隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法
2018年7月27日
ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH) の割合を定量化に基づいています。
この方法は、オートファゴソーム形成がどのように制御されているか、さまざまな細胞処理や条件がバルクオートフォジーにどのように影響するかなど、オートファジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、内因性貨物隔離を測定することです。したがって、この方法は広く適用可能であり、人為的な過剰発現またはカーゴプローブの導入とは無関係である。
その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるPaula SzalaiとMorten Luhrです。まず、75平方センチメートルの組織培養フラスコで、摂氏37度で5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで接着細胞を培養します。細胞がほぼコンフルエントな細胞層に到達するまで細胞を成長させます。
この後、pH 7.4で摂氏37度の3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。PBSを取り外し、0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルと交換します。加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を摂氏37度で、細胞が剥離するまでインキュベー
トします。次に、10%FBSを含有する7ミリリットルの培養培地に細胞を再懸濁し、滅菌した50ミリリットルチューブに移します。0.5〜20マイクロリットルのピペットチップを使用して、10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルーが入ったマイクロ遠心チューブに移します。同じピペットチップを使用して、計数チャンバースライドにすぐに充填し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。
次に、10%FBSを含む培地を使用して、細胞懸濁液の適切な希釈液を調製します。無菌技術を使用して、希薄細胞懸濁液の1ミリリットルを12ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種します。加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を摂氏37度でインキュベートし、目的の細胞密度に達するまでインキュベートします。
所望の実験的処理では、沈降性LDHのバックグラウンドレベルを定義するために、1セットのウェルを未処理のままにします。収穫の3〜4時間前に、各ウェルに飽和量のポストセキュレーション阻害剤Bafilomycin A1を添加します。加湿インキュベーターで、摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベー
トします。治療期間の終わりに、あなたは媒体を吸引するために吸引します。37°Cに予熱した200μリットルの細胞剥離溶液を各ウェルに加えます。細胞が剥離するまで摂氏37度でインキュベートします。
各ウェルに2%BSAを含むpH 7.4の室温PBS500マイクロリットルを添加します。ピペットを使用して、細胞の塊が見えなくなるまで各ウェルを再懸濁します。この後、直ちに各ウェル内の細胞懸濁液を氷上の別々の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。
チューブを400倍g、摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞を沈殿させます。吸引を使用して上清を完全に吸引し、細胞ペレットをできるだけ乾燥させます。次に、超純水に10%のスクロースを含む400マイクロリットルの溶液を各チューブに加えます。
ピペットを使用して、細胞ペレットを再懸濁し、ほぼ単一細胞懸濁液を得ました。この懸濁液を4mmエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットを指数関数的減衰波エレクトロポレーターに入れ、800ボルト、25マイクロファラッド、400オームで単一の電気パルスを放電します。
新しいピペットチップを使用して、細胞破壊物を400マイクロリットルの氷冷リン酸緩衝ショ糖溶液を含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、ピペッティングで短時間混合します。この再懸濁、電気破壊、および混合プロセスを各サンプルに対して繰り返します。この手順を初めて実行する場合は、本文に記載されているように、効率的で選択的な原形質膜の電気破壊を確認してください。
沈殿LDH画分を得るためには、希釈した各細胞かく乱液から550マイクロリットルを取り出し、それを0.5%BSAおよび0.01%Tween 20を含む900マイクロリットルの氷冷再懸濁緩衝液を含む自身の2ミリリットル微量遠心チューブに移す。ピペットで簡単に混ぜます。18, 000倍g、摂氏4度で45分間遠心分離し、沈殿LDHを含むペレットを生成します。
吸引を使用して、上清を完全に吸引し、ペレットをできるだけ乾燥させます。沈殿したLDHサンプルは、分析の準備が整うまで摂氏マイナス80度で保存します。総LDHフラクションについては、希釈した細胞破壊液のそれぞれから150マイクロリットルを自身の新しいチューブに移します。
分析の準備ができるまで、これらをマイナス80°Cの冷凍庫に保管してください。沈殿したLDHと氷上のLDHサンプル全体を解凍します。解凍後、1.5%Triton X-405を含む300マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーをLDHサンプルの合計に加えます。
冷蔵室のローラーでサンプルを30分間回転させます。次に、沈殿したLDHサンプルに1%Triton X-405を含む750マイクロリットルの氷冷再懸濁バッファーを追加します。ピペットを使用して、溶液が均一になるまでペレットを再懸濁します。
すべてのサンプルを18, 000倍g、摂氏4度で5分間遠心分離し、未溶解の細胞破片を沈殿させます。遠心分離が完了したら、サンプルを氷の上に置きます。上清中のLDHのレベルは、本文に記載されている従来の酵素アッセイ、または市販の多種多様なキットのいずれかを使用して測定します。
この研究では、バルクオートファジー阻害活性を、いくつかの異なる哺乳類細胞株でモニターします。ここに示すように、基底細胞と飢餓誘発性LDH隔離細胞とLNCaP細胞は、汎PI3-キナーゼ阻害剤である3MAによって完全に廃止されます。選択的PI3-キナーゼクラス3阻害剤であるSAR-405およびERカルシウムポンプ阻害剤であるThapsigarginです。
HEK293細胞では、飢餓条件下でのLDH隔離は、タプシガルギンとULK阻害剤であるMRT 67307の両方によって大幅に減少します。さらに、飢餓誘発性LDH隔離は、他の観察された細胞株の3MAによって一貫して阻害されることが示されています。次に、さまざまなATG遺伝子ノックアウトMEFを使用して、オートファゴソーム形成に必須と報告されているオートファジー関連遺伝子がLDH隔離に必要かどうかを試験します。
見てわかるように、ATG5ノックアウトMEFSでは飢餓誘発性LDH隔離が廃止されています。さらに、ATG7およびATG9AノックアウトMEFでも鈍くなります。最後に、主要なATG遺伝子転写産物のRNAiを介したサイレンシングの影響が決定されます。
siRNAを標的とするATG9Aによるトランスフェクション、またはULK1とULK2の併用によるトランスフェクションは、LNCaP細胞におけるLDHの隔離を強力に減少させることが分かっています。この手順を試行する際は、すべてのピペッティングステップで正確であることが重要です。この手順に続いて、長寿命タンパク質分解アッセイなどの他の方法を実行して、隔離活性に観察された変化があり、オートファジー分解活性に匹敵する変化が見られるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。
この方法を哺乳類の細胞株で確立した後、この方法を使用して、バルクオートファジーがLC3タンパク質ファミリーから独立しており、代わりにGABARAPが必要であることを実証しました。このことは、オートファジー活性をモニターするためにLC3に依存しない方法を採用することの重要性を浮き彫りにしています。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、哺乳類細胞におけるバルクオートファジー隔離活性を測定するための検証済みプロトコルについて説明します。この方法では、沈殿可能な細胞画分中の乳酸脱水素酵素（LDH）の割合を細胞全体のLDHレベルと比較して定量化します。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- オートファジー研究
- 細胞代謝
背景
- オートファジーは、細胞成分を分解し再利用するための重要な細胞プロセスです。
- オートファゴソームの形成を理解することは、様々な処理に対する細胞応答を解明するために不可欠です。
- この方法により、人工的なプローブを必要とせずに、内因性のカーゴ隔離を測定し、洞察を提供します。
- 異なる細胞種および条件に適用可能です。
研究の目的
- 哺乳類細胞におけるオートファジー活性を評価するための信頼性の高いプロトコルを提供すること。
- 異なる処理がバルクオートファジーにどのように影響するかを探ること。
- オートファゴソーム形成の制御の理解を深めること。
使用された方法
- 組織培養フラスコで付着性細胞を培養すること。
- 5% CO2の加湿環境で37度で細胞をインキュベートすること。
- ほぼ完全層が達するまで細胞を成長させること。
- 沈殿可能な画分と細胞全体のレベルにおけるLDHレベルを定量化すること。
主な結果
- このプロトコルは、バルクオートファジー隔離活性を正常に測定します。
- 様々な処理がオートファジーに与える影響を示します。
- 結果は、内因性のカーゴ隔離を研究するための信頼性の高い方法を示しています。
結論
- この方法は、哺乳類細胞におけるオートファジーを研究するための堅固なアプローチを提供します。
- 幅広い実験条件に適用可能です。
- 将来の研究は、このプロトコルを活用してオートファジープロセスをさらに調査することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative measurement of endogenous autophagic sequestration without artificial probes, providing a reliable readout for target validation in autophagy-modulating drug discovery. By reflecting bulk cytosolic cargo capture, it supports mechanistic de-risking of compounds affecting lysosomal degradation pathways. The assay’s applicability across mammalian cell types enhances translational consistency in preclinical screening cascades.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures endogenous LDH sequestration to interrogate autophagosome formation regulation independent of overexpression artifacts.
- Operational Value: Uses stable, abundant cytosolic LDH as a native reporter for bulk autophagy flux.
- Scientific Value: Enables pathway clarification via pharmacological and genetic perturbation (e.g., 3MA, SAR-405, ATG knockouts).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative LDH activity readouts in sedimentable versus total fractions for comparative compound screening.
- Operational Value: Employs electrodisruption-based fractionation to isolate autophagosome-associated LDH with high reproducibility.
- Operational Value: Compatible with 12-well plate formats and standard enzymatic LDH detection kits.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates LC3-independent autophagy dependence on GABARAPs, informing target selection criteria.
- Operational Value: Validated in multiple mammalian cell lines (HEK293, LNCaP, MEFs) supporting cross-model reproducibility.
- Scientific Value: Links sequestration activity to degradation flux when paired with long-lived protein assays.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery to evaluate target engagement of autophagy modulators before lead optimization, particularly for lysosomal pathway modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of autophagosome formation kinetics under nutrient stress or inhibitor treatment.
- Screening: Enables assay-ready quantification of sequestration changes in response to compound libraries.
- Analytics: Generates proportional LDH sedimentation data normalized to untreated controls for statistical comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by confirming genetic dependencies (ATG5, ATG7, ATG9A) in murine models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable QC checkpoint for autophagy pathway modulation across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by measuring native cargo sequestration rather than surrogate markers.
- Operational Value: Standardizes autophagy assessment via sedimentation and enzymatic activity readouts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement in degradation pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on autophagic flux modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture fractionation and enzymatic assay normalization.
- Depends on electroporation equipment and low-speed/high-speed centrifugation capabilities.
- Necessitates standardization of sequestration inhibitor timing (e.g., Bafilomycin A1) across laboratories.
- Adaptation considerations include varying transfection efficiencies in primary versus immortalized cell lines.
- Practical limitation: Assay reflects sequestration only; complementary flux assays needed for degradation confirmation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:40
Cell Seeding and Treatment
2:46
Cell Harvest and Preparation for Electrodisruption
3:53
Plasma Membrane Electrodisruption and Separation of Sedimentable- and Total Cell Fractions
5:50
LDH Extraction and Measurement of LDH Enzymatic Activity
6:55
Results: Monitoring Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells
8:43
Conclusion
