齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始
2019年1月19日
急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性 4-アミノピリジン皮質発作モデルについて述べる。
この方法は、電解発作の発症と終了に責任を持つ神経亜集団などの発作メカニズムの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが臨床観察されたものを連想させる、オンデマンド、およびインビボおよびインビトロモデルの電図発作事象を再現できることである。この技術は、異なる抗けいれん薬候補の適用中に電解発作事象を引き起こそうとすることによって、潜在的な抗発作療法を探索するためにも使用することができる。
皮質スライスを準備するには、インスタント接着接着剤を使用して、ビブラートメステージに前臨床脳組織を接着します。静かに、スペシミンホルダーをバッファートレイに入れます。脳の後ろ部分がビブラートメのブレードに面していることを確認します。
脳を450マイクロメートルの厚い部分にスライスし、腹側方向に裏側に入れます。嗅球を取り除くために前臨床動物の脳の最初のカットを行います。次いで、体性感覚運動領域が観察されるまで、その後の切削を行う。
広いボアピペットを使用してください。ターゲットとなるコロナスライスを、冷解解液を含むペトリー皿に移します。コロナスライスの場合は、新皮質のコミュニケーションのすぐ下に横断的なカットを行い、正中線で切断して半球を分離します。
その後、新しいカミソリの刃を使用して、スライスから余分な組織を切断します。脳スライス手順を効率的に実行することが重要です。.脳組織がACSFに沈んでいないすべての瞬間は、その品質に有害である。
損傷を受け、質の悪い脳組織は、電図発作イベントを発生させる可能性が低い。新皮質を含むコロナスライスの後部を、摂氏35度のACSFで満たされた2番目のペトリー皿に一瞬移します。次いで、速やかに35°Cのカルボゲン化ACSFを含むインキュベーションチャンバーにスライスを移す。
脳スライスを35°Cのインキュベーションチャンバーにわずかに水没させて30分間放置します。その後、水浴からインキュベーションチャンバーを取り出し、室温に戻す。電気生理学的記録を行う前に、脳のスライスが回復するまで1時間待ちます。
この手順では、脳スライスよりもわずかに大きいレンズペーパーを切り取ります。広孔ピペットまたはディテールブラシを使用して、歯科用トゥイザーを使用して所定の位置に保持されている切り取られたレンズ紙に脳スライスを移します。次に、脳スライスを含むレンズペーパーを記録チャンバーに移し、ハープスクリーンで位置に固定します。
その後、1分間に3ミリリットルの速度で35°Cでカルボゲン化ACSFを記録チャンバーで脳スライスを使い過ごします。デジタル温度計を使用して、記録チャンバーが摂氏33~36度であることを確認します。次に、ハミルトンシリンジを使用して、ACSFの10マイクロリットルでガラス電極をバックフィルします。
20倍の実体顕微鏡の下で、手動マニピュレータを使用して、記録ガラス電極を表面皮質層(2、3)に導きます。標準的なソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気的な発作のような活動を誘発するために、100マイクロモルで4-APを含むACSFで脳スライスを多量に使用する。
標準的なソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気的発作のような事象を生成するには、光遺伝学的マウスの脳スライスに光遺伝学的戦略を用いて、手動マニピュレータを使用して、記録領域の真上に1,000ミクロンのコード直径光ファイバーを配置します。青い光の短いパルスを適用して、イクタルイベントを開始します。
ユーザーフレンドリーなMATLABベースのプログラムは、インビトロおよびインビボ4-AP発作モデルで発生する様々なタイプのてんかん事象を検出し、分類するために特別に開発されました。この検出プログラムは、ヴァリアンテ研究所の GitHub リポジトリから入手できます。100マイクロモル4-APを若年性VGATチャネルロドプシンマウスから良質の450ミクロンサイズの皮質脳スライスに適用し、15分以内に再発性イクタル様事象を確実に誘導した。
100マイクロモル4-APを低品質のスライスに適用すると、イベントが破裂したり、アクティビティがスパイクしたりしました。平均して、各解剖前脳からのスライスの40%が、正常にイクタル状のイベントを生成した。さらに、解剖されたマウスの83%は、少なくとも1つの脳スライスをもたらし、イクタルのような事象を正常に生成した。
自発的に起こるictal様事象を有する脳スライスでは、脳スライスに短い30ミリ秒光パルスを適用し、形態において同一のictal様事象を確実に引き起こした。同じ発見は、あなたの1つのチャネルロドプシン2匹のマウスからの脳スライスで行われました。したがって、どのニューロン亜集団が活性化されたかに関係なく、孤立した皮質ニューラルネットワークにおける短い同期イベントは、ictal様事象の発症につながった。
これらの氷のような事象は、センチネルスパイク、強壮剤のような発射、クロニックのような発射、および終わりに向かってバーストのような活動で構成されていました。彼らは本質的に臨床発作に関連する電解署名と類似していた。この手順に従って、脳状態遷移の基礎となる神経生物学的メカニズムは何であるかのような質問に対処するために、他のタイプの脳状態遷移を行うことができます。
そして、様々な病理学的脳状態への侵入を防ぐために、これらの移行をどのように調節できるでしょうか?
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概要
本研究では、4-アミノピリジンを用いた急性発作モデルに着目し、マウスおよびヒトの大脳皮質組織におけるてんかん様活動のメカニズムを調査します。必要に応じて電気生理学的な発作イベントを誘導できるため、発作の開始および終結に関連するニューロンの挙動を詳細に検討することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- てんかん研究
背景
- 発作の根底にあるメカニズムを理解することは、効果的な治療法を開発するために極めて重要です。
- 急性発作モデルを用いることで、発作のダイナミクスをリアルタイムで観察することが可能になります。
- 電気生理学的記録により、発作の開始と伝播に関する知見が得られます。
- この手法は、抗発作薬の試験において応用できる可能性があります。
研究目的
- 発作の開始および終結を担う神経サブポピュレーションを探索すること。
- 潜在的な抗発作療法の有効性を、制御された条件下で評価すること。
- 皮質脳スライスにおける発作様イベントの特性を調査すること。
使用した手法
- 本研究では、マウスおよびヒト組織から作製した急性皮質脳切片を使用した。
- 4-アミノピリジンによって誘発されるてんかん様活動を測定するため、電気生理学的記録を行った。
- 組織の生存性を確保するため、詳細な切片作製およびインキュベーションプロトコルを採用した。
- 正確な光刺激によって発作イベントを誘発するため、オプトジェネティクス戦略を組み込んだ。
- てんかん様イベントを検出および分類するため、MATLABベースのソフトウェアを開発した。
主な結果
- 本プロトコルにより、4-AP添加から15分以内に、高品質な脳切片において信頼性の高い発作様イベントが誘発された。
- 切片の40%でこれらのイベントの生成に成功し、組織調製が効果的であることが示された。
- 反応には、特徴的なセンチネルスパイクおよび、てんかん活動を示すさまざまな発火相が含まれていた。
- 異なるマウスモデル間でも同様の結果が観察され、本手法の堅牢性が浮き彫りになった。
結論
- 本研究では、電気的な発作を誘発し解析するための信頼性の高い手法を提示しており、てんかんに関与するニューロンメカニズムへの洞察を提供します。
- これらの知見は、in vivoおよびin vitroにおける発作ダイナミクスの探索を支持するものです。
- これらのメカニズムを解明することで、てんかんおよびその他の関連疾患に対するより優れた治療戦略につながる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
急性皮質モデルにおいて、電気的な発作イベントをオンデマンドで誘導することで、発作の開始および終了の根底にある神経メカニズムの精密な検証が可能になります。この手法は、定義された電気生理学的表現型に対する抗発作化合物の効果を再現性高く定量的に評価することを可能にし、てんかん薬物開発におけるターゲットバリデーションおよびメカニズム的なリスク低減を支援します。また、齧歯類とヒト組織の両方に適用可能であるため、種をまたいだ治療仮説の検証が促進され、トランスレーショナルな有用性が高まります。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： オプトジェネティクスまたは薬理学的なトリガーを用いて、電気生理学的な発作の開始および終了に関与する特定の神経細胞サブポピュレーションの解析を可能にする。
- 実用的価値： 特定の神経経路を調節することで発作様イベントを防止または修飾できるかどうかを評価するための再現可能なプラットフォームを提供し、標的仮説の検証を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： ハイコンテントスクリーニングに適した、定義された形態（センチネルスパイク、強直間代性発火、バースト活動）を持つ定量可能な電気生理学的発作様イベントを生成する。
- 運用的価値： 4-AP、光遺伝学的パルス、または神経伝達物質パフによる発作イベントの標準化された誘導を可能にし、研究室間での一貫した化合物試験を実現する。
- 科学的価値： オンデマンド誘導中の発作頻度、持続時間、または電気生理学的特徴への影響を測定することにより、抗てんかん薬候補の評価を容易にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ヒト皮質組織を用いて臨床的に関連のある発作様イベントを生成し、治療効果に対する予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：誘発されたイベントが臨床的な電気生理学的徴候を再現することを検証することで、急性スクリーニングから慢性てんかんモデルへの連続性をサポートする。
- 科学的価値：特定のニューロン操作と発作ダイナミクスの変化を関連付けることでメカニズムに基づくリスク低減を可能にし、前臨床段階へ進めるためのターゲット選択に有用な情報を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、リード最適化に先立つターゲットバリデーションおよび化合物スクリーニングのための生理学的に妥当なアッセイを提供することで、初期の創薬ワークフローに統合されます。
- 基礎生物学研究：皮質ネットワークにおける発作イベントを精密かつオンデマンドに誘発することで、発作開始の根底にある神経メカニズムの仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：アッセイの標準化および化合物比較に不可欠な、再現性のある定量的な電気生理学的リードアウト（イベントの頻度、形態、持続時間）を提供します。
- 分析：MATLABベースのソフトウェアによるてんかん様イベントの検出および分類を可能にし、発作ダイナミクスに対する化合物の影響を評価するための客観的な指標を提供します。
- トランスレーショナル研究：ヒト組織を使用することで疾患との関連性を担保し、基礎研究での知見を前臨床および臨床的なてんかん研究へとつなげます。
- 組織内での再利用：複数のプロジェクトや治療法にわたって、多様な抗発作メカニズムを評価するための標準化されたスケーラブルなプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：発作の発生および伝播の神経メカニズムにおける曖昧さを軽減し、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を高めます。
- 運用上の価値：齧歯類およびヒト組織標本における発作誘発の再現性と拡張性を向上させ、マルチサイトでのスクリーニングキャンペーンを支援します。
- 戦略的価値：定義された電気生理学的エンドポイントに対する抗発作化合物の効果を迅速かつ定量的に評価可能にすることで、go/no-go判断の効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：臨床的に関連のあるモデルにおける発作様事象を抑制または修飾する能力に基づき、リスク調整後の化合物の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 電気生理学、組織切片作成、および光遺伝学的または薬理学的な発作誘発技術の専門知識が必要です。
- 電気生理学的記録、精密な溶液灌流（例：4-AP、ACSF）、および光刺激（光遺伝学的トリガー用）のための装置に依存します。
- 組織の質が成功率に直接影響するため、切片の生存能と一貫した発作イベントの発生を確保するための標準化された組織調製プロトコルが必要です。
- げっ歯類モデルからヒト組織モデルへ移行する際は、誘発パラメータ（例：4-AP濃度、光パルス持続時間、神経伝達物質のパフ量）の調整が必要です。
- 実用上の制限として、切片の質のばらつきがあり、調製および記録中に組織の状態を維持するための熟練した取り扱いが求められます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
