Name: ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ温度勾配試験によるショウジョウバエ幼虫の好適温度決定法。連続的な温度範囲で集団の温度選択性を評価し、体性感覚メカニズムの理解に貢献します。

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C. m. は NIDCD (DC007864、DC016278) (EY008117、EY010852)、ネイから資金援助によってサポートされて、NIAID (1DP1AI124453)。

<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
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<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
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</ol>

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このプロトコルの成功を確保するため、幼虫の実験を行うための十分な番号を取得する手順を取ることが重要です。あらかじめ産卵を改善するために 2-3 d 酵母貼り付け含むバイアル中のハエを餌が含まれます。バイアルは水の瓶を含むトレイに置かれ、食品の水分を保持し、通常の光サイクルへの露出を確保しながらの幼虫によって効果的な摂食を促進する透明なプラスチック袋に封入する必要があります。ただし、ハエが引っかかるので、ソフトに酵母ペーストしないでください。バイアルあたりの女性の数は遺伝子型に依存します。W1118、場合通常 12 〜 女性と 〜 6 男性 3 h の卵を産むために十分なです。通常 2 バイアルは単一方向の試金のため十分な幼虫 (幼虫 100-200) 皿の上に配置するを提供します。フライのストックが野生型よりも少なく卵を産むか、孵化幼虫の割合が減少 (30-35/バイアル) まで追加女性と男性を追加します。
これらのアッセイを実行するとき、予期せぬ変動の多くの原因があります。発達段階、幼虫の温度選好に影響を与えます。したがって、定義された段階...

モバイル動物によって温度走性を採用して、最も有利な条件1,2,3環境を選択します。過度に熱いまたは冷たい気候になった場合、この動作は生存に不可欠です。さらに、多くの動物は快適な範囲の温度の非常に小さい相違に敏感であるし、理想的な温度環境を模索します。これは、環境と自分の体の温度を平衡ショウジョウバエなど poikilothermic 生物にとって特に重要なのです。幼虫の温度走性を監視するための試金は識別し、ショウジョウバエ一過性受容体電位 (TRP) チャネル4,5,6など分子センサーの役割を明確に尽力しています。ロドプシン7、8、およびイオン型受容体受容体 (IRs)9、異なった温度較差上の温度感度を持つこれらの動物のため。
双方向の選択のテストは、幼虫6,7熱の好みを勉強する 1 つの方法を提供します。アッセイは、2 つの異なる温度ゾーンを確立することを伴なうし、動物他の上の 1 つの側面を選択することができます。双方向選択テストの結果は、堅牢な 2 つのオプションの間の温度差が大きい場合に特にすることができます。さらに、各分析には集計のみ 2 つのグループが含まれているので、データはシンプルな設定インデックスとして表現できます。使いやすさと双方向選択の試金のシンプルさは、遺伝子スクリーニングに適しています。しかし、主要な制限は、多くの実験動物の野生型や突然変異体の最寄りの温度を確立する必要は。
グラデーションのアッセイでは、単一のアッセイ8最寄りの温度を確立する機会を提供しています。さらに、双方向の選択テストとは異なり温度の連続的な範囲に直面したとき、動物の集団の分布の評価が可能です。1 つのグラデーション アッセイ ペトリ皿と単一動物を使用し、個々 の動物10の詳細な動作評価に適しています。ただし、ペトリ皿はラウンドなので温度ゾーンのサイズによって異なります、中心からの距離に応じて徐々 に小さい。したがって、このセットアップは、動物の集団の温度の選択のモニタリングに最適ではありません。
幼虫のグループの温度の設定を評価するために適しています連続熱勾配装置は、長方形のアリーナを採用し、ここに記載されています。装置は簡単に構築し、組み立てます。また、グラデーションは線形で、42 ° C まで 10 ° C から広い温度範囲で温度走性を評価するために使用することができますは、柔軟です、試金は迅速かつ簡単に実行を再現性のあるデータが得られます。幼虫の支持された温度のレポート作成に加えて、それは単一の実験で線形範囲全体に対する動物の人口の好みを明らかにします。これらの利点のための温度走性に関与する遺伝子を特定するための優れた選択肢です。

<table><tbody><tr><td>グラジエントアッセイ装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, 冷蔵・加熱 6L 循環バス</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>このモデルは販売を終了しています。更新された交換モデルには、120 V、60 Hz用の1186R00および1197U04、または240 V、50Hz用の1184L08および1197U04が含まれます。</td></tr><tr><td>アルミニウムアッセイプレート(単一方向グラジエント用)</td><td></td><td></td><td>外寸:14 x 10.1 x 0.9 cm、内寸:12.9 x 8.7 x 0.8 cm、黒色アルマイト。</td></tr><tr><td>アルミプレート(双方向グラデーション用)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0.2 cm、ブラックアルマイト。</td></tr><tr><td>アルミブロック</td><td></td><td></td><td>の外形寸法:25.5 x 5 x 1.4 cm、内部チャネルのパラメータを図1Dに示します。</td></tr><tr><td>アルミブロックとチューブ用コネクタ</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon サニタリーシリコンチューブ</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</strong</td><td><>strong>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Itemsアッセイ用試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>1.5 mL 微量遠心チューブ用乳棒</td></tr><tr><td>温度計</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>熱電対</td><td></td><td>Fluke K タイプ</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルマイクロプレート蓋</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>ラベリングテープ(双方向グラジエント用)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-951</td><td>フィッシャーブランドラベリングテープ 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>インビトゲン</td><td>16500500</td><td>1%溶液を調製</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S0389-5KG</td><td>アッセイ開始直前に18%溶液を調製</td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>デンビル</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>スクープラ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 丸型広口ボトル</td><td>パイレックス</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (300 mm 細孔)</td> <td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>幼虫洗浄用オプション</td></tr><tr><td>段ボール箱 (バイアルトレイ)</td> <td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>22,400 mL</td></tr><tr><td>コーンミール、イエロー(極細メッシュ、植毛) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>ブリューワーズ酵母 100 ポンド</td><td>MP バイオメディカル</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg;大豆粉 (10 kg/unit)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila 寒天、Type II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo light corn syrup</td><td>Karo</td><td></td><td>1,700 mL</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoate (200プルーフエタノールに懸濁</td>)<td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>リン酸&nbsp;ACS試薬、&ge;H2O Sigma</td><td>Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8.5 mL 中 85 wt</td>.</tr></tbody></table> %

ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

ミバエショウジョウバエを含む多くの動物は、肥えた最寄り熱風景を模索することができます環境温度のわずかな違いが可能です。幼虫の温度の設定を定義すると、定義された線形範囲にわたって、温度勾配を使用してアッセイを開発しました。単一方向のグラデーションを確立するには、2 つのアルミ ブロックは個々 のブロックの温度を制御する独立した水のお風呂に接続されます。2 つのブロックは、グラデーションの上下限値を設定します。温度勾配は、プレート間の距離にまたがる 2 水制御ブロックをアガロース コーティング アルミ プレートを配置することによって確立されます。水ブロックの上に設定されているアルミ板の両端の最小値と最大温度を定義および中間の地域 2 つのブロックを形成する線形温度勾配。グラデーションのアッセイの幼虫に適用できるし、TRP チャネルと温度差別に必要なオプシン遺伝子に影響を与える突然変異などの表現型を示す変異体を識別するために使用することができます。

18 ° C から 28 ° C の単一方向を確立するには、グラデーション、2 つの水のお風呂の温度を 16.8 ° C と設定 31 ° C我々 はすべての 6 ゾーン、ゾーン間の境界線の上部と下部の部分内の 26 の位置に agarose のゲルの表面 (図 2, 2 e) の極端な両端の温度を測定することによって 13 点の温度を取得します。グラデーションの温度分布はほぼ線形 (Y = 0.9672 * X + 16.19、R2 = 0.9961) (図 2 e)。
我々 は様々 な年齢での制御 (w1118) の幼虫の温度の設定を試金。1st (24 ± 1.5 h AEL)、2nd (4...

ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

この方法は、体性感覚、ショウジョウバエ・メラノガスターなどの動物が好ましい環境温度を選択するメカニズムの分野における重要な問題に対処するために使用できます。この手法の主な利点は、連続的な温度範囲に直面したときに、1回のアッセイで幼虫のグループの好ましい温度を確立できることです。ショウジョウバエの幼虫の温度嗜好に関する洞察を提供するだけでなく、インプレスプレートは、ワーム、Cエレガンスなどの他のモデル生物との使用にも適合させることができます。まず、クロス用のバイアルを準備するためのイーストペーストを作ります。酵母顆粒を蒸留水で混合し、乳棒でペースト状に挽く。次に、食品の表面のすぐ上にある標準的なショウジョウバエバイアルの内壁近くにイーストペーストを軽くたたきます。幼虫を産むには、12〜35匹のメスと最大半分のオスを集めますが、オスは10匹以下にします。これらのグループを酵母ペースト含有バイアルに組み合わせます。準備したバイアルを100バイアルトレイに入れます。湿度を確保するために、トレイに水を入れた20本の開いたバイアルを含めます。次に、トレイを透明なビニール袋に密封し、摂氏25度で48時間インキュベートします。48時間の給餌と交尾の後、ハエを新しいフードバイアルに移して卵を集めます。それらをタップします。二酸化炭素は使用しないでください。次に、ハエが摂氏25度で3時間卵を産むのを待ちます。後で、成虫を取り出し、卵の入ったバイアルを水バイアルと一緒にトレイに戻し、バッグを閉じます。次に、卵を摂氏25度で目的の幼虫期まで成長させます。一方向グラジエントを調製するには、まずアッセイ用のヒト周囲環境を作成します。濡れたペーパータオルの上に、別々のウォーターバスに接続された2つのアルミニウムブロックを10センチ離して置きます。ウォーターバスは事前に温める必要があります。次に、100ミリリットルの1%アガロースを作成し、水平な表面の各アッセイプレートに25ミリリットルを追加します。アガロースが固まったら、メラミンスポンジで表面をやさしくこすり、表面を少し粗くします。次に、効率的な温度移動を促進するために、アッセイプレートのアルミニウムブロック間の隙間をスプレーボトルから供給される水で埋めます。次に、アッセイプレートをアルミニウムブロックに置き、境界がどちらかの端から2センチメートル離れて、アルミニウムブロックの端と正確に一致することを確認します。次に、ゲルが乾かないように、プレートの表面に水の膜をスプレーします。次に、システムを段ボール箱で覆って蒸発を減らし、ゲル表面の温度を安定させます。温度が平衡化するまで5〜10分待ちます。次に、プレートの表面温度を少なくとも12か所で確認して、全体的に温度が均一であることを確認し、摂氏2度前後します。その後、アッセイが実行されるま

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本稿では、熱痛覚を勉強するためのアッセイを実証...

に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

このビデオでは、味覚選好アッセイについて説明しています。これは、好みの物質を摂取した後のハエの腹部の色を評価することにより、味が異なる色付きの溶液への引きつけまたは回避を測定するために使用される行動方法です。注目のプロトコルは、さまざまなショ糖濃度の溶液に対するハエの好みを測定するために使用される手順を示しています。...

Taste Preference Assay:ショウジョウバエの摂食行動を測定する方法

ショウジョウバエの幼虫は、専用の感覚ニューロン(侵害受容器)を持っており、その反応が潜在的に有害な熱刺激に対する反応が、動物に嫌悪的、またはいわゆる「侵害的」行動を引き起こします。このビデオでは、キューティクルに熱プローブを局所的に適用した場合の幼虫の行動を記録することにより、熱侵害受容を評価する方法について説明します。したがって、この方法は局所熱プローブアッセイと呼ばれます。...

局所熱プローブアッセイ:ショウジョウバエ幼虫の高温の侵害受容を評価する方法

ショウジョウバエは温度の小さな変化を区別できるため、好ましい温度条件の環境を選択できます。このビデオでは、ショウジョウバエの幼虫の温度選好を線形の温度勾配でテストする行動アッセイについて説明します。...

温度勾配アッセイ:ショウジョウバエの幼虫の温度選好性を試験する方法

我々は最近、ハエの好ましい温度が日中に上昇し、夜の間に落ちる新しい ショウジョウバエ 概日出力、温度好みリズム(TPR)を同定した。TPRは、別の概日出力、運動活動から独立して規制されています。ここでは、...

ショウジョウバエにおける温度嗜好挙動とその概日リズムの設計と解析

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幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

ここでは、 ショウジョウバエの幼虫に冷たい痛覚を研究するための新規なアッセイを示しています。このアッセイは、焦点有害冷たい刺激を印加することが可能な特注のペルティエプローブを利用し、定量化可能な冷たい固有の動作になります。この技術は冷たい痛覚の更なる細胞および分子解剖を許可します。...

冷痛覚のための新規アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

ここで時間と空間で高速かつ正確な温度変化を生成するプログラム可能な温度制御のアリーナを使用して温度変化でショウジョウバエの歩行のパフォーマンスを自動的に決定するためのプロトコルを提案する.

空間と時間の温度変化に対応したショウジョウバエのパフォーマンスを決定する自動化された方法

熱制限は、急速な気候変動に直面した場合に貴重な情報である生物が許容する環境を予測することができます。ここでは、昆虫の重要な熱ミニマと熱ノックダウン時間を評価するためのハイスループットプロトコルを説明します。両方のプロトコルは、スループットを最大化し、アッセイのコストを最小限に抑えます。...

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昆虫は、彼らが内にとどまろうとする最適な環境温度範囲を持っており、多くの外的および内的要因がこの好みを変える可能性があります。ここでは、昆虫が自然の行動を自由に発揮できるようにする、温度選択を研究するための費用効果が高く簡単な方法について説明します。...

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このレポートでは、インキュベーターチャンバー内の空気伝導熱ストレッサーに応答して、Drosophila Activity Monitor(DAM2)を使用して成虫のDrosophila...

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学ぶ温度勾配試験によるショウジョウバエ幼虫の好適温度決定法。連続的な温度範囲で集団の温度選択性を評価し、体性感覚メカニズムの理解に貢献します。

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