Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

本稿では、電気生理学的、カルシウム イメージングおよび圧力図法試験に使用することができますラット網膜の細動脈の隔離のための簡単なプロトコルについて説明します。

糖尿病性網膜症、緑内障、枝静脈閉塞症など、視力を脅かすさまざまな網膜疾患の発症には異常な血流が関与しているため、網膜の血流がどのように制御されているかを理解することは重要な目標です。網膜細動脈は、網膜の血管を取り囲む平滑筋細胞の収縮性の変化によって媒介され、管腔径を拡張および収縮することにより、網膜内の血流の調節に重要な役割を果たします。したがって、網膜灌流の調節の根底にある分子メカニズムを理解するには、網膜細動脈平滑筋細胞にアクセスし、可能な限り生理学的に近い条件で研究できる準備が必要です。

このビデオでは、パッチクランプ、カルシウムイメージング、および圧力筋造影研究で使用できるラット網膜からの細動脈の単離のための簡単なプロトコルを示します。過去数年にわたり、この製剤は、血管平滑筋の収縮性と網膜の血流の調節に関するさらなる洞察を提供するために使用されてきました。材料表に示すように、ハンクスまたはLCHを含む低カルシウムの1リットル溶液を作ります。

組織を採取する前に、アイソレーション装置を組み立ててください。ガラスパスツールピペットは、滑らかにするためにファイヤーポリッシュする必要がありますが、先端を狭くすることはできません。プラスチック製ピペットを約5〜7ミリメートルの開口部にトリミングします。

LCH溶液に浸した解剖皿に目を置きます。1セットの鉗子を使用して、眼窩筋の付着部または視神経を保持して、目を皿に固定します。目を安定させるために、固定点が強膜にできるだけ近くにあることを確認してください。

ブレードを使用して、ora serrataに沿って角膜を切断し、鉗子で強膜を優しく押してレンズを取り外します。この画像で目の後ろに見える小さな円形の領域が視神経です。ブレードを使用して、視円板を通してアイカップを対称的に半分にカットします。

閉じた鉗子を使用して、視神経乳頭に残っている付着物を取り除くように注意しながら、アイカップの2つの半分から網膜をそっとブラッシングします。2番目の目でこのプロセスを繰り返し、プラスチックピペットとLCH培地の小さな滴を使用して、解剖した網膜を試験管に移します。プラスチック製のピペットを使用して、試験管にLCHを約5ミリリットルまで満たし、網膜をチューブの底に沈殿させます。

チューブから約4ミリリットルの溶液を取り出し、プラスチックピペットを使用して新しいLCHを追加して、ティッシュを約3回洗浄します。必要に応じて、無関係な組織を取り除く必要があります。ガラスパスツールピペットの内側をLCHで磨かれた先端で洗い、ティッシュがピペットに付着しないようにします。

同じピペットを使用して、試験管から約4ミリリットルの溶液を取り出し、約2ミリリットルの新鮮なLCHを追加します。ガラスピペットの先端から組織をゆっくりと引き込み、網膜を穏やかに解離させ、内容物を試験管に排出します。この段階で気泡を導入しないようにし、網膜が約2〜3ミリメートル四方のサイズに壊れるまでこのプロセスを繰り返します。

ピペットの内側を約2ミリリットルのLCHで洗浄し、これを試験管に排出します。内容物が5〜10分かけて底に落ち着くのを待ちます。ティッシュピースのサイズが約1mm四方になるまで、前に説明したようにもう少し力を入れてトリチュレーションプロセスを繰り返します。

組織が落ち着くのを待ち、内容物が完全に均質化され、網膜の断片が残らなくなるまで、さらに強い力でもう一度繰り返します。この段階の解決策は、見た目は乳白色に見えるはずです。この技術は、分離ごとに最大8つの細動脈セグメントを生成し、長さは200〜2, 500マイクロメートルです。

細動脈の一端をカニューレ挿入し、反対側の端を閉塞させることで、筋原性反応とも呼ばれる圧力誘発性血管収縮の測定が可能になります。細動脈圧筋造影は次のように行われます。レチナールホモジネートのアリコートは、倒立顕微鏡のステージに取り付けられた生理学的記録チャンバーに移されます。

ホモジネートをチャンバーの底に少なくとも5分間沈殿させます。記録チャンバー全体を視覚的にスキャンして、長さが200マイクロメートルを超え、血管をカニューレ挿入できる開放端を持つ細動脈を特定します。細い鉗子と小さなタングステンワイヤースリップを船の上に置いて、船の一方の端を固定します。

タングステンワイヤーの重なり合った端を使用して、開口端が加圧カニューレと一直線になるように、容器をバスを横切って水平に走るように操作します。カルシウムハンクスを摂氏37度でゼロカルシウムでチャンバーを灌流します。カニューレ挿入はガラスピペットで行います。

カニューレは、微細なマイクロマニピュレーターを使用して血管の開放端に配置されます。先端は、顕微鏡の焦点面を調整することによって評価されるように、開口部のすぐ隣に配置され、血管の端とカニューレ先端の両方が同時に焦点を合わせ、加圧カニューレが血管の開口部に前進します。カニューレ挿入プロセスを支援するためにヘルパーピペットが必要であり、カニューレが血管内腔に進むと同時に、細動脈を優しく拘束し、細動脈壁を加圧カニューレ上に誘導するために使用されます。

この手順では、高い成功率を達成するために、両方のマニピュレーターを同時に制御し、広範な練習を行う必要があります。水銀柱0ミリメートルで1分間記録した後、管腔内圧は水銀柱の40ミリメートルに上昇し、血管は急速に拡張し、カニューレ挿入が成功したことを確認します。圧力誘発性血管収縮、つまり筋原性反応は、その後約 15 分間で発症します。

網膜血管平滑筋細胞からのパッチクランプ記録により、細胞内カルシウム、ひいては細胞の収縮性を調節する原形質膜イオン電流の研究が可能になります。以下のように、親細動脈内に埋め込まれた個々の平滑筋細胞から全細胞およびシングルチャンネルの記録が可能です。網膜細動脈は分離され、タングステンワイヤースリップで記録チャンバーに固定されます。

パッチピペットと細動脈平滑筋細胞膜との間に高抵抗のシールを形成できるようにするために、基底椎弓板を消化する必要があります。細動脈は、摂氏37度で連続した一連の酵素溶液と過剰に融合され、画像の矢印で示されているように、隣接する細胞の電気的脱共役ももたらします。消化レベルは、コラゲナーゼステップ中の内皮層と平滑筋層の視覚的分離で最初に評価されます。

基底椎弓板および/または末梢神経杭の残りのストランドの除去は、血管の表面に沿って細い鉗子の閉じた先端を慎重に掃くことによって達成されます。パッチクランプの場合、パッチピペットの先端を目的の細胞上に垂直に配置し、マイクロマニピュレーターの微細でゆっくりとした動きを使用して徐々に下げ、細動脈平滑筋膜に接触させます。これは、細胞の動きとピペット抵抗の変化によって判断され、取得ソフトウェアのセルシール試験プロトコルを使用して測定されます。

ピペットをセル上に降ろすと、シール抵抗は約5倍に増加します。ピペットの背面に一時的に負圧が加えられ、徐々にギガシールが形成されます。これには、1〜5分間にわたって陰圧を繰り返し加える必要があります。

全細胞記録には、穴あきパッチクランプ法が主に使用されます。前述のように、細胞内様溶液とアンホテリシンBを含むピペットでギガシールが形成されます。アクセス抵抗は、取得ソフトウェアのメンブレンテストプロトコルを使用して監視されます。アクセス抵抗が15メガオーム未満に低下すると、直列抵抗補償が実行されます。

通常、穴あきパッチモードでは、直列抵抗を約75%補償することが可能です。その後、電圧ステップまたはランププロトコルを使用して、全セル電流を測定できます。網膜の解離後、一次細動脈、二次細動脈、および毛細血管前細動脈は、その口径と血管平滑筋細胞の配置に基づいて特定できます。

1次細動脈と2次細動脈は、明視野顕微鏡下では視覚的に類似しているように見えますが、そのサイズに基づいて区別できます。毛細血管前細動脈は、製剤の中で最も小さな動脈血管であり、血管平滑筋細胞が断続的に配置されているため、容易に認識できます。単離された細動脈は、単離された細動脈内で毛細血管や細静脈と明確に区別できます。

毛細血管は、直径約4〜10マイクロメートルの小口径血管の網目構造として明らかですが、細静脈は壁が薄く、平滑筋細胞の被覆が欠けています。一次細動脈、二次細動脈、および毛細血管前細動脈は、圧力筋造影、カルシウムイメージング、およびパッチクランプ研究に適しています。加圧細動脈を用いて、筋原性応答の生成に関与する分子メカニズムを調べてきました。

この画像の顕微鏡写真は、圧力筋造影実験の過程のさまざまな時点でラット網膜細動脈を示しています。下の時間経過プロットは、実験の全過程における血管の直径の変化を示しています。加圧するとすぐに血管が拡張し、その後、15分後に定常状態に達する活発な筋原性収縮

実験の最後にゼロカルシウムハンクス溶液にワートマニンを添加すると、正常化のために血管がその受動直径まで拡張されます。このスライドは、膜伸長の前後に網膜細動脈平滑筋細胞からシングルチャネルのパッチクランプ記録を行った例を示しています。このオンセルパッチには、伸張活性化された2つのTRPV2チャンネルが含まれており、その活性はパッチピペットに負圧を加えると増加します。

ここで説明するプロトコルは練習が必要ですが、最小限のトラブルシューティングで達成できるはずです。分離された細動脈は、隔離と同じ日に使用することをお勧めします。この方法はラット網膜細動脈に最適化されていますが、マウスの網膜にも使用できます。

現在、この調製物を広く使用していますが、可能な場合は、ex vivo retinal whole-mountsと血管径と血流のin vivo測定を使用して、主要な所見の検証も試みています。