Name: Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶラット網膜細動脈の隔離法。電気生理学、カルシウムイメージング、圧力マイオグラフィーを用いて血管平滑筋の収縮性と網膜血流調節を研究するための実験手法を解説します。

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このペーパーで説明したプロトコルの開発は、次の資金の機関からの助成金によって支えられた: BBSRC (BB/I026359/1)、視力 (1429 と 1822)、若年性糖尿病研究財団 (2-2003-525)、Wellcome の信頼 (074648/Z/04) のための戦い英国心臓財団 (PG/11/94/29169)、HSC の R & D 部門 (STL/4748/13) と MRC (MC_PC_15026)。

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
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博士ジョアンナ Kur メドトロニック (ツイン都市、ミネソタ州、米国) の従業員は、今、彼女の現在の仕事は競合しないとここで紹介します。

上記で説明したプロトコルは、練習は必要最小限のトラブルシューティングで達成する必要があります。平均日の分離から 6-8 使用可能な動脈を取得し、3-4 実験の成功を達成するため。問題が発生した場合ただし、成功率を向上させるために取ることができるいくつかの手順があります。時折我々 とき発見した、特に若いラット (< 8 週間)、細動脈の収量が低いことができます。この問題を回避するためには、1.12 1.14 の手順で手順、および trituration のそれぞれの間の網膜組織 (500 x g で 10-30 s) を遠心分離をお勧めします。これはしばしば船の収量を向上させるのに役立ちますが、準備内細胞の残骸の量も増えます。
Cannulating 圧力図法研究血管分岐サイト近くに切断されている可能性があります側枝のために慎重に細動脈を確認することが重要です。これは、実験中に漏れの一般的な原因と圧力損失を表します。[Ca2 +]私のプロトコルで発生する主な問題は、染料のローディングのレベルです。貧しい染料の読み込みは、通常 Ca2 +ホメオスタシスの中断の結果をオーバー ロードしながら低信号対雑音比につながります。これらの問題のいずれかの可能性を減らすためには、網膜のホモジネートの小さい因数を削除ことができますと孤立した血管を読み込みプロトコル中に定期的にチェックします。事業 - パッチク ランプ実験、gigaseal 形成の成功率も高い方法に依存するとき、基底膜が消化されました。とき最初このプロトコルをテストまたは新しい多くの酵素を使用して酵素の消化力の濃度/期間を調整する必要があります。十分な基底を削除するための十分な消化は、内皮細胞および平滑筋層の分離を注意深く監視アクセス亂。慎重な監視も、血管が収縮するにつれてマニフェストすることができます過剰消化は避けるべきです。このような場合は平滑筋細胞、パッチ ・ クランプ記録のためあまりにも壊れやすい。酵素を適用すると、DNAse を含めることが重要だから解放された DNA の繊維の除去を確実に私は分離プロセスの間に損傷した細胞。DNA のフラグメントはべたべたして洗浄工程 (ステップ 4.4) の最終段階で、血管に付着する鉗子を引き起こす多くの場合容器の損失の結果します。容器の洗浄は技術的に難しいと最高の可能な先端の直径の閉じ鉗子の穏やかな抜本的な動きと高倍率 (20 X) で実行される最も。スイープ、間きれいラボで鉗子をロールバックします。
ハイライトとして以前、本稿に記載されているプロトコルの開発の後ろの主な動機は網膜血管中の血流が中断される理由を理解するためだった。糖尿病性網膜症28,33日に我々 の仕事のほとんどが集中しています。細動脈はセクション 1 で説明した方法を使用して糖尿病の実験齧歯動物モデルの網膜から分離できます。糖尿病から網膜細動脈分離の実験、密接に生体内で血管が経験, 高血糖状態を複製しようとすることが重要です。このため、分離 25 mm 実験的ソリューションで D-グルコース レベルを通常我々 引き上げます。血管基底膜の肥厚は糖尿病34,35中に網膜血管のよく知られている現象です。動物を使用すると、長期にわたる糖尿病 (> 1 ヶ月病悩期間)、増加酵素濃度または消化時間はしばしばパッチ ・ クランプ記録方法のアプリケーションを有効にする必要です。
前のヴィヴォを使用しての重要な制限事項が網膜血管生理学を勉強する網膜細動脈を分離し、病態は周囲の網膜の構造の損失。不在そして網膜の存在の血管作動性メディエーターに対する血管の反応が劇的に変化することができます網膜のグリアと神経細胞の除去は、細胞生理学の網膜血管平滑筋細胞へ簡単にアクセス可能組織。アデノシン 3 リン酸 (ATP) のアクションは、たとえば、このポイントのよい例を提供します。分離ラットの網膜細動脈, ATP トリガーの追加船36の堅牢な収縮、そのまま構造の存在中に、血管を広げる37。したがって、可能な限り、我々 は通常ください網膜全体-マウント前のヴィヴォと血管径と血流16,37の生体内測定を使用して私たちの孤立した細動脈の準備から主要な調査結果を検証するには.注記のうち、新しい方法最近小細動脈と38,39体外灌流全体のブタ網膜の毛細血管を研究するため浮上しています。このような準備は、網膜の神経網が網膜の細動脈や毛細血管のトーンに調整して網膜された血流動態の変化が網膜神経細胞の活動を調節する方法の私達の理解を改善する可能性があります。
またにおける内皮細胞の機能の研究を有効にするプロトコルも行っているが、本稿で説明している手順を理解細動脈の平滑筋細胞生理学研究用ラット網膜細動脈を当てている、これらの血管。予備的な作業で Ca2 +イメージング、ホルモンアッセイ法について実習研究の記録に適している実行可能な血管内皮細胞の管をもたらす網膜細動脈セグメントの酵素消化を変更することに成功しました。腔内配薬を有効にする、両端に孤立した細動脈の穿刺は、将来的にこれらの血管で調査される有効にする内皮依存性血管拡張反応をまたできた。

網膜の血流を制御する方法を理解することは重要な目標、異常な血流は、視力にかかわる各種の病態に関与している網膜疾患1,2,3、 4。内側の網膜神経細胞とグリア細胞の供給, 網膜の循環、網膜動脈、網膜静脈そして静脈5に毛細血管を通って細動脈からの血液のすべてと終わり動脈提携しています。網膜の血流が網膜動脈および細動脈のトーンだけでなく、網膜毛細血管・後毛細血管細静脈6,7,の壁にある血管の収縮の活動によって調節されています。8. 網膜血管音の制御は複雑であり血液循環システムおよび循環分子とホルモン、血液ガスを含む周囲の網膜組織からの入力の範囲によって変調され、血管作動性物質から解放、網膜血管内皮細胞と macroglia9,10,11。裏地の縦配置内皮細胞12,13,と網膜の細動脈は、網膜の小さな動脈枝血管平滑筋細胞の単一の層で構成されています14です。 これらの血管網膜循環内血管抵抗のメインサイトを形成し、したがって網膜血流の局所制御に重要な役割を果たします。網膜の細動脈は、拡張または収縮血管平滑筋収縮力10,1516,の変化を介したその内腔の直径によって網膜の毛細血管の血流を調節します。どの網膜細動脈調節を通じて網膜血流したがって必要です準備細動脈の平滑筋細胞をアクセスしてできるだけ生理的に近い条件で勉強できる分子機構を理解します。
まだその機能と基になる血管内皮細胞と相互接続性を維持しつつ、孤立した網膜血管の前のヴィヴォ準備は血管平滑筋細胞へのアクセスを提供します。孤立した船舶を使用してほとんどの研究が大きなウシまたはブタ動脈血管 (60-150 μ m) に焦点を当てた。これらは、市販のワイヤーや血管平滑筋細胞収縮メカニズム17,18の薬理学的尋問を有効にする圧力第 1 報システムでマウントできます。このような準備大きく通常の条件下での網膜血管生理学の知識に貢献します。いくつかの研究は、その小さい直径として実験小動物から分離された網膜細動脈を使用している (〜 8-45 μ m) 慣習的な図法システム19,20,21,22での使用を防ぐことができます。ただし、実験小動物から船舶を使用してのなる重要な利点、遺伝的変更された遺伝子組換え、網膜疾患モデルの幅広い可用性です。実験小動物は介入研究生体内で適しています。
ここで隔離し、圧力図法実験用ラット網膜細動脈の cannulating のための簡単なプロトコルについて述べる。また、Ca2 +イメージング、電気生理学のプロトコルこれらの血管を使用して詳細します。これらはさらに血管平滑筋収縮、網膜の血流の調節に洞察力を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>ビーカー</td><td>フィッシャーブランド</td><td></td><td>15409083 または任意の同等の製品</td></tr><tr><td>湾曲はさみ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-109-3542</td><td>または任意の同等の製品</td></tr><tr><td>使い捨てプラスチックピペット/転送</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL が最適ですが、他のサイズは許容されます。チップを取り外して開口部を広げます</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ブルネル顕微鏡 LTD</td><td></td><td>または任意の同等の製品</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>世界精密機器</td><td>デュモン #5 14095</td><td>任意の同等の細かい鉗子</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>11546963</td><td>摩擦を減らすために磨かれたが、先端を狭めるには十分ではない</td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P7741</td><td>または任意の等価な 10cm 製品</td></tr><tr><td>ピペット 乳首</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12426180</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>精製水供給</td><td>Merek</td><td>Milli-Q 一体型浄水システム</td><td>または任意の等価システム</td></tr><tr><td>丸底試験管</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; 任意の等価製品</td></tr><tr><td>鋸歯状鉗子</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>17-467-230</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>シングルエッジブレード</td><td>寒天科学</td><td>T585</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>シルガード</td>ダ<td>ウコーニング</td><td>184</td><td>または任意の柔軟な表面&nbsp;</td></tr><tr><td>試験管ラック</td><td>フィッシャーブランド ダーリン</td><td>10257963</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>圧力筋電位</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3軸機械式マニピュレーター</td><td>サイエンティフィカ</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2(または同等の製品)</td></tr><tr><td>3ウェイタップコール</td><td>パー</td><td>マーUY-30600-02</td><td>または任意の同等の製品</td></tr><tr><td>エアテーブル</td><td>テクニカルマニュファクチャリングコーポレーション&nbsp;</td><td>クリーンベンチ</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>分析ソフトウェア&nbsp;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>フリーイメージングソフト</td></tr><tr><td>解析プラグイン</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>imageJのカスタムプラグイン 無料でダウンロード可能</td></tr><tr><td>カニューレピペットガラス</td><td>World Percisionインスツルメント</td><td>TW150F-4</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>デジタル体温計</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F14201</td><td>DMSO鉗子で1 mMストックを作る</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>同等の細かい鉗子</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F1221</td> DMSOガラス底付き記録室で<td>1 mMストックを作る</td></tr><tr><td></td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0759</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>ヘルパーピペットガラス</td><td>World Percisionインスツルメンツ</td><td>IB150F-3</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>インラインヒーター</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>の商業用等価 SH-27B ソリューション ハーバード大学の装置からのインラインヒーター</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>Eclypse TE 300</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マノメーター</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マイクロ電極プーラー</td><td>Sutterの器械</td><td>P97</td><td>またはMicroforgeの等価なプロダクト</td></tr><tr><td>+&nbsp;オリンパスCX 31</td>顕微鏡 <td>ガラスワーク</td>ス <td>ファインポイント F-550</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター機器</td><td>MP-285</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マルチチャンネルデリバリーマニホールド&nbsp;</td><td>科学</td><td>灌流ペンシル</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>ピペットフィラーを自動化します&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>シリンジ 加熱され、ピペットホルダーの内径に引っ張られる</td></tr><tr><td>ピペットホルダー</td><td>分子デバイス</td><td>1-HL-U</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>吸引ポンプ</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>逆転による曝気ポンプ</td></tr><tr>シ<td>リンジ</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>アドベント</td><td>W558818</td><td>75&mu;m径</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>VWR</td><td>その他のサイズ</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>USBカメラ</td><td>&nbsp;ロジクール&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>ビデオキャプチャソフトウェア</td><td>Hypercam</td><td>バージョン 2.28.01</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>x20 レンズ</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>x4 レンズ</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>Yコネクタ</td><td>ワールドパーシションインスツルメンツ</td><td>14012</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>パッチクランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 方向タップ</td><td>コールパーマー</td><td>UY-30600-02</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>3 軸メカニカルマニピュレーター</td><td>サイエンティフィカ</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>エアテーブル</td><td>テクニカルマニュファクチャリング株式会社&nbsp;</td><td>クリーンベンチ</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg 毎日 50 &mu;DMSOのL(超音波処理して溶解する)</td></tr><tr><td>増幅器</td><td>分子デバイス</td><td>Axopatch 200a</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>アナログデジタルコンバータ</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプ1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>LCHで0.1mg / mL</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>デジタル体温計</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>ワーキングストック 1 MU mL-1 (10 MU を 10 mL LCH に希釈)&nbsp;</td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>カスタムメイド</td><td></td> 任意の<td>等価商業製品</td></tr><tr><td>微細鉗子</td><td>デュモン</td><td>No. 7</td><td>任意の超微細鉗子</td></tr><tr><td>ガラス底 記録室</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0759</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>分子デバイス</td><td>CV203BU</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>インラインヒーター</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>ハーバード大学の機器からの商業等価SH-27Bソリューションインラインヒーター</td></tr>倒<tr><td>立顕微鏡</td>ニ<td>コン</td><td>Eclypse TE 300</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マイクロ電極プーラー</td><td>サッター機器</td><td>P97</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp;オリンパスCX 31</td>顕微鏡 <td>ガラスワーク</td>ス <td>ファインポイント F-550</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター機器</td><td>MP-285</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>マルチチャンネルデリバリーマニホールド&nbsp;</td><td>科学</td><td>灌流ペンシル</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>パッチングソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp v10.2</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>ピペットフィラー&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>シリンジを加熱してピペットの内径まで引っ張る</td></tr><tr><td>ピペットホルダー</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>プロテアーゼタイプ XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>0.01mg/mL(LCH中)</td></tr><tr><td>シングルチャンネルピペットガラス</td><td>World Percisionインスツルメント</td><td>IB150F-3</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>吸引ポンプ</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>逆転ベローズによる変換曝気ポンプ</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>アドベン</td>ト <td>W557418</td><td>50&mu;m径</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>VWR</td><td>その他のサイズ</td> USBカメラ<td>に適合する任意の同等製品</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;ロジクール&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>全細胞ピペット ガラス</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>GC150TF-7.5</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>x20 レンズ</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>x4 レンズ</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>または、任意の等価製品</td></tr><tr><td>x40レンズ</td><td>ニコン</td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>または、任意の等価製品</td></tr><tr><td>Yコネクタ</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>または、任意の等価製品</td></tr><tr><td>Ca2+ イメージング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 ウェイタップ</td><td>コール・パーマー</td><td>UY-30600-02</td><td>または、任意の等価製品</td></tr><tr><td>3 軸機械式マニピュレーター</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>アクイジションソフトウェア&nbsp;</td><td>ケアンリサーチ株式会社</td><td>Acquisition Engine V1.1.5</td><td>または任意の等価製品; マイクロ蛍光測定</td></tr><tr><td>Air table</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>クリーンベンチまたは</td><td>任意の等価製品</td></tr><tr><td>共焦点イメージング用の分析ソフトウェア</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>無料のイメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカジオシステムズ</td><td>SP5&nbsp;</td><td>または、任意の等価製品、共焦点</td></tr><tr><td>デジタル体温計</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>微細鉗子</td><td>デュモン</td><td>No. 7</td><td>任意の超微細鉗子</td></tr><tr><td>ガラス底 記録室</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-0759</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>インラインヒーター</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>商業用等価 SH-27B ソリューション ハーバード大学の装置からインラインヒーター</td></tr><tr><td>反転顕微鏡</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TE2000</td><td>または任意の等価製品; マイクロ蛍光測定</td></tr><tr><td>モノクロメーター&nbsp;</td><td>ケアンリサーチ株式会社</td><td>Optoscan</td><td>または任意の等価製品;マイクロ蛍光測定</td></tr><tr><td>マルチチャネルデリバリーマニホールド&nbsp;</td><td>科学</td><td>灌流ペンシル</td><td>または同等の製品</td></tr><tr><td>ピペットフィラーを自動化します&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>シリンジを加熱し、ピペットの内径まで引っ張った</td></tr>共<tr><td>焦点顕微鏡</td><td>ライカジオシステムズ</td><td>LAS-AF バージョン 3.3</td> 用ソフトウェア。<td>または、任意の等価製品、共焦点</td></tr><tr><td>吸引ポンプ</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>逆転式エアレーションポンプ ベローズ</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>または任意の同等製品</td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>アドベント</td><td>W557418</td><td>50&mu;m 直径</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>VWR</td><td>その他のサイズ</td> ウォーターバスに<td>適合する任意の等価製品</td></tr><tr><td>Grant</td><td></td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>または任意の等価製品</td></tr><tr><td>x100 レンズ</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 オイル</td><td>または任意の等価製品; マイクロ蛍光</td></tr>測定 <tr><td>x20 レンズ</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>または任意の等価製品; マイクロ蛍光測定</td></tr><tr><td>x20 レンズ</td><td>ライカジオシステムズ</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>または任意の等価製品; 共焦点</td></tr><tr><td>x4 レンズ</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &/-</td><td>または任意の等価製品; マイクロ蛍光計</td></tr><tr><td>x63 レンズ</td><td>ライカジオシステムズ</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>または任意の等価製品; 共焦点</td></tr><tr><td>Y コネクタ</td><td>World Percision器械</td><td>14012</td><td>または任意のequilaventプロダクト</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>strong<</td><td></td><td></td>strong>実験のためのピペットの製作のための指定そして設定は</strong</tr><tr><td>>Helperピペット</td><td>World Percisionの器械</td><td>IB150F-3</td><td>内径:0.86 mm 傾斜路:261 圧力:300 熱:280 引っ張る: 0 速度:56 時間:250 サイクル数:4 先端径:0.5-2 &mu;m 研磨: yes 最終抵抗: >10 M&Omega;</td></tr><tr><td>カニューレピペット</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>内径:1.17 mm ランプ:290 圧力:300 熱:280 プル:0 速度:58 時間:150 サイクル数:4 先端径:3-10 &mu;m 研磨: no 最終抵抗: <1 M&オメガ;</td></tr><tr><td>オンセルパッチング</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>内径:0.86 mm ランプ:261 圧力:300 熱:280 プル:0 速度:56 時間:250 サイクル数:4 先端径:0.5-2 &mu;m ポリッシング: yes 最終抵抗: >5 m&Omega;</td></tr><tr><td>全細胞パッチング</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>GC150TF-7.5</td><td>内径:1.17 mm ランプ:296 圧力:200 熱:287 プル:0 速度:50 時間:250 サイクル数:4 先端径:2-3 &mu;m 研磨: 役に立ちますが、必要ではありません 最終抵抗: 1-2 M&Omega;</td></tr></tbody></table>

ex vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

網膜は、高い代謝活性の組織で実質的な血液供給を必要とします。網膜循環には、脈絡膜血管供給視細胞間内部の網膜がサポートしています。網膜の血流の変化、緑内障や網膜枝静脈閉塞糖尿病性網膜症を含む、多数の視力を脅かす障害に。網膜と眼疾患の中にどのようにこれらの変更を介して血流の調節に関わる分子機構の解明は、これらの条件の処置のための新しいターゲットの同定に 。網膜の細動脈は網膜の主要な抵抗血管であり、その結果、内腔の直径の変化を通じて網膜循環動態の調節に重要な役割を果たします。近年では、細胞生理学を含むアプリケーションの広い範囲のために適しているラット網膜の細動脈を分離する方法を開発しました。どのように血流が網膜内で制御して眼疾患中に発生する主な変更のいくつかを識別することができましたに新しい洞察力をもたらすこの準備が始まっています。この記事では、ラット網膜細動脈の隔離のための方法を説明およびパッチ ・ クランプ電気生理学、カルシウム イメージング、圧力図法の研究の使用のためのプロトコルが含まれます。これらの血管は PCR - 西部にしみが付くと免疫組織化学-ベースの研究での使用に適しています。

本稿では、電気生理学的、カルシウム イメージングおよび圧力図法試験に使用することができますラット網膜の細動脈の隔離のための簡単なプロトコルについて説明します。

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

糖尿病性網膜症、緑内障、枝静脈閉塞症など、視力を脅かすさまざまな網膜疾患の発症には異常な血流が関与しているため、網膜の血流がどのように制御されているかを理解することは重要な目標です。網膜細動脈は、網膜の血管を取り囲む平滑筋細胞の収縮性の変化によって媒介され、管腔径を拡張および収縮することにより、網膜内の血流の調節に重要な役割を果たします。したがって、網膜灌流の調節の根底にある分子メカニズムを理解するには、網膜細動脈平滑筋細胞にアクセスし、可能な限り生理学的に近い条件で研究できる準備が必要です。このビデオでは、パッチクランプ、カルシウムイメージング、および圧力筋造影研究で使用できるラット網膜からの細動脈の単離のための簡単なプロトコルを示します。過去数年にわたり、この製剤は、血管平滑筋の収縮性と網膜の血流の調節に関するさらなる洞察を提供するために使用されてきました。材料表に示すように、ハンクスまたはLCHを含む低カルシウムの1リットル溶液を作ります。組織を採取する前に、アイソレーション装置を組み立ててください。ガラスパスツールピペットは、滑らかにするためにファイヤーポリッシュする必要がありますが、先端を狭くすることはできません。プラスチック製ピペットを約5〜7ミリメートルの開口部にトリミングします。LCH溶液に浸した解剖皿に目を置きます。1セットの鉗子を使用して、眼窩筋の付着部または視神経を保持して、目を皿に固定します。目を安定させるために、固定点が強膜にできるだけ近くにあることを確認してください。ブレードを使用して、ora serrataに沿って角膜を切断し、鉗子で強膜を優しく押してレンズを取り外します。この画像で目の後ろに見える小さな円形の領域が視神経です。ブレードを使用して、視円板を通してアイカップを対称的に半分にカットします。閉じた鉗子を使用して、視神経乳頭に残っている付着物を取り除くように注意しながら、アイカップの2つの半分から網膜をそっとブラッシングします。2番目の目でこのプロセスを繰り返し、プラスチックピペットとLCH培地の小さな滴を使用して、解剖した網膜を試験管に移します。プラスチック製のピペットを使用して、試験管にLCHを約5ミリリットルまで満たし、網膜をチューブの底に沈殿させます。チューブから約4ミリリットルの溶液を取り出し、プラスチックピペットを使用して新しいLCHを追加して、ティッシュを約3回洗浄します。必要に応じて、無関係な組織を取り除く必要があります。ガラスパスツールピペットの内側をLCHで磨かれた先端で洗い、ティッシュがピペットに付着しないようにします。同じピペットを使用して、試験管から約4ミリリットルの溶液を取り出し、約2ミリリットルの新鮮なLCHを追加します。ガラスピペットの先端から組織をゆっくりと引き込み、網膜を穏やかに解離させ、内容物を試験管に排出します。この段階で気泡を導入しないようにし、網膜が約2〜3ミリメートル四方のサイズに壊れるまでこのプロセスを繰り返します。ピペットの内側を約2ミリリットルのLCHで洗浄し、これを試験管に排出します。内容物が5〜10分かけて底に落ち着くのを待ちます。ティッシュピースのサイズが約1mm四方になるまで、前に説明したようにもう少し力を入れてトリチュレーションプロセスを繰り返します。組織が落ち着くのを待ち、内容物が完全に均質化され、網膜の断片が残らなくなるまで、さらに強い力でもう一度繰り返します。この段階の解決策は、見た目は乳白色に見えるはずです。この技術は、分離ごとに最大8つの細動脈セグメントを生成し、長さは200〜2, 500マイクロメートルです。細動脈の一端をカニューレ挿入し、反対側の端を閉塞させることで、筋原性反応とも呼ばれる圧力誘発性血管収縮の測定が可能になります。細動脈圧筋造影は次のように行われます。レチナールホモジネートのアリコートは、倒立顕微鏡のステージに取り付けられた生理学的記録チャンバーに移されます。ホモジネートをチャンバーの底に少なくとも5分間沈殿させます。記録チャンバー全体を視覚的にスキャンして、長さが200マイクロメートルを超え、血管をカニューレ挿入できる開放端を持つ細動脈を特定します。細い鉗子と小さなタングステンワイヤースリップを船の上に置いて、船の一方の端を固定します。タングステンワイヤーの重なり合った端を使用して、開口端が加圧カニューレと一直線になるように、容器をバスを横切って水平に走るように操作します。カルシウムハンクスを摂氏37度でゼロカルシウムでチャンバーを灌流します。カニューレ挿入はガラスピペットで行います。カニューレは、微細なマイクロマニピュレーターを使用して血管の開放端に配置されます。先端は、顕微鏡の焦点面を調整することによって評価されるように、開口部のすぐ隣に配置され、血管の端とカニューレ先端の両方が同時に焦点を合わせ、加圧カニューレが血管の開口部に前進します。カニューレ挿入プロセスを支援するためにヘルパーピペットが必要であり、カニューレが血管内腔に進むと同時に、細動脈を優しく拘束し、細動脈壁を加圧カニューレ上に誘導するために使用されます。この手順では、高い成功率を達成するために、両方のマニピュレーターを同時に制御し、広範な練習を行う必要があります。水銀柱0ミリメートルで1分間記録した後、管腔内圧は水銀柱の40ミリメートルに上昇し、血管は急速に拡張し、カニューレ挿入が成功したことを確認します。圧力誘発性血管収縮、つまり筋原性反応は、その後約 15 分間で発症します。網膜血管平滑筋細胞からのパッチクランプ記録により、細胞内カルシウム、ひいては細胞の収縮性を調節する原形質膜イオン電流の研究が可能になります。以下のように、親細動脈内に埋め込まれた個々の平滑筋細胞から全細胞およびシングルチャンネルの記録が可能です。網膜細動脈は分離され、タングステンワイヤースリップで記録チャンバーに固定されます。パッチピペットと細動脈平滑筋細胞膜との間に高抵抗のシールを形成できるようにするために、基底椎弓板を消化する必要があります。細動脈は、摂氏37度で連続した一連の酵素溶液と過剰に融合され、画像の矢印で示されているように、隣接する細胞の電気的脱共役ももたらします。消化レベルは、コラゲナーゼステップ中の内皮層と平滑筋層の視覚的分離で最初に評価されます。基底椎弓板および/または末梢神経杭の残りのストランドの除去は、血管の表面に沿って細い鉗子の閉じた先端を慎重に掃くことによって達成されます。パッチクランプの場合、パッチピペットの先端を目的の細胞上に垂直に配置し、マイクロマニピュレーターの微細でゆっくりとした動きを使用して徐々に下げ、細動脈平滑筋膜に接触させます。これは、細胞の動きとピペット抵抗の変化によって判断され、取得ソフトウェアのセルシール試験プロトコルを使用して測定されます。ピペットをセル上に降ろすと、シール抵抗は約5倍に増加します。ピペットの背面に一時的に負圧が加えられ、徐々にギガシールが形成されます。これには、1〜5分間にわたって陰圧を繰り返し加える必要があります。全細胞記録には、穴あきパッチクランプ法が主に使用されます。前述のように、細胞内様溶液とアンホテリシンBを含むピペットでギガシールが形成されます。アクセス抵抗は、取得ソフトウェアのメンブレンテストプロトコルを使用して監視されます。アクセス抵抗が15メガオーム未満に低下すると、直列抵抗補償が実行されます。通常、穴あきパッチモードでは、直列抵抗を約75%補償することが可能です。その後、電圧ステップまたはランププロトコルを使用して、全セル電流を測定できます。網膜の解離後、一次細動脈、二次細動脈、および毛細血管前細動脈は、その口径と血管平滑筋細胞の配置に基づいて特定できます。1次細動脈と2次細動脈は、明視野顕微鏡下では視覚的に類似しているように見えますが、そのサイズに基づいて区別できます。毛細血管前細動脈は、製剤の中で最も小さな動脈血管であり、血管平滑筋細胞が断続的に配置されているため、容易に認識できます。単離された細動脈は、単離された細動脈内で毛細血管や細静脈と明確に区別できます。毛細血管は、直径約4〜10マイクロメートルの小口径血管の網目構造として明らかですが、細静脈は壁が薄く、平滑筋細胞の被覆が欠けています。一次細動脈、二次細動脈、および毛細血管前細動脈は、圧力筋造影、カルシウムイメージング、およびパッチクランプ研究に適しています。加圧細動脈を用いて、筋原性応答の生成に関与する分子メカニズムを調べてきました。この画像の顕微鏡写真は、圧力筋造影実験の過程のさまざまな時点でラット網膜細動脈を示しています。下の時間経過プロットは、実験の全過程における血管の直径の変化を示しています。加圧するとすぐに血管が拡張し、その後、15分後に定常状態に達する活発な筋原性収縮が続きます。実験の最後にゼロカルシウムハンクス溶液にワートマニンを添加すると、正常化のために血管がその受動直径まで拡張されます。このスライドは、膜伸長の前後に網膜細動脈平滑筋細胞からシングルチャネルのパッチクランプ記録を行った例を示しています。このオンセルパッチには、伸張活性化された2つのTRPV2チャンネルが含まれており、その活性はパッチピペットに負圧を加えると増加します。ここで説明するプロトコルは練習が必要ですが、最小限のトラブルシューティングで達成できるはずです。分離された細動脈は、隔離と同じ日に使用することをお勧めします。この方法はラット網膜細動脈に最適化されていますが、マウスの網膜にも使用できます。現在、この調製物を広く使用していますが、可能な場合は、ex vivo retinal whole-mountsと血管径と血流のin vivo測定を使用して、主要な所見の検証も試みています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

生体内ERGは、動物や人間の孤立した無傷の網膜から直接、網膜細胞の電気的活動を記録するために使用することができます。ここでは、網膜細胞の電気的活動を解剖するために、一般的なin vivo ERGシステムをex vivo...

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

多くのビジョンを脅かす眼疾患は、網膜血管の機能不全に関連付けられます。したがって、網膜血管応答の測定は、根本的な病態生理学的メカニズムを調査することが重要です。この記事では、マウスの網膜細動脈の分離と血管作動性物質の血管径に及ぼす影響を評価するために準備のための詳しいプロトコルについて説明します。...

マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順

ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3...

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

プロトコルは、マウス 神経網膜のorganotypic型外植体を記述し、その網膜色素上皮(RPE)と共に栽培され、R16で、血清および抗生物質を含まない。この方法は、 インビボ...

無条件網膜色素上皮を用いた、オルガマウス網膜の長期無血清栽培

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。...

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率に最適化されたマウス生後網膜内皮細胞の単離方法について説明しています。これらの細胞は、次世代シーケンシングアプローチに適しています。...

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。...

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。...

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

このプロトコルは、成体マウスから得られた網膜外植片の単離、解剖、培養、および染色の手順を提示し、説明しています。この方法は、糖尿病性網膜症などの異なる網膜神経血管疾患を研究するための ex vivo...

網膜神経血管疾患研究のための ex vivo モデルとしての成体マウス網膜網膜の外植片

酸化ストレスやサイトカインなどの糖尿病/糖尿病性網膜症関連の侮辱による死に対する網膜血管系の回復力を監視するために、保護アッセイが開発されました。...

マウスの糖尿病関連死からの網膜血管系の保護を検出するためのアッセイ

ここでは、マウスの眼から網膜を分離し、 ex vivo での長時間の実験を行うための詳細な方法論を提供します。このプロトコルは、生体組織中に網膜グリア をin situ...

マウス網膜におけるグリア相互作用を研究するための ex vivo 外植片モデル

学ぶラット網膜細動脈の隔離法。電気生理学、カルシウムイメージング、圧力マイオグラフィーを用いて血管平滑筋の収縮性と網膜血流調節を研究するための実験手法を解説します。

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

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