Name: タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶタンパク質複合体のネイティブ質量分析による構造解析。HerA-NurA複合体のオリゴマー状態、リガンド結合、衝突誘起解離を用いた安定性評価法を解説。生体分子の動的挙動と相互作用ネットワーク構築への応用を示す。

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ご提供するヘラ、ヘラぬ蛋白質のサンプルと実験的なデザインのカール ・ ピーター ・ Hopfner とロバート ・ トーマス ・ バーンに感謝したいと思います。我々 はまた原稿の彼の評価を博士エイモン読書をありがちましょう。感謝する私たちの資金団体: Wellcome の信頼 [109854/Z/15/Z] と高貴な社会 [兼に RG150216]。

利害の対立が宣言されていません。

MS は、化学量論、相互作用および蛋白質の複合体のサブユニット構造を特徴付けることますます重要な役割を果たしています。IM MS データは多成分複合体中のサブユニットのトポロジカルな取り決めを定義する使用できます。MS 他の既存の構造生物学の手法と比較して、いくつかの利点があります。ネイティブの MS は迅速かつ機密性の高い技術を異種蛋白質のサンプルをプローブに使用することができます。ソリューションの破壊の結果と相まって、タンパク質複合体の解離経路を監視できます。一緒に結晶構造やホモロジー モデル、構造の MS によって提供される情報はタンパク質-リガンド相互作用を調査するためのツール、ネイティブに近いモデルとアセンブリ経路11を提供します。
ここでは、我々 は統合 MS を使用して化学量論、1 つまたは複数のリガンドとタンパク質-リガンド相互作用の組成を分析するために必要な実験手順を説明します。これは、MS サンプル準備、データ集録、データの解析、および計算ツールを使用して MS データの統合が含まれています。これを行うには、私たちのモデル システムとして 3 配位子 (DNA、ATP、ADP) にバインドされている DNA 切除ヘラぬヘテロ オリゴマー蛋白質の複合体を使用しました。プロトコルは、データ分析とプレゼンテーションを支援する現在利用可能なソフトウェアの使用を示します。
リガンド結合解析の重要な質の高いスペクトルを取得は、したがって、慎重なサンプル準備のステップは重要、蛋白質の浄化、リガンドの滴定、バッファーの交換などです。1 つの制限 nESI のリガンドを勉強するときにネイティブの MS は非固有のバインド。エレクトロ スプレー プロセス全体にわたって液滴溶媒中に非特異的結合が発生します。これは配位子濃度が増加し、したがってタンパク質・ リガンド比29を変更します。ヌクレオチドの結合結果 apo とイオン化効率50,51を変更しないヌクレオチド結合タンパク質の質量差が比較的小さい。
私たちの仕事の有機 G2 Si MS システムを使いましたが、プロトコルは、他の市販のナノ-エレクトロ スプレー質量分析計を使用して他のタンパク質-リガンド複合体の異なった調査の適用。統合構造 MS がますますより複雑な生物学的問題に対処する上で重要な役割を果たしてください。ワークフローとここで説明する手法は構造の結果を理解し、従来の構造的手法を用いて研究することは困難ではないタンパク質複合体のタンパク質-リガンド形成メカニズムの構築に適しています.

ネイティブ質量分析法によるタンパク質およびその複合体を用いて非共有結合性相互作用とタンパク質の折り畳みを維持ナノ-エレクトロ スプレー イオン化 (nESI)、エレクトロ スプレー イオン化プロセス1、中に 2。ネイティブの MS でタンパク質およびその複合体の構造は、気相3,4でネイティブに近い状態に保持されます。ネイティブの MS 検出比率 (m/z) タンパク質やタンパク質-リガンドの固まりのことを充電するためにそれらの質量によると区切られている複数の荷電タンパク質イオンを計算する複雑な。この情報はそのまま蛋白質の相互作用ネットワーク3,4,5,6ligand の結合の化学量論、サブユニット組成の定量できます。ネイティブの MS が他の手法に比べていくつかの利点そのような x 線結晶構造解析と核磁気共鳴分光法5。まず、ネイティブの MS は迅速かつ高感度技術だけいくつかマイクロリットル (2-3 μ L) を必要とする低 μ M 範囲6高 nM の比較的低い最終的な複雑な濃度でのサンプルの。第二に、ネイティブの MS が可能複数の蛋白質とオリゴマーの状態を同時に解析する異種蛋白質のサンプルを調査する使用できます。第三に、ネイティブの MS では、解析の前に化学的架橋またはタンパク質ラベリングによって変更される蛋白質のサンプルは必要ありません。これらの利点は蛋白質複合体の構造の調査のための強力なツールに構造の MS にしました。
ネイティブの MS は、衝突の断面決定する (CCS) を有効にするイオンの移動度 (IM) タンパク質のイオンが電界を通過する時間を測定する手法と組み合わせることができます。CCS は、トポロジと得られるタンパク質の構造の不均一性について低解像度の構造情報を提供します。さらに、計算のアプローチによって生成されたタンパク質構造モデルの検討をことができます。
IM-質量分析法による衝突誘起展開 (CIU) 測定を使用して、タンパク質相安定性を調べることが。CIU の過程でタンパク質のイオンの加速し、質量分析計7,8,9内不活性バッファー ガス増加加速衝突を介して活性化します。この衝突活性プロセス CCS の増加に変換する部分的に展開するタンパク質を原因します。CCS とタンパク質を展開するために必要なエネルギーの変更をすることができますイムさんを使用してこのアプローチを測定、リガンド結合タンパク質安定性に及ぼす測定10をすることができます。Subcomplexes は、タンパク質複合体のネイティブのようなトポロジを監視する有機溶剤添加などのソリューションの中断方法を使用してソリューションに生成できます。タンパク質複合体の中断は、内の非共有結合性相互作用の混乱のために主にです。サブの複合体は、ネイティブのようなトポロジを維持し、MS 検出時間サブユニット接続に関する情報を明らかにします。
構造生物学の統合的なアプローチは、構造とタンパク質およびその複合体3,4,5,6のダイナミクスを研究する多様な方法を組み合わせます。ネイティブの MS と IM MS は、挑戦的な生物系の分子の詳細を明らかにするために使用されています。蛋白質アセンブリ経路11,12,13,14、蛋白質蛋白質の相互作用ネットワークの15の勉強の調査を含むアプリケーションのいくつかの例があった,16,17、膜蛋白質6,18,19,20,21、および核酸22,23 などタンパク質-リガンド相互作用 ,24。
ただし、ネイティブの MS にも制限があります。ネイティブの MS 測定はしばしば、いくつかのタンパク質が、折り畳まれたネイティブ状態3,25を保たないアンモニア酢酸などの揮発性のバッファーで実行されます。それにもかかわらず、最近の作品はタンパク質とタンパク質の複雑なイオンを高イオン強度により非揮発性のバッファーから直接形成できるように針の先端の直径 (0.5 mm ヒント) をスプレーの最適化によるこのような制限を克服できることを示しています。26生理的環境を模倣します。さらに、ネイティブの MS を使ってエレクトロ スプレー イオン化し、非共有アセンブリをソリューションからガス相; に転送したがって、検出された複合体の相対的な豊かさ表さない場合があります完全にソリューション5,27に。さらに、ソリューションに比較、ガス相の疎水性相互作用が弱くなると静電相互作用が強くなるし、それゆえ3,28を支持します。
この記事でタンパク質の同定とリガンド結合ネイティブの MS、IM MS、CIU、ソリューションの混乱を使用して、モデリングのためのプロトコル、データ分析と解釈をいたします。DNA 修理複雑、HerA ぬは、モデル システムとして使用されます。DNA 二本鎖切断 (Dsb) は遺伝的不安定性と人間の癌の最終的な開発の結果、DNA の損傷の最も細胞毒性と有害な形態の 1 つです。相同組換えは、ATP 依存ヘリカーゼ ヌクレアーゼ複雑、HerA ぬ22によって管弦楽に編曲されるプロセスの偏向を根絶する修復機構。
ネイティブの MS と IM MS を組み合わせて機能アッセイとモデリング許可の調査: i) でアセンブリ、構造および安定性複合体、ii) dsDNA と複合体間の相互作用とその全体的な影響ぬの役割複合体の安定性および iii) 化学量論とアセンブリ22ATP 結合の影響。全体的にみて、この作品は、ヌクレオチド結合タンパク質の複雑な構造変化と安定性でリンクしてヘラぬ複合体の分子基盤の理解の改善につながった。このプロトコルは、1 つまたはいくつかの ligand(s) 型と相互作用する任意のタンパク質 complex(es) のジェネリックです。

<table><tbody><tr><td>アデノシン5&プライム;-(3-チオトリホスフェート)テトラリチウム塩</td><td>メルクミリポア</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン5&プライム;-二リン酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>マイクロバイオスピンクロマトグラフィーカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 濃縮器</td><td>ザルトリウス</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸毛細血管</td>ハーバー<td>ド装置</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

タンパク質は、遺伝子発現、代謝反応、DNA 修復や複製を触媒を含む細胞機能の多くの重要な役割を果たす生体高分子の重要なクラスです。これらのプロセスの詳細な理解がについての重要な情報を説明します。 したがって、細胞機能。統合構造 MS メソッドは、蛋白質複雑なアセンブリ、複雑な接続、サブユニット組成比、多量とリガンドの構造と力学的情報を提供しています。統合構造 MS の最近の進歩は、大規模な DNA 結合タンパク質、膜タンパク質を含む挑戦的な生物学的システムの特性評価のため許可されています。このプロトコルでは、ヘリカーゼ ヌクレアーゼ DNA への洞察を得るためにネイティブの MS とイオン移動度質量分析法 (IM MS) 分子動力学シミュレーション蛋白質複合体を修復などさまざまな MS のデータを統合する方法について説明します。結果のアプローチは、重要な生物学的プロセスに関与する他の蛋白質の複合体にリガンド結合の詳細な研究のためのフレームワークを提供します。

ネイティブの MS の結果では、オリゴマーの状態, 組成とヘラぬ複合体 (図 1) の位相を明らかにしました。気相における非共有結合性相互作用が保持され、ATP γ S と ADP 滴定実験のネイティブの MS 決定ヘラぬ (図 2) に一対のヌクレオチド結合、ATP γ S 濃度を高くと相対的な増加6 量体ヘラ (図 3) の輝度。ネイティブの MS が続くソリューションで破壊から得られたに同意していた相互作用サブユニットに関する構造情報と理論的大衆 (図 4 および表 1)。
タンパク質およびその複合体の実験の CCS の値は、IM MS 実験 (図 5) から派生しました。これらの値は回転平均気相分子形状の断面計算で、タンパク質の次元の状態を記述します。CCS の値は、x 線結晶構造解析から理論的な測定と比較され、良い一致を推論の本来の形状がガス相(表 1)に保持します。これは蛋白質アセンブリ48の低解像度モデルを構築するための CCS の値を使用して検証します。
実験参加状態にある各電荷のイオンを計算できます。ネイティブのようなタンパク質リガンド似た CCS 値を持つ多価イオンを充電する上昇を与える可能性があります。しかし、高い電荷状態イオンはクーロン反発理論 CCSs に比べてタンパク質相展開と大きく CCS 値につながる可能性があります増加。イオンは、したがって通常最低の電荷状態の CCS の値には、49が使用されます。ヘラ-ぬ、ヘラ、ヘラぬソリューションで破壊実験 DNA と求めモノマーと開始し、全体の 6 量体 HerA (ヘラ6) を形成アセンブリ経路の生成-複雑なぬ (ぬ2) 二量体DNA (図 6)。
(配位子無料) apo とリガンド結合の CIU 展開プロットの違いは、リガンド結合に伴う複雑な安定性に変更を定義します。高い CV50または KECOM値は、ガス相でより安定したイオンを意味します。CIU、KE のCOM分析による DNA バインド ヘラぬ、無料の DNA の複合体 (図 7Aii) よりも安定。CIU MS それぞれ ATP 結合状態の分析からは、ガス相とすべてのサイトがあるが占められる 6 -ATP γ S バインド済み状態で複雑な安定性低下がほとんどだった 4-ATP-γ-S 束縛状態は (図 7Bii) を安定しています。ネイティブの MS は離散のヌクレオチド結合内のヘラ; の状態を明らかにします。ただし、それはどのヘラ サブユニットが結合、ATP とこのバインディングが行われるを区別できません。この情報は、6 量体ヘラと要約のワークフロー (図 8) に従うヘラぬに明示的な溶媒分子動力学シミュレーションから派生することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> 図 1。オリゴマーの状態、組成、ヘラぬ非共有結合複合体のトポロジーを尋問します。(A) マススペクトルのヘラ、ヘラぬと DNA (15.4 kDa 25 bp 二本鎖 DNA) の存在下でヘラぬ。ヘラ部分複合体は、6 量体と、heptamer の両方として存在します。ぬ二量体が結合してオリゴマー変換を課すヘラ hexamer。DNA は、形成されたヘラ-ぬ複合体 (Z. Ahdashら、2017年22から適応の結果) をバインドします。(特定の種の B) 相対強度は、UniDec32を使用して計算されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> 図 2。ネイティブ ESI MS ヘラぬへのヌクレオチド結合のメカニズムを明らかにします。ヘラ-ぬ (A) と (B) ヘラぬ DNA (ii) ADP と ATP γ S (i) 濃度の増加と質量スペクトルは。測定された固まりと比較される理論的な固まりおよび ATP-γ-S の量または ADP が結合が決定されます。測定された固まりおよびバインドされたヌクレオチドの数はスペクトルに表示されます。ATP γ S と ADP の滴定実験と循環反応機構 (Z. Ahdashら、2017年22から適応の結果) を示す DNA 複合体でヘラぬだけで、一対の塩基配列バインディングを決定しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> 図 3。ヘラ オリゴマーの状態で ATP γ S 濃度の増加の効果を測定します。(ATP γ S の濃度の増加でヘラの A) 質量スペクトル(B) ネイティブの MS から異なる種の相対的強度を示すグラフは、UniDec ・ デコンボリューション ソフトウェア32を使用して計算されます。ATP-γ-S 濃度が上昇、6 量体ヘラの相対強度も増加します。バインドされている ATP γ S 分子の数は、スペクトル (Z. Ahdashら、2017年22から適応の結果) に表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> 図 4。大量スペクトルとヘラ (A) と (B) ヘラぬ (i) のサブ複雑な解離製品単独で、(ii) DNA 次ソリューションの中断の存在。ソリューションで中断を用いて 10-40% アセトニ トリル、メタノール (メタノール)、ジメチルスルホキシド (DMSO)、様々 な subcomplexes の形成の結果します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> 図 5。イオン移動到着時間分布錯体と生成されたサブ錯体の CCS の軸に。図 4にスペクトルに注釈をつけたものと各サブ複雑な相関のアイコン。実験と計算質量とサブ錯体の CCS 値 (波イオンを旅行の解像度における典型的な不確かさを考慮した後の実験と計算値間の合意を示したすべての表 1に記載されて移動質量の ± 5-837)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> 図 6。ネイティブの MS と IM さん色の円が各サブの複合が認められた状態を示すソリューションの崩壊から生成されたヘラぬ複合体のアセンブリ経路: ネイティブ (緑、中断する前に)、メタノール (黄色), DMSO (パープル) またはアセトニ トリル (赤)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> 図 7。ヘラぬと (B) atp ヘラぬ DNA と DNA (A) の安定の効果を調査しています。(i) 気相 CIU MS プロットおよび (ii) 質量中心衝突エネルギー (KEcom) 計算 dsDNA の存在がヘラぬ複合体を安定化し、6 ATP γ S バインド状態であることは最も安定していることを示します。異なる電荷状態の安定化が表示されます。プロットは、パルサー 33を使用して生成されました。Z. Ahdashら、2017年22から適応 (A) からの結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> 図 8。差動分子動力学モデリング手順のワークフロー。(A) 既存のサブユニットと不足している残基の再構築からトポロジを構築することにより調査の下で複合体を生成します。(B) タンパク質とリガンド複合体の分子動力学シミュレーションを実行するためのワークフロー。分子動力学シミュレーション蛋白質の参照として機能してタンパク質とリガンドのシミュレーションから減算するだけ走った。これはシミュレーションの間差分の二乗平均ゆらぎ (RMSF) を計算し、リガンド結合の効果を決定するが続きます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>複雑な/複雑なサブ</td>
			<td>理論的な大量 (kDa)</td>
			<td>実験的質量 (kDa)</td>
			<td>理論的な CCS (Å2)</td>
			<td>実験的 CCS (Å2) [料金]</td>
			<td>HN の条件</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘラ6- ぬ2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 42 [+] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20%、10-40% DMSO ACN 10% メタノール</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘラ6- ぬ2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 39 [+] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 42 [+]</td>
			<td>ACN 10%、10% メタノール</td>
		</tr>
<tr>
<td>ぬ1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% 10% メタノール、ACN の 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>ぬ2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] [19 +] 4666</td>
			<td>20-40 %dmso、10-40% メタノール</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘラ1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +]</td>
			<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・ アプローチを統合します。

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

現在では、質量分析は構造生物学において重要な役割を果たしています。この方法は、ネイティブ状態の重要な生体高分子、特にタンパク質およびタンパク質複合体に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。天然型の質量分析は、マルチプロテインおよび核酸系を含む様々な生体分子集合体に広く適用可能です。この手法の主な利点は、迅速で高感度です。異種タンパク質サンプルを問い合わせ、オリゴマー状態の複数のタンパク質を同時に分析することを可能にする。この手順をデモンストレーションすることは、私のグループの博士課程の学生であるアンディ・ラウです。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、ナノエレクトロスプレー用の社内毛細血管を準備します。各ランの制御としてリガンドフリーサンプルを調製し、それぞれ酢酸アンモニウムにバッファー交換を行います。次に、感度、正イオン集録、および移動性 TOF モードを選択します。次に、トラップ、API、および IMS の各ガスをオンにします。IM分離のためにここに示されている窒素とアルゴンの出発点を使用し、必要に応じて調整します。適切な m/z 取得範囲を設定します。未知のタンパク質の場合、初期最適化ステップは広い範囲を使用する必要があります。金でコーティングされたキャピラリーをキャピラリーホルダーに挿入します。その後、目的のタンパク質複合体溶液の2〜3マイクロリットルの間に毛細血管に負荷を入れておく。毛細管を軽く締め、エレクトロスプレーソースステージに置きます。ステージをスライドさせて、データの取得を開始します。毛細血管の先端に落下が形成されるまで、低ナノフローガス圧力を適用します。コーンに対してキャピラリーを動かし、イオン電流を監視して安定したイオン電流を実現します。0.9~1.6キロボルトの範囲でキャピラリー電圧を印加します。次に、テキスト プロトコルで説明されているように、サンプリング コーン、ソース オフセット、ソース温度、およびコーン ガス フローを設定します。十分に解決された質量スペクトルと最大イオン伝送を取得するには、MSパラメータを調整し、スペクトルの結果の変化を監視します。トラップ衝突エネルギーを 10 ~ 50 ボルトの初期開始点に設定します。電圧オフセットが不十分な場合は、トラップの衝突エネルギーを調整します。トラップを電圧で20~45ボルトの初期開始点に設定します。この電圧を最適化することで、脱解を改善します。その後、テキストで説明されているように波速と波の高さを最適化して、最適な移動性の分離を実現します。HerAとNurAを含む研究では、毎秒40メートルの波速度と550〜650ボルトの間の波の高さを使用しています。DNA結合解析では、タンパク質とDNAを大臼歯比で混合し、タンパク質DNA複合体の形成を可能にします。以下のいずれか、5'O-3-チオ-三リン酸、四リチウム塩、またはADPのいずれかの増加量を追加します。適切なソフトウェアを使用して、生成された種の質量を測定し、ATPおよびADP結合およびオリゴマー状態などのリガンド結合を同定する。次に、生のESI MSスペクトルで観察されたイオン強度を使用して、対応する種の相対的な存在量を定量化します。安定した伝送のために機器条件を最適化した後、良好なスペクトル品質を維持しながら、衝突エネルギーとサンプリングコーンを可能な限り低く減らします。IM MS を取得するには、以前に決定した最適化された波速と波の高さを使用します。同じ波の高さを維持しながら、3つの異なる波速でイオンドリフト時間を測定します。タンパク質イオンCCSを決定するために、4つのタンパク質較正剤を測定し、2つは調査中のタンパク質の上の質量を有し、2つは以下の質量を有し、同じ計装条件を使用する。まず、タンパク質サンプルを調製し、テキストプロトコルで概説されているように、それらを酢酸アンモニウムに交換します。所望の量に達するまで10%ずつずつ溶媒を加えます。氷の上で1時間インキュベートします。この後、各サンプルの IM-MS スペクトルを取得します。SUMMITソフトウェアを使用して、タンパク質サブ複合体を割り当て、タンパク質相互作用ネットワークを生成します。または、期待される種の理論質量のリストを手動で生成します。タンパク質の複雑な安定性の調査を開始するには、トラップ加速電圧を10ボルトから200ボルトに引き上げながらIM-MSデータを記録し、タンパク質と気相に徐々に展開します。適切なソフトウェアを使用してデータを分析し、各電荷状態の各加速電圧で強度正規化されたCCS分布を積み重ねて2次元展開プロットを生成します。ネイティブMSの結果は、HerAとNurA複合体のオリゴマー状態、組成、およびトポロジーを明らかにします。非共有結合相互作用が気相に保存されるので、ATP γ SおよびADP滴定実験のネイティブMSは、HerAおよびNurAにおける対ワイズヌクレオチド結合を決定するために使用される。HerAオリゴマー状態の質量スペクトルは、ATP γ S濃度を増加させることで六角ヘラの相対的強度が増加することを明らかにした。タンパク質およびその複合体の実験的CCS値は、次いでIM-MS実験から導出される。これらの値は、タンパク質アセンブリの低分解能モデルを構築するためのCCS値を使用して検証するX線結晶学からの理論的測定と良好な一致を有すると見られる。CIUとKEcomの分析は、DNA結合HerA-NurAがDNAフリー複合体よりも安定していることを明らかにします。CIU MS分析およびそれぞれのATP結合状態は、4つのATPガンマS結合状態がガス相における複雑な安定性を低下させることを示している。しかし、全ての部位が占める6つのATPガンマS結合状態は、最も安定しているとみられる。インタクトな複合体の分子質量を正確に測定することで、生体分子特性評価に関する貴重な洞察を得られます。複雑な組み立て経路、タンパク質オリゴマー化、リガンド結合に関する情報を得ることができます。この情報をすべて組み合わせることで、機能的な生物学的アセンブリの詳細なモデルを生成することができます。

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化学

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ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々...

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

標的架橋質量分析は、最大3つの異なる取得プロトコルを使用して取得した質量分析データを使用して、第4級タンパク質構造モデルを作成します。Cheetah-MS Webサーバーで簡略化されたワークフローとして実行すると、結果はJupyter Notebookに報告されます。ここでは、Jupyter...

化学架橋質量分析による第四次構造モデリング:TX-MSジュピターレポートの拡張

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。...

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

学ぶタンパク質複合体のネイティブ質量分析による構造解析。HerA-NurA複合体のオリゴマー状態、リガンド結合、衝突誘起解離を用いた安定性評価法を解説。生体分子の動的挙動と相互作用ネットワーク構築への応用を示す。

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

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