>ペリドール&nbsp;</td><td>ヤンセン&nbsp;Cilag、Berchem、ベルギー</td>デ<td>ヒドロベンズペリドール2.5 mg / ml</td><td>は、麻酔薬</td></tr><tr><td>クロニジンとして機能します&nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td><td>麻酔薬として役立つ</td></tr><tr><td>IVカテーテル</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>sers&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>デュモン#5、</td><td>鼻カテーテル</td>ナロキソンを配置するためのファインサイエンスツール</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Braun Medical、ブリュッセル、ベルギー</td><td>ナルカン、0.4 mg / ml</td><td>、麻酔拮抗薬ア</td></tr><tr><td>チパメゾールとして役立つ&nbsp;</td><td>ゾエティス、ブルームバーグ、ベルギー</td><td>アンチセダン、5 mg/ml</td><td>メデトメディン特異的解毒剤として役立つ&nbsp;</td></tr><tr><td>カイロパッド&nbsp;</td><td>ハーバード・イスクライム(Harvard Apparatus)、マサチューセッツ州ホリストン、米国</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm、</td><td>テスト中およびテスト後の低体温を避けるため</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ P1</td><td>GE Life Sciences、ウプサラ、スウェーデン</td><td></td> マウスの鼻シアノアクリレート接着剤Loctite、Henkel、D&uumlの<td>溶液を灌流する</td>18111091</tr><tr><td></td><td>。ドイツ、ッセルドルフ&nbsp;</td><td>2</td><td>本の毛細管を接着する瞬間接着剤3&nbsp; 鼻プローブ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>RES0926S-A7</td><td>製薬グレード、USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン</td>州、米国<td>M7304</td><td>製薬グレード、USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン</td>州、米国<td>1551128</td><td>製薬グレード、USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>1551139</td><td>ファーマグレード、USP</td></tr><tr><td>Naグルコン酸</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン</td>州、米国 <td>S2054</td><td>ファーマグレード、USP</td></tr><tr><td>Ca グルコン酸</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン</td>州、米国 <td>C8231</td><td>ファーマグレード、USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>シグマ、セントルイス、ミシガン州、USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>ファーマグレード、USP</td></tr><tr><td>BD ニードル&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0.45x10 mm)</td><td>腹腔内注射</td></tr></tbody></table>

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

鼻の潜在的な違いのテストは、ほぼ三十年の嚢胞性線維症 (CF) の診断で支援するために使用されています。それは弱毒、CF、人生の後半は、通常診断の oligo またはモノラル症候性形態、輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の場合に有用であると証明されています気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症。Cf. 適応マウスのテストの対象となる治療戦略への応答を定量化するバイオ マーカーは挑戦と関連死亡を伴なうことができる臨床および前臨床設定のテストを使用されています。本稿では、鼻カテーテルその場で持続灌流を維持するために必要な麻酔の十分な深さをについて説明します。それは鼻の灌流ソリューションの気管支吸引を避けるために措置を一覧表示します。動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる、麻酔薬の解毒剤の併用投与を含むテストの終わりに動物のケアについても説明します。CF および野生型マウスから得られた代表的なデータは、CF と CF 非差別のテストを表示します。完全に、ここで説明したプロトコルにより削減しながら同じ動物の複数のテストと同様、自発的に呼吸マウス上皮細胞の塩化物およびナトリウム トランスポーターの機能的状態の信頼性の高い計測テスト関連死亡率。

CF に特徴的なイオン輸送の異常を説明するために鼻の PD 測定を行った F508del CF マウスと野生型制御のブリュッセル コロニーから FVB/129 の遺伝的背景の上で説明したプロトコルに従うCftrtm1Eurマウス30。この臨床的に関連するモデルでは、最も一般的なと最も深刻な F508del CFTR 変異23,24,25のいずれかをかくまっては最高の現在利用可能な CF マウス モデル30,31、 32。
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ここでは、マウスの鼻の潜在的な差を測定するためのプロトコルを提案する.テストは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子など上皮性ナトリウム チャネル膜イオン輸送の機能を定量化します。嚢胞性線維症の新規治療法の有効性を評価するために貴重です。

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

鼻電位差は、嚢胞性線維症をモデル化するトランスジェニックマウスの表現型を特徴付けるための貴重な方法です。これにより、嚢胞性線維症に対する新しいタイプの治療法の有効性を調査することができます。この技術の主な利点は、連続的に繁殖するマウスで信頼性の高い測定を提供することです。これにより、関連する死亡率が減少し、同じ動物でテストを繰り返すことができます。ダブルルーメン鼻カテーテルを準備するには、長さ20センチメートルのポリエチレンチューブの中央を、引っ張るのに十分なほど柔らかくなるまで、炎の中を約10〜15秒間保ちます。次に、両端を引き離して、鼻プローブの長さ約15センチメートル、外径0.1ミリメートルの非常に細い毛細管を取得します。その後、純粋なエタノールで2本の毛細血管を洗浄し、脱脂します。それらをテープで結合し、シアノアクリレート接着剤を使用して接着します。かみそりの刃でプローブの余分な長さを切り取り、長さ約8cmのダブルルーメンカテーテルを取得します。次に、両方のルーメンに水を注入して透過性があることを確認し、先端から5ミリメートルの距離で印を付けます。その後、電解質クリームと飽和させた3モルカリウム溶液を1対1の比率で混合してクリームミックスを調製し、小さな気泡の形成を防ぎます。実験のセットアップでは、テスト中およびテスト後の低体温症を防ぐために、2つの加熱パッドを使用し、1つは測定セットアップ用、もう1つはテスト終了時に動物を回復させるボックス用です。データメモリ、高入力インピーダンス、高分解能電圧計に接続されているコンピュータの電源を入れます。次に、データキャプチャ用のソフトウェアを開きます。電極を電圧計に接続します。電極の先端を一緒にクリームミックスに浸します。初期電極オフセット値を確認し、値がプラスマイナス2ミリボルトより大きい場合は電極を拒否します。次に、蠕動ポンプのスイッチを入れ、ポンプチューブを鼻カテーテルの灌流内腔に挿入します。鼻カテーテルの1つの内腔を10マイクロリットルのピペットチップを介して電解質クリームミックスで満たします。カテーテルをシリコンチューブコネクタに適合させ、コネクタにクリームミックスを充填します。その後、正極をコネクタに挿入します。測定電極ブリッジのオフセット値を確認し、値がプラスマイナス2ミリボルトより大きい場合はブリッジを拒否します。続いて、ポンプチューブの近位出口を、鼻灌流用に選択した溶液を含むバイアルに接続します。次に、ポンプチューブの遠位出口を鼻カテーテルの灌流ルーメンに接続します。次に、鼻カテーテルの2番目の内腔に新鮮な溶液A1を満たします。経鼻カテーテルの先端を溶液A.蠕動ポンプの方向を逆にして、10秒間の灌流に対応する鼻カテーテルの長さを埋めます。その後、吸収組織のシートを折りたたんで、マウスの頭のサポートとして使用する幅3センチメートルの枕を作ります。加熱パッドを吸収組織のシートで覆います。次に、マウスを仰向けにして加熱パッドに置き、手足と尾をパッドにテープで固定します。その後、参照静脈カテーテルを後肢の皮下腔に挿入します。針を取り外し、シリコンチューブコネクタに合わせます。カテーテルとコネクタにクリームミックスを充填します。次に、正の測定電極を鼻カテーテルに接続し、負の参照電極を動物の後肢の皮下腔に挿入したカテーテルに接続します。次に、カテーテルと電極を必要に応じてテープで固定し、ずれを防ぎます。参照電極とブリッジを配置した後、IVカテーテルのコネクタ内の電極クリームミックスに鼻カテーテルの先端を浸すことにより、測定電極ブリッジオフセット値を再度確認します。安定した最終的なオフセット値を記録します。次に、マウスの耳を加熱パッドのテープで、吸収組織の2つの部分の間の空きスペースに固定します。目に触れずに鮮やかさを固定します。口腔内の水分を吸収するには、舌を横に動かし、尖った濾紙の芯を約1cm口の中に挿入します。灌流した鼻孔から流れ出る液体を吸収するために、鼻のつま先に2枚目の濾紙を置きます。鼻カテーテルの先端を口の中に配置して、上皮電位の陽性制御値を確認します。細い鉗子で保持し、良好な直接照明の下で、鼻先から最大4〜6ミリメートルの片方の鼻孔に鼻カテーテルを繊細に導入します。麻酔薬を注射してから5分後、動物の頭を下にして、加熱パッドを約30度ゆっくりと傾けます。最大基礎PD値を監視します。30秒以上安定したら、4つの緩衝液を連続して1分間に10マイクロリットルで鼻粘膜の灌流を開始します。最初の溶液を10秒間灌流し、後続の各溶液を5分間、または安定した電圧に達するまで灌流します。一時的なForskolin応答が下がり始めたら、Forskolinの灌流を停止します。評価後、マウスを加熱パッドから放します。麻酔薬拮抗薬ミックスで投与し、完全に回復するまで加熱パッド付きのリカバリーボックスに移します。ここでは、ホモ接合体、正常マウス、およびF508欠失CFTR変異のホモ接合マウスからの代表的な鼻PDトレースと、鼻PDパラメータについて得られた個々の値を示します。アミロライド反応は、アミロライドを含む基礎緩衝塩溶液による鼻粘膜の灌流の終了時と開始時の鼻PDの値の差です。塩化物フリー反応は、塩化物を含まない緩衝塩溶液とアミロライドによる鼻粘膜の灌流の終了時と開始時の鼻 PD の値の差です。フォルスコリン応答は、塩化物を含まない緩衝塩溶液、フォルスコリン、アミロリドによる鼻粘膜の灌流終了時と開始時の鼻PDの値の差です。総塩化物応答は、ゼロ塩化物灌流で得られた最後の 2 つのパラメーターの合計です。このプロジェクトは、マウスだけでなく、ガキ、ビッグ、フェレット嚢胞性線維症モデルでも、輸送の離脱者を探索し、提供するために使用することができます。そして、宦官マウスモデルにおけるナトリウム輸送離脱者。プロトコルを採用することで、すべてのトランスポーターを調べることができます。げっ歯類の鼻腔での作業は、鼻顔面領域からの感覚入力の本質的な壁のために非常にデリケートです。マウスの鼻腔内で手術する場合、麻酔による適切な死は特に困難です。

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでの嗅覚機能を評価するための有益な、簡単に行動し、信頼性の高い方法です。このプロトコルは、録音の設定、マウスの組織の準備、データ収集、および基本的なデータ解析を説明します。...

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

このビデオは、穴あきパッチクランプ技術を使用して、マウスの嗅覚ニューロン(OSN)の電気生理学的記録を示しています。蛍光色素にタグされた匂い受容体を持つOSNを含む嗅上皮は、マウスから単離され、記録チャンバーに固定されます。記録ピペットはOSNの樹状突起ノブに固定され、ピペット内のナイスタチンがメンブレンを穿孔して細胞との電気的接続を形成します。最後に、別のピペットを使用して臭気刺激剤を送達し、パッチを当てた細胞の電気生理学的活性を記録する。...

マウスの嗅覚ニューロンの穿孔パッチクランプ記録

プリザーブド解剖組織と無傷マウスの鼻腔組織を準備するための効果的なマニュアル脱骨方法

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

ここでは、マウスの鋤鼻器官の急性冠組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の同定と詳細な分析を可能にする生理学的アプローチについて説明します。...

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

このプロトコールは、生体内の脳の細胞外空間（ECS）の物理的パラメータを測定する方法であるリアルタイムイオントフォレシスを説明しています。 ECSに放出された不活性分子の拡散を用いて、ECSの体積分率および蛇行度を計算する。これは、脳のECSへの急性の可逆変化を研究するのに理想的です。...

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

本稿では、プロトン電極やパッチク...

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

ここでは、鼻の電位差 (NPD) を測定するための標準化されたプロトコルを提案する.嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 関数に評価されます電圧の変化によって鼻上皮イオン チャネル活動を変更するソリューションのスパーフュー...

鼻膜上皮電位差 (NPD) の標準化された測定

腸上皮は、栄養素の吸収だけでなく、有害物質に対する保護も与えます。頂端 -...

ウッシングチャンバー技術による在来組織における腸タイトジャンクションバリアとイオン透過性の機能評価

ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。...

初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング

このプロトコルは、膜電位の変化を測定することによって電気発生膜タンパク質を研究するための方法を記載しています。このアッセイは、上皮細胞株で内因的に発現する複数のイオンチャネルの機能的読み出しのためのプラットフォームを提供します。...

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

学ぶマウスの鼻潜在的違い測定法でCFTRやENaCなどのイオン輸送体機能を評価し、嚢胞性線維症の新規治療法有効性を検証する。同個体での繰り返し測定が可能で、信頼性の高いデータを得られる。

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

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