Name: その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶスペクトル反射型顕微鏡（SpeRe）によるマウス脳組織の有髄軸索ナノ構造解析。ラベルフリーで軸索径を定量化し、脱髄鞘や髄鞘可塑性の研究に応用可能。蛍光法と良好な一致を示す。

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この作品は、によって、研究所の基礎科学 (IBS R015 D1)、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省 (2017R1A6A1A03015642) によって資金を供給にサポートされていました。

すべての手術は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 成均館大学によって承認されました。
1. サンプル準備
注: オートクレーブ動物処理前にすべての手術器械。手術専用ルームですべての手術のパフォーマンスを実施します。滅菌ガウンと手袋は、すべての回で手術室のすべてのスタッフが着用する必要があります。
<ol><li>
ティッシュの固定
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4% パラホルムアルデヒド (PFA) PBS で満ちている各 10 mL 注射器 2 本を準備します。</li>
		<li>7 12 週齢のマウス, (c57bl/6 j またはどちらかの性別を任意のマウス線) zoletil とキシラジン (1:1、20 mg/kg) または、代替の適切な麻酔体制 (例えば、ケタミン 80 mg/kg および 10 mg/kg の混合物の混合物を投与することで麻酔します。キシラジン) 腹腔内注入。</li>
		<li>マウスは手術麻酔 (つま先ピンチ応答メソッドを使用して) 面に達したら、はさみで皮膚と胸郭を切り落とすことにより心を公開します。</li>
		<li>血液を抜くし、針で左心室を順次 PBS と PFA ソリューションを灌流する小さいハサミで右房を切り取る (灌流率 = 4 mL/分、ボリューム 10 mL の各ソリューションのための =)。 注: マウスは、手順が正常に完了した場合は堅くなります。眼軟膏や消毒の使用はプロシージャがターミナルは必要ではありません。固定プロシージャをスキップことがあります。ただし、機械的組織の損傷や虚血性軸索腫大を含む構造の変形を最小限に抑えるには、この手順の使用をお勧めします。ティッシュの固定については、ゲージ、G. J.らによる記事を参照してください。10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脳スライスの準備
	<ol>
<li>腹胸部と腹部を手術用はさみでマウスの首をはねます。</li>
		<li>頭皮と頭蓋骨を完全に公開するまで適当に小さなはさみを使用して骨膜を削除します。</li>
		<li>前頭骨を打破し、脳に損傷を与えないように注意して小さなはさみを使用して後頭骨の矢状縫合に沿って頭蓋骨を切断します。</li>
		<li>頭蓋と順次微細鉗子を用いた硬膜を慎重に取り外します。</li>
		<li>組織を損傷しないように注意を取って、柔らかいプラスチック スプーンを使用して脳を抽出します。</li>
		<li>リンス、4 ° C で 30 分間 4 %pfa 溶液で抽出した脳を浸す</li>
		<li>Vibratome を使用して 100-150 μ m のセクションに固定脳をスライスします。 注: ティッシュの準備の詳細についてを参照してください記事 Segevらによって11します。 以降の手順では、組織する必要がありますスライスされるセクションにスペーサーの厚さより薄く。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脳スライスの取り付け
	<ol>
<li>組織スライスごとにスライド 1 ガラスと 2 正方形カバー メガネ (22 × 22 × 0.17 mm) を準備します。</li>
		<li>半分にカット正方形カバー メガネの 1 つ (2 つの長方形の部分) ガラス カッターを使用しています。</li>
		<li>スライド グラス上でスーパー接着剤を使用して半分のカバー メガネの 2 つを接続します。 注: 2 つの半分ガラスの間のスペースは組織スライスのサイズより少し大きいはずです。</li>
		<li>ブラシやピペットを使用して脳スライスを収穫し、スペーサーの間には、スライド ガラス上の組織を置きます。組織を折るように注意してください。</li>
		<li>組織表面上の PBS 100 μ L を分注します。</li>
		<li>ティッシュの上に、正方形カバー ガラスを配置します。この段階で気泡を含めることを避けてください。</li>
		<li>後続のイメージング セッション中にほこりが PBS の蒸発や汚染を防ぐために爪のポーランド語 (または代わりに適切な接着剤) を使用カバー ガラス周りにシールします。 注: この段階で実験者が一時停止します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 校正
<ol><li>顕微鏡、少なくとも 1 h に切り替える前にレーザーの熱安定化できるようにイメージング ソース (材料の表を参照してください)。次に、スペクトル スキャン (材料の表を参照してください) のソフトウェアを有効にし、GUI (図 3 a).の上部にある [取得] ボタンをクリックしてください
</li>
	<li>白色光レーザー (WLL) および光電子増倍管 (PMT) (図 3 a) ソフトウェア シャッターをオンにします。</li>
	<li>アクイジション ・ モードでドロップダウン リストにxyΛ モードを選択し、定数 %から一定の電源をレーザーの入力モードを自動的に変更します。SP の自動巻きムーブメントのチェック ボックスをオフにします。470-670 nm と 4 スペクトル ステップ サイズを入力レーザのスペクトル ウィンドウを設定し、そしてΛの nm-励起ラムダ スキャンの設定(図 3 b)。</li>
	<li>ダブルクリックするか (図 3 c) のスペクトル範囲の調整バーを動かす 450 690 に光電子増倍管のスペクトル範囲を設定します。 注: このスペクトルの範囲は、入力ソースの完全な帯域幅を含める必要があります。</li>
	<li>高開口数を適切に、水浸対物レンズを選択 (NA > 0.7) とAOBS 構成とライブ スキャンボタンをアクティブに PMT とレーザーの電源を任意の値を与えます。AOBS 構成(図 3 d) の反射をチェックすることによって光路を切り替えます。</li>
	<li>参照ミラーをマウント (材料表参照) 顕微鏡ステージ上。鏡面は、対物レンズに対して直面する必要があります。場合顕微鏡ステージにミラーを置きやすい、フラット プレート (スライド ガラスなど) の上にミラーを接着します。</li>
	<li>ミラー表面に焦点面を揃えるに顕微鏡ステージを制御します。</li>
	<li>光電子増倍管の利得と検出器のダイナミック レンジを考慮したレーザー パワーを調整し、一定の電源を一定パーセントからレーザーの入力モードを変更します。 注: 典型的なよう、PMT ゲイン 500 (V) と 0.1% の相対的なレーザー出力は 570 で使用される nm。</li>
	<li>波長範囲にわたって彩度がないことを確認する擬似カラー モードで確認します。彩度を観察すると、(図 3 a) のレーザー出力を下げます。</li>
	<li>ラムダ スキャン取得を実行します。</li>
	<li>ステージからミラーを削除し、暗い参照 (すなわち、暗いオフセット) を取得するためにサンプルなし同じ取得を繰り返します。</li>
	<li>研究 TIF形式でデータを保存します。</li>
</ol>3. スピア画像集録
<ol><li>顕微鏡ステージ上にマウントされた組織を置いてください。対物レンズの焦点平面に組織をほぼ揃えて配置するには、目の部分を広視野蛍光モードを使用します。</li>
	<li>ライブ スキャンで、組織の関心領域に焦点面を揃えるに顕微鏡ステージを制御します。カバー スリップからのバック グラウンド ノイズを避けるためには、ガラス組織インターフェイスから少なくとも 15 μ m の深さのターゲット地域を選択します。</li>
	<li>手順 2.1-2.10 で同じ手順を使用してターゲット領域のスペクトル画像のスタックを取得します。</li>
	<li>研究 TIF形式で組織と暗いオフセットのデータを保存します。 注: この段階で実験者が一時停止します。</li>
</ol>4. 画像処理と解析
<ol><li>ImageJ で参照ミラーおよび脳組織のスペクトル データ (研究 TIF) を開きます。</li>
	<li>開かれた画像のスタック ・ ロワ (興味の地域) を選択、参照ミラーと脳組織の軸索繊維のセグメントの中心部。</li>
	<li>実行イメージ→スタックで選択した Roi の生のスペクトルを取得 ImageJ メニュー上のz 軸のプロットのプロファイル。</li>
	<li>暗いのオフセット データ参照ミラー、他に行われ、脳の組織のための 1 つを開きます。</li>
	<li>実行中のイメージ→スタック→ 暗いオフセットのスペクトルを取得 ImageJ メニュー上のz 軸のプロットのプロファイル。</li>
	<li>コピーと貼り付けのオプションを使用して取得したすべてのスペクトルを保存します。 注: 領域イメージング用軸外収差を最小限に抑えるために中央のイメージング分野の使用お勧めします。軸索線維は、その長さに沿って構造的に異機種混在可能性があります。したがって、小さい軸索のセグメントに ROI を選択すると、通常 < 5 μ m、部分的なボリューム アーティファクトを最小限に抑えることを推奨します。</li>
</ol>5. 基線補正、スピア信号解析
<ol><li>参照ミラーや脳組織のスペクトルからスペクトルのオフセットを減算します。</li>
	<li>各スペクトルのスペクトルの最大強度で割って正規化します。</li>
	<li>参照ミラーの正規化されたスペクトルによる軸索の正規化されたスペクトルを分割し、正規化されたスペクトルから DC オフセットを減算します。</li>
	<li>正弦波を集録したスペクトルをあてはめによる波の周波数を測定 (材料の表を参照)、曲線し、周期に取って逆数による買収の波数を変換します。</li>
	<li>波数の周期性を図 4 の cの式を使用して軸索直径に変換します。</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的な利益を宣言: J. クォンと M. チェは、この資料に記載されている保留中の特許技術の発明者。

スピアはスペクトル干渉法による、初めてのライブの有髄軸索のナノスケール情報を提供する新しいラベル無料画像モダリティです。現在獲得プロトコルで軸索直径の空間分解能が 10 nm。また、スピア利用; 他の超解像顕微鏡と比較して桁の低光量したがって、光毒性とフォトブリーチを行なったから無料です。スピアは、有髄軸索のナノスケール動態を研究するための新しい道を提供します。
ここ記載されているプロトコルは、視聴覚とポイント検出器 (すなわち、光電子増倍管) を介するスペクトル スキャンに基づいています。このアプローチは、完全なフィールドのビューのスペクトル画像を取得で有利です。しかし、時間分解能は、通常、現在の構成 > 15 s スペクトル スキャンによって制限されます。代わりに、小さな視野の9のリアルタイム観察を可能にする高速分光器を組み込むことができます。このシステムは、分光器により分光し白色光レーザーを追加することによって、PMT を切り替えることによって単に従来の共焦点システムから構築できます。集録ソフトウェア, ガルバ...

哺乳類の神経系のミエリンは enwrapping 多層膜鞘と軸索線維によって急速な神経伝導と軸索の整合性を提供します。多層構造が細胞膜から成るなナノスケール薄膜を交互で構成される (〜 5 nm)、細胞質 (~ 3 nm)、および細胞外スペース (〜 7 nm)1,2。最近超解像顕微鏡などの光学顕微鏡は光の回折3,4、5のための不十分な解像度のためのナノスケール ミエリンの動態を観察するため適していません。電子顕微鏡は、ミエリン ナノ構造の細部を提供できますが、生物系化学固定法と ultrasectioning67,を含む高度侵襲的なサンプルの準備のために互換性がないです。.最近までなかった技術適用有髄軸索原のナノスケール動態を観察します。
Schainらは、有髄軸索がカラフルな光の反射率8を示すことを報告しました。反射光の分光分析を採用し、我々 はスペクトル反射 (領域)9の名前の有髄軸索のナノスケール イメージングのための新しいイメージング法を考案しました。領域は、髄鞘 (図 1) の多層構造で発生する薄膜干渉に基づいています。様々 な軸索の光学シミュレーションによる我々 は反射率スペクトル波数とその周期の周期関数であることを明らかにしている (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) は軸索の直径 (d) に反比例します。この簡単な関係 (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) 領域データから軸索直径の安易な定量化を提供しています。これを利用して、私たちは私たちの前のレポートで軽度外傷性脳損傷の下で膨らんだ流行している軸索を明らかにしました。
スピア システム共焦点顕微鏡に基づいて成っている特殊な光源とフィルター (図 2)。入力ソースがホワイト ライト レーザー, 広帯域スペクトル出力赤外領域に表示を提供することです。2 つの音響光学素子のスペクトル スキャン、システムが搭載されて: 入力広帯域光源と音響光ビームスプリッター (AOBS) から選択した波長を提供して反映選択を導くための音響光学波長可変フィルター (AOTF)検出器波長。ハイパー共焦点の顕微鏡検査のためソフトウェアは、さまざまな入力波長における反射率画像を順次取得するカスタマイズ可能なスペクトル スキャン オプションを提供します (材料の表を参照してください)。さらに、色収差は批判的にスペクトル測定に干渉することがしたがって、アポクロマート対物レンズの使用をお勧めします。
注記のうち、白色光レーザー出力不均一なスペクトルと光学部品もスペクトルのプロファイルに影響を与えます。したがって、得られたスペクトルは後続の定量分析用のキャリブレーションする必要があります。保護されたシルバー ミラーは通常、完全可視領域にほぼ一定の反射 (&gt; 97%) を提供する参照として使用されます。得られたスペクトルは、ミラーからの参照スペクトルで、分かれています。
スペクトル スキャン スペクトル ステップ サイズ決定集録速度;したがって、それを最適化する必要があります。大きい軸索が高いスペクトル期間、細かいスペクトル サンプリングが必要です。例えば、直径 10 μ m、最大の生理学的な軸索の 1 つの軸索はスペクトル期間 〜 8 nm。4 のスペクトル サンプリング間隔を用いてナイキスト サンプリング条件を適用すると、マウス神経系における生理学的神経軸索をカバーする nm。このアプローチは完全スペクトル スキャンに数秒以上かかります、従っていないアプリケーションに適しています生体内で、生理学的運動 (例えば呼吸・心拍) が安定したスペクトル取得を妨害します。私たちは以前配列分析計 (集録速度 ≒ ピクセルあたり 30 ms) を使用して各ポイントの完全なスペクトルを取得するように設計、カスタマイズされた正立顕微鏡をインストルメント化することによってこの問題を解決しました。
このレポートでは、商業ハイパー スペクトル顕微鏡で行うことができる固定脳スライスの領域イメージングに関する詳細なプロトコルについて述べる (材料の表を参照してください)。したがって、プロトコルは、光計測の専門知識のない実験者で完了ことができます。私たちはまた、潜在的な問題および領域データの取得と解析のトラブルシューティングをカバーします。

<table><tbody><tr><td>ガラスカッター</td> <td>-</td><td></td> <td>地元のコンビニエンスストアやオンラインストアで購入できます。</td></tr><tr><td>マニキュア</td> <td>-</td><td>-</td> <td>地元のコンビニエンスストアまたはオンラインストアで購入できます。</td></tr><tr><td>アポクロマート対物レンズ 40&�;, NA 1.1</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>15506357</td><td>水浸型</td></tr><tr><td>フルオロミエリングリーン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F34651</td><td>あるいは、フルオロミエリンレッド (F34652) を使用することもできます。</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS 顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>詳細については、紹介セクションの「顕微鏡の構成」を参照してください。</td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア Leica</td><td>Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>保護された銀でコーティングされています。</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>バイオソリューション</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3306</td><td>厚さ: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>武藤純薬品</td><td>5116-20F</td><td>厚さ: ~1 mm</td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>ヘンケル</td><td>ロックタイト 406</td><td>皮膚や目に入ったらを避けるために、ディスペンシング装置を使用してください。</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000</td> DUAL-Vibratome <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>白色光レーザー</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 は製造中止となり、EXU-6 に置き換えられました。</td></tr></tbody></table>

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

哺乳類の神経系ミエリンは多層スパイラル軸索線維の enwrapping で電気絶縁を提供します。その度に編成されて細胞内建築に触発され、我々 は最近という名前のスペクトル反射 (領域)、原ライブ有髄軸索の前例のないラベル無料ナノスケール イメージングを可能にする新しいイメージング法を開発しました。基本原理は、多層の細胞レベル下の構造の反射スペクトルを分析することによりナノ構造情報を得ることです。この記事で商業共焦点顕微鏡システム、白色光レーザーと波長可変フィルターを用いた神経組織の基本的な領域イメージングを実行するための詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。スペクトル データ、およびナノ構造の情報を得るための画像処理による試料作製の手順を紹介します。

外因性の染色、ミエリンを対象とした蛍光を持つ準備された固定脳スライス プロトコルに従って (材料の表を参照してください)。と共に使用して商業ハイパー共焦点顕微鏡共焦点蛍光イメージング (図 4 a) 脳スライスの領域イメージングを行った。スピア、入力光強度が 5 μ/μ m2 〜 1 μ s の画素のドウェル時間を設定しました。この光の線量は、大きさの順で、従来の蛍光共焦点顕微鏡12より低い。~ 17 かかる上スペクトル スキャンの s 4 の間隔で 470 670 nm nm (51 画像)。
光の反射の幾何学によって期待どおりに、有髄軸索の中心に沿ってスピア信号はローカライズされました。軸索のセグメントの反射スペクトルから軸索の直径 (図 4 b...

イメージング分光反射率に基づくラベル無料ナノを使用して固定脳スライスの髄軸索をイメージングのためのステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

この技術は、ミエリンの可塑性や脱髄など、ミエリン分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複雑な標識やサンプル調製なしで、無傷の脳組織における有髄軸索のナノ構造を研究できることです。ここでは、脳のスライスでのアプリケーションを示しますが、この手法は生きている動物に拡張できます。テキストプロトコルに従ってマウス脳組織を固定しスライスした後、各組織スライスごとにスライドガラス1個とカバーグラス2個を準備します。ガラスカッターを使用して、正方形のカバーグラスの1つを半分に切ります。次に、瞬間接着剤を使用してスペーサーを作成し、2つのピースをスライドガラスに取り付けます。ブラシまたはピペットを使用して、脳のスライスを採取し、組織を折りたたむように注意しながら、スペーサーの間のスライドガラスに組織を置きます。組織表面に100マイクロリットルのPBSを分注します。次に、気泡が入らないように、2番目の正方形のカバーガラスをティッシュの上部に置きます。マニキュアを使用してカバーガラスの周囲を密閉し、その後のイメージングセッション中にPBSが蒸発したり、ほこりによる汚染が発生したりするのを防ぎます。イメージングの少なくとも1時間前に、レーザー光源の熱安定化を可能にするために顕微鏡のスイッチを入れます。次に、スペクトルスキャン用のソフトウェアをオンにし、GUIの上部にある取得ボタンをクリックします。白色光レーザーと光電子増倍管のソフトウェアシャッターをONにします。[取得モード] で、ドロップダウン リストから XY ラムダ モードを選択します。その後、レーザー入力モードは、一定のパーセントから一定の出力に自動的に変更されます。ラムダ励起、ラムダスキャン設定で、自動SP移動ボックスのチェックを外し、入力レーザーのスペクトルウィンドウを470〜670ナノメートルに、スペクトルステップサイズを4ナノメートルに設定します。PMTのスペクトル範囲を450〜690ナノメートルに設定するには、スペクトル範囲の調整バーをダブルクリックまたは移動します。水浸対物レンズは、開口数の多いものに適しています。PMTとレーザーパワーに任意の値を与えて、AOBS構成とライブスキャンボタンをアクティブにします。AOBS設定では、反射を確認して光路に切り替えます。次に、顕微鏡のステージにリファレンスミラーを取り付け、表面を対物レンズに向けて取り付けます。顕微鏡のステージにミラーを置くのが難しい場合は、平板にミラーを接着します。顕微鏡のステージを調整して、焦点面を鏡の表面に合わせます。次に、検出器のダイナミックレンジを考慮して、PMTゲインとレーザー出力を調整します。疑似カラーでは、波長範囲全体に彩度がないことを確認します。飽和が観察された場合は、レーザー出力を下げてください。次に、ラムダスキャン集録を実行します。ミラーをステージから取り外し、サンプルなしで同じ取得を繰り返して、暗い参照を取得します。次に、データをマルチスタックTIF形式で保存します。SpeRe画像取得を行うには、マウントされた組織を顕微鏡のステージに置きます。組織を対物レンズの焦点面に大まかに位置合わせするには、接眼レンズを通して広視野蛍光モードを使用します。ライブスキャンをオンにした状態で、顕微鏡のステージを制御して、焦点面を組織の関心領域に合わせます。カバーガラスからのバックグラウンドノイズを避けるために、ガラス組織界面から少なくとも15マイクロメートルの深さのターゲット領域を選択します。このビデオで前述したのと同じ手順を使用して、ターゲット領域のスペクトル画像スタックを取り込みます。次に、ティッシュのデータとダークオフセットをマルチスタックTIF形式で保存します。ImageJ で画像を処理するには、参照鏡と脳組織のスペクトル データを開きます。開いた画像スタックのROI、参照ミラーの中央領域、および脳組織の軸索線維のセグメントを選択します。次に、画像を実行し、Z軸プロファイルを積み重ね、プロットして、選択したROIの生のスペクトルを取得します。軸索線維は、その長さに沿って構造的に不均一である可能性があるため、部分的な体積アーチファクトを最小限に抑えるために、通常は5マイクロメートル未満の小さな軸索セグメントでROIを選択することをお勧めします。参照ミラー用に取得されたデータと脳組織用に取得されたもう 1 つのダーク オフセット データを開き、示したように Z 軸プロファイルをプロットします。次に、コピーと貼り付けのオプションを使用して、取得したすべてのオプションを保存します。ベースライン補正とSpeRe信号解析を行うには、リファレンスミラーと脳組織のスペクトルからオフセットスペクトルを差し引きます。スペクトルの最大強度を除算して、各スペクトルを正規化します。実験で使用した波長の逆数を取って波数を入力し、参照ミラーのスペクトルを除算して軸索のスペクトルを正規化し、正規化したスペクトルからDCオフセットを差し引きます。次に、取得したスペクトルを正弦波に当てはめることにより、波数周波数を取得します。取得した波数周波数を周期性に変換して逆数を取り、ここに示す式を使用して波数の周期性を軸索径に変換します。この実験では、固定された脳切片をミエリンに対して蛍光染色し、従来の蛍光共焦点顕微鏡よりも一桁低い光量でSpeReイメージングを行いました。SpeRe信号は、光学反射の形状によって予想されたように、有髄軸索の中心に沿って局在していました。軸索セグメントの反射スペクトルから、波数の周期性が得られ、その後、軸索直径に変換されました。このグラフは、ここでボックス化された領域からの蛍光強度の横方向プロファイルを示しており、SpeReで測定された直径は蛍光ベースの測定とよく一致していることがわかりました。SpeReイメージングは、光反射に基づいています。したがって、シリカベースのカバースリップは、重大なバックグラウンドノイズを引き起こす可能性があります。光学系のセットアップでは、カバーガラスからのイメージング深度が5マイクロメートル未満の場合はバックグラウンドノイズがかなり発生しましたが、イメージング深度が15マイクロメートルを超える場合は回避されました。キャリブレーションステップはすべての実験に必須ではありませんが、少なくとも週に一度は行うことをお勧めします。キャリブレーションが完了すると、イメージング手順は、各視野で通常20秒以内に完了できます。この手順を試行する際には、フルスペクトルスキャンの検出器の動的レイテンシを考慮することを忘れないでください。このビデオを見れば、反射画像を使用して有髄軸索からナノ構造を取得する方法について十分に理解できるはずです。

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サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。...

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出典:Kwon, J., et al., 有髄軸索のスペクトル反射率顕微鏡法 In Situ. J. Vis. Exp. (2018)...

スペクトル反射率測定法を使用して、固定マウス脳スライスの有髄軸索直径を決定する

出典: McCullagh, E. A., et al.脳スライスにおける髄鞘形成のイメージングのためのコヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)の応用J. Vis. 経験。 (2022年)このビデオでは、げっ歯類の脳組織のニューロン構造を視覚化するための蛍光およびコヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)イメージングを示しています。Nissl 染色はリボソーム RNA に結合して細胞体を標識しますが、CARS...

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四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

私たちは、軸索とミエリンの損傷のダイナミクスをリアルタイムで同時に視覚化するために、2光子励起タイムラプス顕微鏡を利用したプロトコルを提示します。この提案されたプロトコルは、中枢性有髄軸索に影響を与える可能性のある内因性および外因性の両方の要因の研究を可能にします...

アンエクスビボレーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション...

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM)...

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

マウス小脳・髄鞘形成と中枢神経系検査のメカニズムを調査するため適切な免疫組織化学的染色ミエリン鞘からスライス培養切片を準備する方法をご紹介します。...

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。...

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

髄鞘形成を視覚化することは、神経系を研究する多くの研究者にとって重要な目標です。CARSは、ミエリンなどの特殊な構造を照らす脳などの組織内の脂質をネイティブにイメージングできる免疫蛍光法に対応した技術です。...

コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)による脳スライスの髄鞘形成イメージングへの応用

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の動物モデルとして機能します。この記事では、EAEにおける脊髄の炎症、脱髄、および軸索損傷をスコアリングするためのアプローチについて説明します。さらに、マウス血清中の可溶性ニューロフィラメント光レベルを定量化する方法が提示され、生きたマウスの軸索損傷の評価が容易になります。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

学ぶスペクトル反射型顕微鏡（SpeRe）によるマウス脳組織の有髄軸索ナノ構造解析。ラベルフリーで軸索径を定量化し、脱髄鞘や髄鞘可塑性の研究に応用可能。蛍光法と良好な一致を示す。

その場で有髄軸索のスペクトル反射型顕微鏡

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