隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

この方法は、オートファゴソーム形成がどのように制御されているか、さまざまな細胞処理や条件がバルクオートフォジーにどのように影響するかなど、オートファジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、内因性貨物隔離を測定することです。したがって、この方法は広く適用可能であり、人為的な過剰発現またはカーゴプローブの導入とは無関係である。

その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるPaula SzalaiとMorten Luhrです。まず、75平方センチメートルの組織培養フラスコで、摂氏37度で5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで接着細胞を培養します。細胞がほぼコンフルエントな細胞層に到達するまで細胞を成長させます。

この後、pH 7.4で摂氏37度の3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。PBSを取り外し、0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルと交換します。加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を摂氏37度で、細胞が剥離するまでインキュベー

次に、10%FBSを含有する7ミリリットルの培養培地に細胞を再懸濁し、滅菌した50ミリリットルチューブに移します。0.5〜20マイクロリットルのピペットチップを使用して、10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルーが入ったマイクロ遠心チューブに移します。同じピペットチップを使用して、計数チャンバースライドにすぐに充填し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。

次に、10%FBSを含む培地を使用して、細胞懸濁液の適切な希釈液を調製します。無菌技術を使用して、希薄細胞懸濁液の1ミリリットルを12ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種します。加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を摂氏37度でインキュベートし、目的の細胞密度に達するまでインキュベートします。

所望の実験的処理では、沈降性LDHのバックグラウンドレベルを定義するために、1セットのウェルを未処理のままにします。収穫の3〜4時間前に、各ウェルに飽和量のポストセキュレーション阻害剤Bafilomycin A1を添加します。加湿インキュベーターで、摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベー

治療期間の終わりに、あなたは媒体を吸引するために吸引します。37°Cに予熱した200μリットルの細胞剥離溶液を各ウェルに加えます。細胞が剥離するまで摂氏37度でインキュベートします。

各ウェルに2%BSAを含むpH 7.4の室温PBS500マイクロリットルを添加します。ピペットを使用して、細胞の塊が見えなくなるまで各ウェルを再懸濁します。この後、直ちに各ウェル内の細胞懸濁液を氷上の別々の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。

チューブを400倍g、摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞を沈殿させます。吸引を使用して上清を完全に吸引し、細胞ペレットをできるだけ乾燥させます。次に、超純水に10%のスクロースを含む400マイクロリットルの溶液を各チューブに加えます。

ピペットを使用して、細胞ペレットを再懸濁し、ほぼ単一細胞懸濁液を得ました。この懸濁液を4mmエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットを指数関数的減衰波エレクトロポレーターに入れ、800ボルト、25マイクロファラッド、400オームで単一の電気パルスを放電します。

新しいピペットチップを使用して、細胞破壊物を400マイクロリットルの氷冷リン酸緩衝ショ糖溶液を含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、ピペッティングで短時間混合します。この再懸濁、電気破壊、および混合プロセスを各サンプルに対して繰り返します。この手順を初めて実行する場合は、本文に記載されているように、効率的で選択的な原形質膜の電気破壊を確認してください。

沈殿LDH画分を得るためには、希釈した各細胞かく乱液から550マイクロリットルを取り出し、それを0.5%BSAおよび0.01%Tween 20を含む900マイクロリットルの氷冷再懸濁緩衝液を含む自身の2ミリリットル微量遠心チューブに移す。ピペットで簡単に混ぜます。18, 000倍g、摂氏4度で45分間遠心分離し、沈殿LDHを含むペレットを生成します。

吸引を使用して、上清を完全に吸引し、ペレットをできるだけ乾燥させます。沈殿したLDHサンプルは、分析の準備が整うまで摂氏マイナス80度で保存します。総LDHフラクションについては、希釈した細胞破壊液のそれぞれから150マイクロリットルを自身の新しいチューブに移します。

分析の準備ができるまで、これらをマイナス80°Cの冷凍庫に保管してください。沈殿したLDHと氷上のLDHサンプル全体を解凍します。解凍後、1.5%Triton X-405を含む300マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーをLDHサンプルの合計に加えます。

冷蔵室のローラーでサンプルを30分間回転させます。次に、沈殿したLDHサンプルに1%Triton X-405を含む750マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーを追加します。ピペットを使用して、溶液が均一になるまでペレットを再懸濁します。

すべてのサンプルを18, 000倍g、摂氏4度で5分間遠心分離し、未溶解の細胞破片を沈殿させます。遠心分離が完了したら、サンプルを氷の上に置きます。上清中のLDHのレベルは、本文に記載されている従来の酵素アッセイ、または市販の多種多様なキットのいずれかを使用して測定します。

この研究では、バルクオートファジー阻害活性を、いくつかの異なる哺乳類細胞株でモニターします。ここに示すように、基底細胞と飢餓誘発性LDH隔離細胞とLNCaP細胞は、汎PI3-キナーゼ阻害剤である3MAによって完全に廃止されます。選択的PI3-キナーゼクラス3阻害剤であるSAR-405およびERカルシウムポンプ阻害剤であるThapsigarginです。

HEK293細胞では、飢餓条件下でのLDH隔離は、タプシガルギンとULK阻害剤であるMRT 67307の両方によって大幅に減少します。さらに、飢餓誘発性LDH隔離は、他の観察された細胞株の3MAによって一貫して阻害されることが示されています。次に、さまざまなATG遺伝子ノックアウトMEFを使用して、オートファゴソーム形成に必須と報告されているオートファジー関連遺伝子がLDH隔離に必要かどうかを試験します。

見てわかるように、ATG5ノックアウトMEFSでは飢餓誘発性LDH隔離が廃止されています。さらに、ATG7およびATG9AノックアウトMEFでも鈍くなります。最後に、主要なATG遺伝子転写産物のRNAiを介したサイレンシングの影響が決定されます。

siRNAを標的とするATG9Aによるトランスフェクション、またはULK1とULK2の併用によるトランスフェクションは、LNCaP細胞におけるLDHの隔離を強力に減少させることが分かっています。この手順を試行する際は、すべてのピペッティングステップで正確であることが重要です。この手順に続いて、長寿命タンパク質分解アッセイなどの他の方法を実行して、隔離活性に観察された変化があり、オートファジー分解活性に匹敵する変化が見られるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。

この方法を哺乳類の細胞株で確立した後、この方法を使用して、バルクオートファジーがLC3タンパク質ファミリーから独立しており、代わりにGABARAPが必要であることを実証しました。このことは、オートファジー活性をモニターするためにLC3に依存しない方法を採用することの重要性を浮き彫りにしています。