Name: 非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶナノセンサーによる非侵襲的プロテアーゼ活性検出法。尿中の切断信号を検出し、がんなどの疾患進行をモニタリングする革新的な診断技術を習得できます。

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この作品資金が供給された NIH Director の新しいイノベーター賞受賞号DP2HD091793)。Q.D.M. は NSF 大学院研究奨学金プログラム (グラント号によってサポートされてDGE-1650044)。B.A.H は、ジョージア テック社長のフェローシップと同様、国家機関の健康 GT バイオマット訓練助成金受賞番号 5T32EB006343 の下でサポートされます。G.A.K. は、バロウズ社ようこそ基金から科学的なインターフェイスでキャリア賞を保持しています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

研究員の機関で機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) から機関の承認は次の動物実験の実施に必要です。また、標準の動物診療施設 (例えば、住宅室、無菌動物フード、anesthetization、isofluorane 室と倫理的なエンドポイント euthanization の CO2室)、これらを適切に遂行するために必要です実験。これらの施設で特別な訓練お 1 つの機関で生理学的な研究所 (PRL) によってを提供できます。すべての動物の仕事は、ジョージア工科大学で IACUC によって承認された (プロトコル: A14100)。
1. 酸化鉄ナノ粒子 (IONP) 合成
注: 安全: 全体の酸化鉄ナノ粒子合成個人用保護具を使用して実行する必要があり、化学物質の下にドラフトチャンバーです。
<ol><li>15 mL の円錐管に 30 分間氷バケットに 30% アンモニア水 1 mL を冷やします。</li>
	<li>250 mL の脱イオン水で三角フラスコを洗い、10 mL 二重蒸留水 (ddH2O) を追加します。攪拌/熱板で休んで氷浴でフラスコの外に浸します。DdH2O のフラスコに流れ N2ガスにプラスチック製のピペットを使用します。バブル deoxygenate N2で 15 分。</li>
	<li>デキストランの 224 µmol (4.5 グラム) の重量を量る (分子量 (MW) = 20 kDa) 50 mL コニカル チューブに。H2O は、デキストランを含む混合物の最終巻が 20 mL になるように追加します。精力的に、デキストランを溶解する渦。</li>
	<li>鉄 (iii) 塩化物水和物の 290 µmol (78.5 グラム) の重量を量る、デキストラン ソリューションおよび溶解する渦に追加します。</li>
	<li>0.2 μ m のフィルターを通して得られた溶液をフィルターします。</li>
	<li>脱酸素水 9 mL に 1 mL チルド水酸化アンモニウムを転送します。4 ° C に戻る</li>
	<li>鉄 (ii) 塩化四水和物の 367 µmol (73.0 グラム) の重量を量る、無酸素 ddH2O、1 mL に溶解し、0.2 μ m フィルターをフィルター処理します。</li>
	<li>250 mL の三角フラスコに dextran-iron(III) ソリューションを転送し、15 分間氷の上 N2 deoxygenate。1600 rpm で回転バー電磁攪拌と混ぜます。</li>
	<li>均質な窒素雰囲気を作成するには、ゴムキャップでフラスコをキャップします。穿刺中隔、18 ゲージのフラスコに流れ N2針。流れの出口として別の 18 g 針を挿入します。</li>
	<li>1600 rpm で電磁攪拌棒でかき混ぜ、1 mL 注射器で鉄 (ii) 溶液の 467 μ L を dextran-iron(III) ソリューションに追加します。鉄 (iii) 鉄 (ii) のこの比率はマグネタイトや Fe3O4生成平衡反応の結果します。</li>
	<li>冷えた希薄水酸化アンモニウム滴下21核生成プロセスを開始する鉄 (II) - 鉄 (III) - デキストラン ソリューションに追加します。確認各液滴を別の削除する前によくミックスします。水酸化アンモニウムの 1-2 の mL の添加後の反応を終了します。</li>
	<li>N2の流れを停止し、ゴムキャップを削除します。氷浴を削除し、ソリューションを攪拌しながらぬるま湯のお風呂で置き換えます。ソリューションの温度が 75 ° C に達することを確認し、75 分間インキュベートします。</li>
	<li>フラスコを攪拌/ホット プレートから外し、粗粒子を除去する 0.2 μ m、0.1 μ m のフィルターを通してソリューションを二重フィルターします。</li>
	<li>バッファーは、ddH2O、非常に粘性であるべきソリューションから余分なデキストランを削除するコンセントレーター (m.w.c.o.) 切断 100 kDa の分子量を使用して粒子を交換します。流れが暗いまま 2-3 回転後もフィルターが壊れている可能性があることを示す場合は、フィルターを交換します。<ol>
<li>スピン フィルターと exchange をバッファー、4800 X g で 4 ° C で 15 分間遠心、流れを破棄し IONP ソリューションに新しいバッファーを追加します。3-5 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分光光度計/プレート リーダーを用いたナノ粒子の濃度を決定します。400 nm で使用この波長で IONP モル吸光度計測 (ε = 2.07 x 106 cm-1 M-1) IO 粒子の濃度を決定します。</li>
	<li>DdH2O (通常容量は 〜 3 mL) で 10 mg/mL に IONPs を再懸濁し、化学互換性のためこの手順にポリプロピレン チューブを使用することを確認します。5 M NaOH の 1.6 のボリュームを追加し、エピクロロヒドリンの 0.65 ボリュームを追加します。厳格な架橋デキストランを 12 時間室温でプレート シェーカーでミックスします。</li>
	<li>18 ゲージ針で 20 mL の注射器を使用して 50 kDa m.w.c.o. 透析膜に IONP ソリューションを転送します。4 L ddH2O に透析膜を配置し、H2O は、いくつか回 (2-3 時間ごとに) を取り付けます。一晩インキュベートします。</li>
	<li>濃度を測定し、5 mg/mL (手順 1.15 参照) に IONPs をもたらします。20% (v/v) に到達し、IONPs の表面をアミノ化する &gt; 12 時間室温で振る水酸化アンモニウムを追加します。バッファー交換 30 kDa m.w.c.o. フィルター (1.14 参照) を使用します。</li>
	<li>高速蛋白質液体クロマトグラフィーによる (FPLC; ゲルろ過カラムの参照テーブルの材料) 最終浄化する前に 2.5 から 3.5 mL にボリュームを調整します。</li>
	<li>動的光散乱 (DLS) を使用して、IONPs (予想される範囲 10-100 nm、平均サイズ 40-50 nm) の流体力学的半径を決定します。早かったキュベットで希薄化後の IONP サンプル X 100 の 1 mL でこれを行う、マシンに配置、製造元のソフトウェアを使用して、測定を取る。 注: IONPs の総人口が DLS による 10 と 100 nm 間が平均粒径は、40 ~ 50 nm の範囲のまわりの人口の大半は。1 つはサイズの範囲を制限する場合は、さらに異なる直径を持つ画分を分離するサイズ排除クロマトグラフィーを使用できます 1 つ。IONPs は 4 ° C で保存する必要があります。</li>
</ol>2. ペプチド デザイン、IONP、およびIn Vitro検証に活用
<ol><li>かに (FITC) など N 末端蛍光レポーターと C ターミナルのシステイン残基のチオールを介した結合を許可するターゲット プロテアーゼの (例えば、中核施設または商業的) ペプチド基質を合成します。 注: MMP9 の今回の場合使用されるペプチドが FITC-PLGVRGK-C、k猫/Km 〜 105 M-1の-1x 2.0。</li>
	<li>因数 (1 mg/mL) で IONP の結合バッファーにバッファー交換 0.5 mg (50 mM ホウ酸ナトリウム 1 ミリメートルの EDTA、pH = 8.5) 10 kDa m.w.c.o. スピン フィルター (手順 1.14 参照) を使用して。</li>
	<li>ジメチルホルムアミド (DMF) 〜 30 mg/mL の濃度に到達するために染色ヨード酢酸 (SIA) を溶解し、500 SIA:IONP のモル比で IONP に SIA を追加します。 注: SIA は、heterobifunctional スルフヒ ペプチド基板上に IONPs のアミンの結合を仲介するリンカー クロス。</li>
	<li>暗闇の中で室温で 1-2 時間インキュベートします。場合は一晩を残して、4 ° c. で孵化させなさい</li>
	<li>未反応の SIA を削除するバッファーを結合に 10 kDa m.w.c.o. スピン フィルターを使用して exchange をバッファー (1.14 の手順を参照してください)。</li>
	<li>1 mg/mL (0.5 mL ソリューション) に最終的な製品ソリューションをもたらします。90:1 (ペプチド: IONP) のモル比で興味のペプチッドを 20 kDa チオール終端ポリエチレング リコール (PEG) 20:1 (ペグ: IONP) のモル比で混ぜてください。IONP でこのペプチド ペグ ソリューションをミックスします。</li>
	<li>最高速度、蛍光分子の退色を防ぐために箔の管を覆うプレート シェーカーで室温で一晩インキュベートします。</li>
	<li>任意の未反応の SIA の分子を中和するために (C:IONP) 500: 1 のモル比で L システインを追加します。室温での最高速度でシェーカーの 25 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>FPLC を介して浄化 (1.1.19 を参照)。分光光度計を使用して、試料溶液の吸光度を測定し、以下の規則に従ってペプチド: IONP 比率を計算します。浄化、PBS で 4 ° C で 1 mg/mL 製品に保管します。<ol>
<li>400 で試料溶液の吸光度を測定する分光光度計を使用して nm (サンプル 400) と波長 488 である使用、fluorophore の最大吸光度の FITC (サンプル 488) の nm。同じの 2 つの波長でストック アミン IONP 溶液の吸光度を測定 (400 nm、488 nm)、NP 400とNP、488それぞれ表されます。</li>
		<li>式 1 と正規化された計算する 2 A400と488の値を使用します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">式 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">方程式 2</li>
		<li>400と488サンプルの正規化された値を表します。ペプチド: IONP 式 3 との比率を計算するのにには、これらの値を使用します。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">式 3</li>
		<li>どこ<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg">と<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg">、IONP の蛍光体、モルの日射吸収率は、それぞれ。これらの粒子の<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg">= 2.06 106 M-1cm-1 x と FITC<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg">だから 72,000 M-1cm-1を = の値<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg">28.75 をする必要があります。代表的なペプチド: IONP 比は 20:1 ~ 50: 1 の範囲でなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>胸の谷間の in vitroアッセイを実行することにより、プローブの機能を検証します。<ol>
<li>PBS で (1 %bsa)、ペプチドの 200 nM 濃度 18 μ L ナノ粒子溶液を作る。興味のプロテアーゼの 2 μ L でミックス (MMP9; 0.1 - 1 mg/mL)。</li>
		<li>1 時間、蛍光測定プレート リーダー 37 ° c でインキュベート (485 である適切な励起と発光波長を使用して、nm と 528 の FITC、nm それぞれ) 胸の谷間を監視するすべての 1-2 分。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ナノセンサーと癌の尿検出の管理
注: モデルの例の詳細については、当社の以前のレポート13を参照してください。
<ol><li>96 well プレートの上に円筒状のスリーブを保護することによって尿の代謝ケージを作成します。尿コレクション中にスリーブと動物の脱出を防ぐためにペトリ皿カバー付きカバー内でマウスを配置します。</li>
	<li>滅菌生理食塩水でペプチド 3000 mg/kg (〜 50 µmol) の濃度でナノセンサーを含む注射剤 (200 μ L 最大音量) を準備します。</li>
	<li>100 〜 300 の負担で異種 LS174T 大腸腫瘍を有する女性、8 週間の古い、裸のマウスの mm3、約で発生した必要があります 10 日、尾静脈注射を介してナノセンサー ソリューションの管理します。注入後すぐに代謝ケージにマウスを置くし、マウスの各注入時に注意してください。</li>
	<li>注入後 60 〜 90 分、96 ウェル プレートからの円筒状スリーブを削除します。マウスを抑制し、プレート上に任意の残りの尿を無効にしてマウスを誘導するために膀胱にわずかな圧力を適用します。すべて尿 (200-500 μ L) を収集します。</li>
	<li>尿から FITC を浄化し、感度を上げる免疫沈降によって尿のサンプルを分析します。アンチ FITC 抗体結合磁性ビーズを使用します。<ol>
<li>まず、磁性体ビーズ コーティング バッファーを 3 回 25 mg を洗うし、225 μ L に最終巻をもたらします。 注: たびに、およびそれぞれの約 20 mL が必要な新鮮なコーティング バッファー (0.1 M ホウ酸ナトリウム、pH 9.5)、ブロック バッファー (PBS、0.5 %bsa、0.05% Tween 20、pH 7.4)、および洗浄液 (PBS、0.1 %bsa、0.05% Tween 20、pH 7.4) をすることが重要です。</li>
		<li>アンチ FITC (5 mg/mL) 200 μ L、200 μ L 硫酸アンモニウム (3 M) を追加します。37 C で回転で 16-24 時間インキュベートします。</li>
		<li>磁気セパレーターにソリューションを追加、上澄みを除去、625 に置き換えます<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg">Λ ブロック、バッファーし、37 C で一晩インキュベートします。洗浄バッファーで 3 回を洗うし、1.25 mL 洗浄バッファーに格納します。</li>
		<li>5 μ L 磁気ビーズ (20 mg/mL) の尿の 2 μ L インキュベート容量 50 μ L の PBS をおこない (0.01% Tween 20)。60 分間インキュベートします。</li>
		<li>50 μ L の PBS で 2 回洗って (0.01% Tween 20) 磁気分離装置を使用して各洗浄後磁気ビーズを収集します。</li>
		<li>5% 酢酸の 32.5 μ L で 2 回溶出します。〜 7 の最終 pH を達成するために 2 M のトリスの 35 μ L でプールされた溶出 (70 μ L) を中和します。</li>
		<li>プレート リーダーで読む (材料表参照) 尿蛍光を定量化する適切な励起と放射の波長で。無料 fluorophore の既知濃度の梯子に対して蛍光レポーターの濃度を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lopez-Otin, C., Bond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases%3A+Multifunctional+enzymes+in+life+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).</li>
<li>Hua, Y., Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+in+cardiometabolic+diseases%3A+Pathophysiology%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).</li>
<li>Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+role+of+proteases+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Unraveling the role of proteases in cancer.</a> Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).</li>
<li>Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+proteases+or+protease+system+components+in+blood+to+enhance+prediction+of+disease+risk+or+outcome+in+possible+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).</li>
<li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+surface+acoustic+wave+resonators+built+on+disposable+plastic+film+for+electronics+and+lab-on-a-chip+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications.</a> Scientific Reports. 3, 2140(2013).</li>
<li>Ma, W., Liu, H. -T., Long, Y. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dopamine+quinone-induced+dopaminergic+neurotoxicity+using+dopamine+functionalized+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).</li>
<li>Zhang, W. -H., Ma, W., Long, Y. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-mediated+indirect+fluorescence+immunoassay+for+the+detection+of+disease+biomarkers+using+dopamine-functionalized+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+electron-transfer+processes+using+a+biomimetic+hybrid+bilayer+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system.</a> Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).</li>
<li>Holt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+microparticles+can+modulate+the+physical+extent+and+magnitude+of+complement+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+science+%22%5BJournal%5D)">Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity.</a> Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).</li>
<li>Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+proteases%3A+Recent+advances+in+the+design+and+application+of+substrate-based+and+activity-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).</li>
<li>Kleifeld, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantifying+proteolytic+events+and+the+natural+N+terminome+by+terminal+amine+isotopic+labeling+of+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).</li>
<li>Sanman, L. E., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+profiling+of+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Activity-based profiling of proteases.</a> Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).</li>
<li>Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.201505142/abstract">Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts.</a> Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).</li>
<li>Meester, R. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Public+health+impact+of+achieving+80%25+colorectal+cancer+screening+rates+in+the+United+States+by+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018.</a> Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).</li>
<li>Mehner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-produced+matrix+metalloproteinase+9+%28MMP-9%29+drives+malignant+progression+and+metastasis+of+basal-like+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).</li>
<li>Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+molecular+target+assessment+of+matrix+metalloproteinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition.</a> Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).</li>
<li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li>
<li>Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+diagnostics+for+noncommunicable+diseases+using+synthetic+urinary+biomarkers+and+paper+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+framework+for+activity-based+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).</li>
<li>Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+spatiotemporally-responsive+nanosensors+of+in+vivo+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity.</a> ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).</li>
<li>Palmacci, S., Josephson, L. AMAG Pharmaceuticals Inc. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , 5,262,176 (1991).</li>
<li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+clearance+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Renal clearance of nanoparticles.</a> Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li>
<li>Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.200600259">Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly.</a> Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).</li>
<li>Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+tumour-penetrating+nanosensors+of+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li>
<li>Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Peptidase+activities+in+complex+proteomes+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+exoprotease+activities+confer+tumor-specific+serum+peptidome+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).</li>
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クォン博士共同創設者であり本稿に記載されている研究に関連して製品を開発している一端バイオ コンサルタントを提供しています。この研究が彼の個人的な財政の状態に影響を与えます。この整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従ってジョージア工科大学によって承認されました。

このメソッドでは、ナノ粒子のコアに共役プロテアーゼの基質から成るアクティビティ ベース ナノセンサーの開発について説明します。劈開ペプチッドプロダクト 5 nm23と非侵襲的信号を生成する尿にフィルターろ過数腎サイズより小さいので、蛋白質分解開裂のイベントは「薬物動態スイッチ」と呼ばれます。したがって、ナノ粒子またはキャリアが 5 よりも大きい流体力学的半径を使用する重要です nm 小さいものとしては腎臓によって急速にクリアされ、尿信号を混同します。彼らは FDA 承認、忍容されている、3-5 時間の循環の半減期を持っているので、我々 はペグインターフェロン IONPs を使用します。13ナノセンサーを策定のもう一つの重要な考察はペプチド基質のモル比ペグです。24,25の比率を増やすペプチド26, 立体シールドを通してターゲットをプロテアーゼによって固有でない胸の谷間を減らすが潜...

プロテアーゼは、多機能酵素でペプチド結合の加水分解に特化し、恒常性、allostasis、病1など多くの生物学的プロセスを制御することです。様々 な病気、癌、心血管疾患、プロテアーゼ臨床バイオ マーカー2,3に開発の魅力的な候補者を作るなどするプロテアーゼ活性の変化の状態と相関しています。また、プロテアーゼ活性は機能的に異なるリンク病態、患者の転帰や病4の予後です。広く、さまざまな生物学的現象を検出するバイオ センサーを開発されているし、電子伝達、神経変性疾患、癌などの病気のプロセス5,6,7,8,9します具体的には、基質を用いたプロテアーゼ センサーは10を画像診断用蛍光プローブで、プロテアーゼの活性を検出するために開発されて、から体外のペプチド基質の同位体ラベル。質量11による検出。また、バインド対象プロテアーゼ12を変更する基板のような領域を含むアクティビティ ベースのプローブが開発されています。このメソッドは、ターゲット プロテアーゼは、アクティブ サイトを変更すると、組織は、生体内でアプリケーションの制限の収穫解析が必要と不可逆的阻害されます。プロテアーゼ活性の調節は内因性阻害剤の存在など他の生物学的活動のコンテキストに大きく依存するためしかし、プロテアーゼ活性生体内で、感知することが重要です。
この作業の目的は、尿で測定可能な信号を生成することによってプロテアーゼ活性体内検出アクティビティ ベース ナノセンサーの定式化を記述するためです。このプラットフォームは、機能性バイオ マーカーとして調節不全プロテアーゼ活性を用いた癌のような複雑な疾患を区別する非侵襲的診断として使用されます。私たちナノセンサー プラットフォームは、プロテアーゼの基質に共役酸化鉄ナノ粒子 (IONP) で構成されます。これらの基板は、プロテアーゼ切断基板とき解放される蛍光レポーターによって終了されます。これらの IONPs は、体内を循環させる、病変部位へをローカライズし、アクティブな疾患関連プロテアーゼに基板を公開します。胸の谷間後、蛍光レポーターは解放され、IONP に分解されていない基板のまま体のサイズが小さいため尿にフィルターが。したがって、プロテアーゼの活動生体内での増加は尿 (図 1) の報道記者の高濃度になります。当社のプラットフォームは、尿検査は、イメージング プラットフォームは必要なく、診断信号が尿中に濃縮されています。
このプラットフォームは、様々 な癌、線維症、血栓症13,14など病気を検出する設計することができます。ここで行列メタロペプチダーゼファミリー 9 (MMP9) の標高を検出するナノセンサーの設計について述べる大腸癌のバイオ マーカーとしての活動。大腸がんは、推定の 136,800 新しいケースと 2014年だけ1550,300 人が死亡、米国で癌死の 2 番目の主要な原因です。大腸腫瘍細胞を作り出す MMP9 悪性進展行列分解、転移16を駆動する示されています。さらに、私たちの文学17から MMP9 の適したペプチド基質 (PLGVRGK) を識別します。このプラットフォームは、がんの早期発見と低コスト ポイント ・ オブ ・ ケア診断13,14,18,19,20,21に使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> 図 1: ナノセンサー活動In vivoのスケマティック。ナノセンサーは体内を循環し、病気のサイトにローカライズします。その後、病気関連プロテアーゼ クリーブ IONPs によって提示されたペプチッド基板です。劈開フラグメントのサイズは、尿中に局在することそれらを引き起こして腎クリアランスのことができます。動物が排尿後、これらのペプチド断片は、レポーター分子によって分析できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;mシリンジフィルター</td><td>VWR</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>18G ニードル</td><td>VWR</td><td>89134-024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 三角フラスコ</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>攪拌子</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート/マグネティックスターラー</td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>VWR</td><td>97064-482</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清由来アルブミン (BSA)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄 (III) 六水和物</td><td>シグマ</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄 (II) 四水和物</td><td>シグマ</td><td>44939</td><td></td></tr><tr><td>エピクロロヒドリン</td><td>シグマ</td><td>45340-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>シグマ</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>アンモニウム水酸化物</td><td>シグマ</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレット</td><td>シグマ</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>シグマ</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCl</td><td>シグマ</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>シグマ</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>PBS錠</td><td>シグマ</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン</td><td>ファーマコスモス</td><td>5510 0020 9006</td><td></td></tr><tr><td>アミコン 15 mL 10k フィルター、24 個入り</td>ミリ<td>ポア</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>アミコン 15 mL 30k フィルター、24 個入り</td><td>ミリポア</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>アミコン 15 mL 100k フィルター、24 個入り</td><td>ミリポア</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>ゼータサイザー ナノ ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析カセット</td><td>LifeTech</td><td>66130</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Tosylactivated</td><td>LifeTech</td><td>65501</td><td></td></tr><tr><td>SIA</td><td>Life Tech</td><td>22349</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20k</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン抗体 [2A3]</td><td>GeneTex</td><td>GTX10257</td><td></td></tr><tr><td>Hiload 16/600 superdex 200</td><td>GE Healthcare</td><td>45-002-490</td><td></td></tr><tr><td>プレート リーダー</td><td>フィッシャー</td><td>BTCYT5M</td><td></td></tr><tr><td>BD インスリン注射器</td><td>フィッシャー</td><td>NC0872854</td><td></td></tr></tbody></table>

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動in vivo検出するナノセンサー

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解に特化し、恒常性と allostasis などを含む広範な生物学的プロセスを制御多機能酵素です。また、プロテアーゼ活性の調節不全病態をドライブ、癌などの疾患の機能性バイオ マーカーしたがって、プロテアーゼ活性体内を検出する機能には、生体に臨床的に関連する情報があります。このプロトコルの目的は、プロテアーゼ活性体内の尿で定量化可能な信号を生成することによってプローブ ナノセンサーを作成することです。2 つのコンポーネントから成っているこれらのプロテアーゼ ナノセンサー: ナノ粒子と基板。病気のターゲット サイトに循環の半減期と基板の供給を増やすためナノ粒子の機能。基材はターゲット プロテアーゼやプロテアーゼのグループに特定するように設計された短いペプチッド シーケンス (6-8 AA) です。基板は、ナノ粒子の表面に共役し、検出のための蛍光マーカーなど、記者が終了します。調節不全のプロテアーゼはペプチド基質を切断と記者はプロテアーゼ活性のバイオ マーカーとして定量化のため尿中にフィルターされます。ここマトリックスメタロプロテアーゼ 9 (MMP9)、腫瘍の進行および転移マウスモデルでの大腸癌の検出のために関連付けられているためナノセンサーの構築について述べる.

IONPs の人口の大半は、平均粒径は、40 ~ 50 nm の範囲の周りです。Peg 修飾操作後、このサイズの範囲はおよそ 6 時間13 体内の循環の半減期 (図 2 a参照)。1 つは特定のサイズ範囲を選択する場合は、1 つサイズ排除クロマトグラフィーを使用して異なる直径を持つ IONP 画分を分離できます。TEM を用いたナノ粒子は、デキストランの外側の層で一緒に個々 の球状酸化鉄ナノ粒子の架橋として表示されます。13  IONPs のソリューションはない沈殿物とライトブラウン色が半透明で表示されます。後成功したペプチド、吸光度スペクトル解析に蛍光レポーターの最大励起波長の異なる吸光度のピークが明らかになります。FITC、場合これ中心になります約 488 nm (図 2b参照)。典型的なペプチド共役反応...

プロテアーゼは、基本的な生物学的過程の調節不全プロテアーゼ活性ドライブ進行がんなど疾病の堅く調整された酵素です。このメソッドの目的は、プロテアーゼ活性測定体内ホスト尿から検出され、病気を差別胸の谷間信号を生成してナノセンサーを作成することです。

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

この方法は、プロテアの活性をin vivoで測定することで疾患の進行を検出できるプローブをどのように設計するかなど、プロテアの混合と診断における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、開発された診断薬が非侵襲的であり、実際に生物学的シグナルの検出を増幅できることです。この方法は、多くのプロテウスが実際には病因の主要な推進力であるため、多くの病気に適用できます。ケミカルヒュームフードで、1 mlの30%水酸化アンモニウムを15 mlの円錐管に移します。.このチューブを氷のバケツに入れ、30分間冷まします。250 mlのEhrlenmeyerフラスコを脱イオン水で洗います。.次に、10mlの二重蒸留水を加えます。フラスコをヒートプレートの上に置いた氷浴に浸します。プラスチック製のピペットを使用して、フラスコ内の二重蒸留水への窒素ガスの流れを開始します。15分間泡立てて脱酸素します。次に、15mlの円錐形チューブに4.5gのデキストリンを計量します。デキストリンを含む混合物の最終容量が20mlになるように水を加えます。デキストリンを溶かすために激しく渦を巻きます。78.5 mgの鉄3塩化六水和物を秤量し、これをデキストリン溶液に加えます。.渦を巻き起こして溶解します。0.2 μm フィルターを使用して、得られた溶液をろ過します。この後、9mlの脱酸素水を、1mlの冷やした水酸化アンモニウムが入った15mlの円錐管に移します。円錐形のチューブを氷のバケツに戻して冷やします。73 mgの塩化鉄2四水和物を秤量し、残りの1 mlの脱酸素二重蒸留水に溶解します。0.2 μm フィルターを使用して溶液をろ過します。次に、デキストリン鉄3溶液を250mlのEhrlenmeyerフラスコに移します。.1, 600 rpmで混合しながら、氷上で窒素ガスで15分間脱酸素します。フラスコをゴム製の中隔でキャップします。18ゲージの針を使用して、セプタムに穴を開けて窒素ガスをフラスコに流します。別の18ゲージの針を挿入しますが、これはフローアウトレットになります。次に、1 mlのシリンジを使用して、467 ulの鉄2溶液をデキストリン鉄3溶液に加えます。.1, 600 rpmで攪拌します。冷やした希薄な水酸化アンモニウム溶液を滴下して、核生成プロセスを開始します。別のドロップを追加する前に、各ドロップがよく混ざっていることを確認してください。窒素ガスの流れを止め、ゴム製のセプタムを取り外します。アイスバスを取り外し、温水のバスと交換します。溶液を摂氏75度に加熱し、次に75分間インキュベートします。ホットプレートからフラスコを取り外します。0.2 μmフィルターで溶液を二重にろ過し、次に0.1 μmフィルターで粗い粒子を除去します。100 kDaの分子量カットオフ濃縮器

nanosensors-to-detect-protease-activity-vivo-for-noninvasive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

プロテアーゼ蛍光検出キットは、蛍光を用いたプロテアーゼ活性の測定のために設計されています。また、プロテアーゼのコンタミの微量の検出に適しています。メソッドは、FITC標識カゼイン基質の独自の製剤のタンパク質分解hydroysisに基づいています。...

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

私たちの研究室で生産された蛍光ナノ粒子は、そのような生理的恒常性の間のシグナリングおよび間質液中の細胞のような生物学的システムにおけるイメージングイオン濃度とイオンのフラックスに使用されます。...

生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

このビデオは、喀痰サンプル中の好中球セリンプロテアーゼ活性を定量化するin...

蛍光レポーターを用いた好中球セリンプロテアーゼ活性測定のためのin vitroアッセイ

この作品は、ハイブリッドの...

生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

ここでは、N 末端 hexahistidine/マルトース結合蛋白質とニッケル ニトリロ三の表面に付着した蛍光タンパク質融合組換え基板を利用した最近開発されたプロテアーゼ アッセイプラット フォームの詳細な手順を提案します。酸の磁気アガロース ビーズ。ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミド...

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

ここでは、代わりにネイティブ蛋白質分解性基質として蛍光ペプチドを使用する変更におけるザイモグラムの技術のための詳しいプロトコルを提案する.蛍光ペプチド手技で生体試料の電気泳動におけるザイモグラムの前の技術よりも幅広いプロテアーゼの検出が有効にします。...

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

変化したヌクレアーゼ活性は、バイオマーカーとしての可能性の根底にある異なるヒト条件に関連している。本論文で提示されるモジュラーで実施しやすいスクリーニング方法論により、疾患のバイオマーカーとしてヌクレアーゼ活性を利用するための特異的核酸プローブを選択することができる。...

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

本明細書に記載されるプロトコルは、ヒト痰中の好中球プロテアーゼの活性を可視化し定量するためのガイドを提供する。このような分析の用途は、抗炎症治療の評価から、バイオマーカーの検証、薬物スクリーニングおよび大規模なコホート臨床研究まで及ぶ。...

ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

このプロトコルでは、CRISPR-Casを介した多検体合成尿バイオマーカー検査について説明しており、腫瘍関連プロテアーゼ活性のex...

携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

学ぶナノセンサーによる非侵襲的プロテアーゼ活性検出法。尿中の切断信号を検出し、がんなどの疾患進行をモニタリングする革新的な診断技術を習得できます。

非侵襲的診断のプロテアーゼ活動In Vivo検出するナノセンサー

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