Name: ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ温度勾配試験によるショウジョウバエ幼虫の好適温度決定法。連続的な温度範囲で集団の温度選択性を評価し、体性感覚メカニズムの理解に貢献します。

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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルの成功を確保するため、幼虫の実験を行うための十分な番号を取得する手順を取ることが重要です。あらかじめ産卵を改善するために 2-3 d 酵母貼り付け含むバイアル中のハエを餌が含まれます。バイアルは水の瓶を含むトレイに置かれ、食品の水分を保持し、通常の光サイクルへの露出を確保しながらの幼虫によって効果的な摂食を促進する透明なプラスチック袋に封入する必要があります。ただし、ハエが引っかかるので、ソフトに酵母ペーストしないでください。バイアルあたりの女性の数は遺伝子型に依存します。W1118、場合通常 12 〜 女性と 〜 6 男性 3 h の卵を産むために十分なです。通常 2 バイアルは単一方向の試金のため十分な幼虫 (幼虫 100-200) 皿の上に配置するを提供します。フライのストックが野生型よりも少なく卵を産むか、孵化幼虫の割合が減少 (30-35/バイアル) まで追加女性と男性を追加します。
これらのアッセイを実行するとき、予期せぬ変動の多くの原因があります。発達段階、幼虫の温度選好に影響を与えます。したがって、定義された段階...

モバイル動物によって温度走性を採用して、最も有利な条件1,2,3環境を選択します。過度に熱いまたは冷たい気候になった場合、この動作は生存に不可欠です。さらに、多くの動物は快適な範囲の温度の非常に小さい相違に敏感であるし、理想的な温度環境を模索します。これは、環境と自分の体の温度を平衡ショウジョウバエなど poikilothermic 生物にとって特に重要なのです。幼虫の温度走性を監視するための試金は識別し、ショウジョウバエ一過性受容体電位 (TRP) チャネル4,5,6など分子センサーの役割を明確に尽力しています。ロドプシン7、8、およびイオン型受容体受容体 (IRs)9、異なった温度較差上の温度感度を持つこれらの動物のため。
双方向の選択のテストは、幼虫6,7熱の好みを勉強する 1 つの方法を提供します。アッセイは、2 つの異なる温度ゾーンを確立することを伴なうし、動物他の上の 1 つの側面を選択することができます。双方向選択テストの結果は、堅牢な 2 つのオプションの間の温度差が大きい場合に特にすることができます。さらに、各分析には集計のみ 2 つのグループが含まれているので、データはシンプルな設定インデックスとして表現できます。使いやすさと双方向選択の試金のシンプルさは、遺伝子スクリーニングに適しています。しかし、主要な制限は、多くの実験動物の野生型や突然変異体の最寄りの温度を確立する必要は。
グラデーションのアッセイでは、単一のアッセイ8最寄りの温度を確立する機会を提供しています。さらに、双方向の選択テストとは異なり温度の連続的な範囲に直面したとき、動物の集団の分布の評価が可能です。1 つのグラデーション アッセイ ペトリ皿と単一動物を使用し、個々 の動物10の詳細な動作評価に適しています。ただし、ペトリ皿はラウンドなので温度ゾーンのサイズによって異なります、中心からの距離に応じて徐々 に小さい。したがって、このセットアップは、動物の集団の温度の選択のモニタリングに最適ではありません。
幼虫のグループの温度の設定を評価するために適しています連続熱勾配装置は、長方形のアリーナを採用し、ここに記載されています。装置は簡単に構築し、組み立てます。また、グラデーションは線形で、42 ° C まで 10 ° C から広い温度範囲で温度走性を評価するために使用することができますは、柔軟です、試金は迅速かつ簡単に実行を再現性のあるデータが得られます。幼虫の支持された温度のレポート作成に加えて、それは単一の実験で線形範囲全体に対する動物の人口の好みを明らかにします。これらの利点のための温度走性に関与する遺伝子を特定するための優れた選択肢です。

<table><tbody><tr><td>グラジエントアッセイ装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, 冷蔵・加熱 6L 循環バス</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>このモデルは販売を終了しています。更新された交換モデルには、120 V、60 Hz用の1186R00および1197U04、または240 V、50Hz用の1184L08および1197U04が含まれます。</td></tr><tr><td>アルミニウムアッセイプレート(単一方向グラジエント用)</td><td></td><td></td><td>外寸:14 x 10.1 x 0.9 cm、内寸:12.9 x 8.7 x 0.8 cm、黒色アルマイト。</td></tr><tr><td>アルミプレート(双方向グラデーション用)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0.2 cm、ブラックアルマイト。</td></tr><tr><td>アルミブロック</td><td></td><td></td><td>の外形寸法:25.5 x 5 x 1.4 cm、内部チャネルのパラメータを図1Dに示します。</td></tr><tr><td>アルミブロックとチューブ用コネクタ</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon サニタリーシリコンチューブ</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</strong</td><td><>strong>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Itemsアッセイ用試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>1.5 mL 微量遠心チューブ用乳棒</td></tr><tr><td>温度計</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>熱電対</td><td></td><td>Fluke K タイプ</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルマイクロプレート蓋</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ディッシュ</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>ラベリングテープ(双方向グラジエント用)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-951</td><td>フィッシャーブランドラベリングテープ 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>インビトゲン</td><td>16500500</td><td>1%溶液を調製</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S0389-5KG</td><td>アッセイ開始直前に18%溶液を調製</td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>デンビル</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>スクープラ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 丸型広口ボトル</td><td>パイレックス</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (300 mm 細孔)</td> <td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>幼虫洗浄用オプション</td></tr><tr><td>段ボール箱 (バイアルトレイ)</td> <td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td>22,400 mL</td></tr><tr><td>コーンミール、イエロー(極細メッシュ、植毛) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>ブリューワーズ酵母 100 ポンド</td><td>MP バイオメディカル</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg;大豆粉 (10 kg/unit)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila 寒天、Type II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo light corn syrup</td><td>Karo</td><td></td><td>1,700 mL</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoate (200プルーフエタノールに懸濁</td>)<td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>リン酸&nbsp;ACS試薬、&ge;H2O Sigma</td><td>Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8.5 mL 中 85 wt</td>.</tr></tbody></table> %

ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

ミバエショウジョウバエを含む多くの動物は、肥えた最寄り熱風景を模索することができます環境温度のわずかな違いが可能です。幼虫の温度の設定を定義すると、定義された線形範囲にわたって、温度勾配を使用してアッセイを開発しました。単一方向のグラデーションを確立するには、2 つのアルミ ブロックは個々 のブロックの温度を制御する独立した水のお風呂に接続されます。2 つのブロックは、グラデーションの上下限値を設定します。温度勾配は、プレート間の距離にまたがる 2 水制御ブロックをアガロース コーティング アルミ プレートを配置することによって確立されます。水ブロックの上に設定されているアルミ板の両端の最小値と最大温度を定義および中間の地域 2 つのブロックを形成する線形温度勾配。グラデーションのアッセイの幼虫に適用できるし、TRP チャネルと温度差別に必要なオプシン遺伝子に影響を与える突然変異などの表現型を示す変異体を識別するために使用することができます。

18 ° C から 28 ° C の単一方向を確立するには、グラデーション、2 つの水のお風呂の温度を 16.8 ° C と設定 31 ° C我々 はすべての 6 ゾーン、ゾーン間の境界線の上部と下部の部分内の 26 の位置に agarose のゲルの表面 (図 2, 2 e) の極端な両端の温度を測定することによって 13 点の温度を取得します。グラデーションの温度分布はほぼ線形 (Y = 0.9672 * X + 16.19、R2 = 0.9961) (図 2 e)。
我々 は様々 な年齢での制御 (w1118) の幼虫の温度の設定を試金。1st (24 ± 1.5 h AEL)、2nd (4...

ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

この方法は、体性感覚、ショウジョウバエ・メラノガスターなどの動物が好ましい環境温度を選択するメカニズムの分野における重要な問題に対処するために使用できます。この手法の主な利点は、連続的な温度範囲に直面したときに、1回のアッセイで幼虫のグループの好ましい温度を確立できることです。ショウジョウバエの幼虫の温度嗜好に関する洞察を提供するだけでなく、インプレスプレートは、ワーム、Cエレガンスなどの他のモデル生物との使用にも適合させることができます。まず、クロス用のバイアルを準備するためのイーストペーストを作ります。酵母顆粒を蒸留水で混合し、乳棒でペースト状に挽く。次に、食品の表面のすぐ上にある標準的なショウジョウバエバイアルの内壁近くにイーストペーストを軽くたたきます。幼虫を産むには、12〜35匹のメスと最大半分のオスを集めますが、オスは10匹以下にします。これらのグループを酵母ペースト含有バイアルに組み合わせます。準備したバイアルを100バイアルトレイに入れます。湿度を確保するために、トレイに水を入れた20本の開いたバイアルを含めます。次に、トレイを透明なビニール袋に密封し、摂氏25度で48時間インキュベートします。48時間の給餌と交尾の後、ハエを新しいフードバイアルに移して卵を集めます。それらをタップします。二酸化炭素は使用しないでください。次に、ハエが摂氏25度で3時間卵を産むのを待ちます。後で、成虫を取り出し、卵の入ったバイアルを水バイアルと一緒にトレイに戻し、バッグを閉じます。次に、卵を摂氏25度で目的の幼虫期まで成長させます。一方向グラジエントを調製するには、まずアッセイ用のヒト周囲環境を作成します。濡れたペーパータオルの上に、別々のウォーターバスに接続された2つのアルミニウムブロックを10センチ離して置きます。ウォーターバスは事前に温める必要があります。次に、100ミリリットルの1%アガロースを作成し、水平な表面の各アッセイプレートに25ミリリットルを追加します。アガロースが固まったら、メラミンスポンジで表面をやさしくこすり、表面を少し粗くします。次に、効率的な温度移動を促進するために、アッセイプレートのアルミニウムブロック間の隙間をスプレーボトルから供給される水で埋めます。次に、アッセイプレートをアルミニウムブロックに置き、境界がどちらかの端から2センチメートル離れて、アルミニウムブロックの端と正確に一致することを確認します。次に、ゲルが乾かないように、プレートの表面に水の膜をスプレーします。次に、システムを段ボール箱で覆って蒸発を減らし、ゲル表面の温度を安定させます。温度が平衡化するまで5〜10分待ちます。次に、プレートの表面温度を少なくとも12か所で確認して、全体的に温度が均一であることを確認し、摂氏2度前後します。その後、アッセイが実行されるまでボックスカバーを元に戻します。きれいな幼虫を分離するには、まず50ミリリットルの試験管に約40ミリリットルの18%ショ糖溶液を追加します。次に、スクーピュラを使用して、食物の山から幼虫を溶液に移します。次に、スクーピュラを使用して、幼虫を溶液で完全に混ぜます。次に、幼虫がチューブの最上層に浮かぶまで30〜60秒待ちます。次に、幼虫の入った溶液を別の50ミリリットルのチューブに注ぎ、新鮮な18%スクロースを注ぎます。再び、幼虫が浮かぶのを待ちます。食べ物の存在は結果に影響を与える可能性があります。したがって、再現性のある結果を得るためには、幼虫を徹底的に洗浄し、食品による汚染を最小限に抑えることが重要です。幼虫への損傷を避けるために、優しく行ってください。次に、50ミリリットルのチューブの上に300ミクロンのセルストレーナーを置き、ショ糖溶液の表面から死んだ成体や浮遊する破片を取り除きます。次に、幼虫をストレーナーに注ぎ、メッシュスクリーンに収集します。次に、約50ミリリットルの水をストレーナーに2回流して、幼虫をさらに洗浄します。次に、空の35ミリメートル皿に、水を使用してストレーナーからほとんどの幼虫を洗い流します。ペイントブラシを使用して、メッシュ上の残りの幼虫を転写します。次に、マイクロピペットを使用して皿からほとんどの水を吸い上げます。次に、幼虫が逃げられないように、皿の蓋を逆さまに置きます。次に、アッセイを開始する前に、幼虫を10〜20分間回復させます。まず、ジェルの上に段ボール箱を取り出し、すぐにゲルの表面温度を確認します。表面が乾燥している場合は、表面に少量の水をスプレーします。ゲルが良好な場合は、小さな絵筆を使用して、各プレートの中央に100〜200匹の幼虫をロードします。次に、各アッセイプレートに蓋をして幼虫を捕獲し、光への曝露を防ぐためにセットアップを段ボール箱で覆います。現在、アッセイが進行中です。10〜30分後、段ボール箱とマイクロプレートの蓋を外します。次に、プレートを上から撮影して、幼虫の位置を記録します。ジェルの表面での反射を避けるために、ボックスをカメラの上に置きます。プレートをクリーンアップするには、散らばった可能性のある場所にすべての幼虫を吸引します。次に、画像解析ソフトウェアを使用して、各ゾーンの幼虫の分布の割合を計算します。アッセイプレートの境界に基づいて2センチメートルごとに線を描き、各ゾーンの幼虫の数を数えます。カウントするときは、ゲルの厚さと温度条件がエッジの近くで均一ではないため、各エッジから0.5センチメートルの隆起に分布する幼虫は無視してください。摂氏18度から摂氏28度では、摂氏16.8度と摂氏31度に設定されたウォーターバスを使用して、一方向の勾配が作られました。勾配に沿った温度分布はほぼ線形であることがわかりました。対照幼虫は、さまざまな年齢でアッセイされました。1番目、2番目、および3番目の初期の初期に、幼虫は摂氏24度ゾーンでピークの好みを示しました。3番目のインスターの中頃、ほとんどの幼虫は摂氏18度のゾーンに蓄積しました。さまようことのない後期3齢の幼虫は、摂氏18度のゾーンに密集していました。対照系統の摂氏18度ゾーンに蓄積する傾向は、White 1118であり、エッジ効果によるものではなく、後期の3齢幼虫は依然として摂氏18度ゾーンに蓄積しており、双方向の勾配を使用していました。温度の識別に必要な3齢後期から3齢幼虫の変異を解析したところ、結果が変わりました。trpA1にヌル変異を持つ幼虫は、摂氏18度から摂氏28度の勾配全体に均等に分布しています。また、AアイソフォームとBアイソフォームのみ、またはtrpA1のCアイソフォームとDアイソフォームが欠損した幼虫も重篤な障害を示した。ホスホリパーゼcベータをコードする2つの遺伝子の1つであるnorpAに変異を持つ幼虫も破壊されました。しかし、他のホスホリパーゼcβ、plc21cをコードする遺伝子に変異を持つ幼虫は、正常に振る舞った。このビデオを見れば、連続的な温度勾配を使用して再現性のある結果を得る方法について明確に理解できるはずです。これにより、野生型と突然変異型のショウジョウバエの幼虫の温度選好を比較できるようになります。この手法を習得すれば、1回のアッセイで30分で完了します。この手順を試みるときは、ハエのバイアルの状態に注意を払い、幼虫が乾燥している場合は使用しないことが重要です。この技術により、ショウジョウバエの幼虫が快適な範囲で好みの温度を選択するために必要な新しい遺伝子の発見が容易になります。

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