2018年6月25日
ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.
この方法は、体性感覚、ショウジョウバエ・メラノガスターなどの動物が好ましい環境温度を選択するメカニズムの分野における重要な問題に対処するために使用できます。この手法の主な利点は、連続的な温度範囲に直面したときに、1回のアッセイで幼虫のグループの好ましい温度を確立できることです。ショウジョウバエの幼虫の温度嗜好に関する洞察を提供するだけでなく、インプレスプレートは、ワーム、Cエレガンスなどの他のモデル生物との使用にも適合させることができます。
まず、クロス用のバイアルを準備するためのイーストペーストを作ります。酵母顆粒を蒸留水で混合し、乳棒でペースト状に挽く。次に、食品の表面のすぐ上にある標準的なショウジョウバエバイアルの内壁近くにイーストペーストを軽くたたきます。
幼虫を産むには、12〜35匹のメスと最大半分のオスを集めますが、オスは10匹以下にします。これらのグループを酵母ペースト含有バイアルに組み合わせます。準備したバイアルを100バイアルトレイに入れます。
湿度を確保するために、トレイに水を入れた20本の開いたバイアルを含めます。次に、トレイを透明なビニール袋に密封し、摂氏25度で48時間インキュベートします。48時間の給餌と交尾の後、ハエを新しいフードバイアルに移して卵を集めます。
それらをタップします。二酸化炭素は使用しないでください。次に、ハエが摂氏25度で3時間卵を産むのを待ちます。
後で、成虫を取り出し、卵の入ったバイアルを水バイアルと一緒にトレイに戻し、バッグを閉じます。次に、卵を摂氏25度で目的の幼虫期まで成長させます。一方向グラジエントを調製するには、まずアッセイ用のヒト周囲環境を作成します。
濡れたペーパータオルの上に、別々のウォーターバスに接続された2つのアルミニウムブロックを10センチ離して置きます。ウォーターバスは事前に温める必要があります。次に、100ミリリットルの1%アガロースを作成し、水平な表面の各アッセイプレートに25ミリリットルを追加します。
アガロースが固まったら、メラミンスポンジで表面をやさしくこすり、表面を少し粗くします。次に、効率的な温度移動を促進するために、アッセイプレートのアルミニウムブロック間の隙間をスプレーボトルから供給される水で埋めます。次に、アッセイプレートをアルミニウムブロックに置き、境界がどちらかの端から2センチメートル離れて、アルミニウムブロックの端と正確に一致することを確認します。
次に、ゲルが乾かないように、プレートの表面に水の膜をスプレーします。次に、システムを段ボール箱で覆って蒸発を減らし、ゲル表面の温度を安定させます。温度が平衡化するまで5〜10分待ちます。
次に、プレートの表面温度を少なくとも12か所で確認して、全体的に温度が均一であることを確認し、摂氏2度前後します。その後、アッセイが実行されるまでボックスカバーを元に戻します。きれいな幼虫を分離するには、まず50ミリリットルの試験管に約40ミリリットルの18%ショ糖溶液を追加します。
次に、スクーピュラを使用して、食物の山から幼虫を溶液に移します。次に、スクーピュラを使用して、幼虫を溶液で完全に混ぜます。次に、幼虫がチューブの最上層に浮かぶまで30〜60秒待ちます。
次に、幼虫の入った溶液を別の50ミリリットルのチューブに注ぎ、新鮮な18%スクロースを注ぎます。再び、幼虫が浮かぶのを待ちます。食べ物の存在は結果に影響を与える可能性があります。
したがって、再現性のある結果を得るためには、幼虫を徹底的に洗浄し、食品による汚染を最小限に抑えることが重要です。幼虫への損傷を避けるために、優しく行ってください。次に、50ミリリットルのチューブの上に300ミクロンのセルストレーナーを置き、ショ糖溶液の表面から死んだ成体や浮遊する破片を取り除きます。
次に、幼虫をストレーナーに注ぎ、メッシュスクリーンに収集します。次に、約50ミリリットルの水をストレーナーに2回流して、幼虫をさらに洗浄します。次に、空の35ミリメートル皿に、水を使用してストレーナーからほとんどの幼虫を洗い流します。
ペイントブラシを使用して、メッシュ上の残りの幼虫を転写します。次に、マイクロピペットを使用して皿からほとんどの水を吸い上げます。次に、幼虫が逃げられないように、皿の蓋を逆さまに置きます。
次に、アッセイを開始する前に、幼虫を10〜20分間回復させます。まず、ジェルの上に段ボール箱を取り出し、すぐにゲルの表面温度を確認します。表面が乾燥している場合は、表面に少量の水をスプレーします。
ゲルが良好な場合は、小さな絵筆を使用して、各プレートの中央に100〜200匹の幼虫をロードします。次に、各アッセイプレートに蓋をして幼虫を捕獲し、光への曝露を防ぐためにセットアップを段ボール箱で覆います。現在、アッセイが進行中です。
10〜30分後、段ボール箱とマイクロプレートの蓋を外します。次に、プレートを上から撮影して、幼虫の位置を記録します。ジェルの表面での反射を避けるために、ボックスをカメラの上に置きます。
プレートをクリーンアップするには、散らばった可能性のある場所にすべての幼虫を吸引します。次に、画像解析ソフトウェアを使用して、各ゾーンの幼虫の分布の割合を計算します。アッセイプレートの境界に基づいて2センチメートルごとに線を描き、各ゾーンの幼虫の数を数えます。
カウントするときは、ゲルの厚さと温度条件がエッジの近くで均一ではないため、各エッジから0.5センチメートルの隆起に分布する幼虫は無視してください。摂氏18度から摂氏28度では、摂氏16.8度と摂氏31度に設定されたウォーターバスを使用して、一方向の勾配が作られました。勾配に沿った温度分布はほぼ線形であることがわかりました。
対照幼虫は、さまざまな年齢でアッセイされました。1番目、2番目、および3番目の初期の初期に、幼虫は摂氏24度ゾーンでピークの好みを示しました。3番目のインスターの中頃、ほとんどの幼虫は摂氏18度のゾーンに蓄積しました。
さまようことのない後期3齢の幼虫は、摂氏18度のゾーンに密集していました。対照系統の摂氏18度ゾーンに蓄積する傾向は、White 1118であり、エッジ効果によるものではなく、後期の3齢幼虫は依然として摂氏18度ゾーンに蓄積しており、双方向の勾配を使用していました。温度の識別に必要な3齢後期から3齢幼虫の変異を解析したところ、結果が変わりました。
trpA1にヌル変異を持つ幼虫は、摂氏18度から摂氏28度の勾配全体に均等に分布しています。また、AアイソフォームとBアイソフォームのみ、またはtrpA1のCアイソフォームとDアイソフォームが欠損した幼虫も重篤な障害を示した。ホスホリパーゼcベータをコードする2つの遺伝子の1つであるnorpAに変異を持つ幼虫も破壊されました。
しかし、他のホスホリパーゼcβ、plc21cをコードする遺伝子に変異を持つ幼虫は、正常に振る舞った。このビデオを見れば、連続的な温度勾配を使用して再現性のある結果を得る方法について明確に理解できるはずです。これにより、野生型と突然変異型のショウジョウバエの幼虫の温度選好を比較できるようになります。この手法を習得すれば、1回のアッセイで30分で完了します。
この手順を試みるときは、ハエのバイアルの状態に注意を払い、幼虫が乾燥している場合は使用しないことが重要です。この技術により、ショウジョウバエの幼虫が快適な範囲で好みの温度を選択するために必要な新しい遺伝子の発見が容易になります。
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本記事では、連続温度勾配を用いてショウジョウバエ幼虫の好適環境温度を決定するためのプロトコルを提示します。本研究では、体性感覚の観点から、Drosophila melanogasterが理想的な温度を選択するメカニズムについて調査します。
モデル生物における温度嗜好性のメカニズムを理解することは、体性感覚研究におけるターゲット検証を支援し、TRPチャネルおよびホスホリパーゼC経路のメカニズム的なリスク低減を可能にします。本アッセイは、遺伝的な摂動を定義された行動出力に結びつけることで、初期探索における予測の信頼性を高める、定量的で再現可能な表現型リードアウトを提供します。本手法は、種や発達段階を問わず適応可能であり、神経行動学的ターゲットスクリーニングにおけるトランスレーショナルな連続性を強化します。
このアッセイは、リード化合物の同定前に温度感知ターゲットへのエンゲージメントに関する機能的なリードアウトを提供することで、初期の創薬ワークフローに統合されます。