Name: 隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ乳酸脱水素酵素試金によるオートファジー隔離活性測定法。哺乳類細胞における一括オートファジー活性を定量的に評価し、細胞内タンパク質分解メカニズムの理解に貢献します。

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この作品は、ノルウェーの研究評議会、オスロ大学、Anders Jahre Foundation、ナンセン財団、ヘンリック ・ ホーマンのメモリで従来によって支えられた財政的に。我々 は、ATG5 の水島昇先生に感謝 + MEFs、ATG5/MEFs、ATG7 の小松雅明博士の + + + MEFs と atg 7生/MEFs、審良静男教授、ATG9A の + + MEFs と ATG9A/MEFs。建設的な方法論的議論のためのテクニカル サポートは、o. Seglen あたり博士フランク Sætre をありがちましょう。

1. 細胞と治療
<ol><li>
5% CO2問題のセル型の最寄りの培養液を使用して、37 ° c で加湿のインキュベーターで 75 cm2培養フラスコに細胞を付着。合流の近くの細胞層に達するまで成長する細胞を許可します。 注: を使用して、10% 牛胎児血清 (FBS) LNCaP HEK293、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) BJ の RPMI 1640 培 MCF-7、および網膜色素上皮 - 細胞。<ol>
<li>3 mL 37 ° C リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4 でセルを洗浄します。PBS に置き換えて 3 mL 0.25% (w/v) トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、セルをデタッチ (2-5 分) まで、37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターでフラスコを孵化させなさい。</li>
		<li>10% を含む 7 mL 培養液中の剥離細胞を再懸濁します FBS。10 μ L で 10 μ L 細胞懸濁液因数をミックス 0.4 %0.5-20 μ L ピペット チップを用いた微量遠心チューブにトリパン ブルー。カウント チェンバー スライドをすぐに埋めるため同じピペット チップを使用し、自動化された細胞カウンターでセルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
 <ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><ol><li><li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li><li></li><li><li></li></ol><ol><li> </li><li><li><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol></li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg"></li></ol>

<ol><li>Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yoshinori+Ohsumi%27s+Nobel+Prize+for+mechanisms+of+autophagy%3A+from+basic+yeast+biology+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Coll+Physicians+Edinb%22%5BJournal%5D)">Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential.</a> J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exponential+growth+of+autophagy-related+research%3A+from+the+humble+yeast+to+the+Nobel+Prize%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize.</a> FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).</li>
<li>Seglen, P. O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25576638">Macroautophagic cargo sequestration assays.</a> Methods. 75, 25-36 (2015).</li>
<li>Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3743649">Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway.</a> Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).</li>
<li>Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+dependence+of+different+steps+in+the+autophagic-lysosomal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway.</a> J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).</li>
<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelysosomal+convergence+of+autophagic+and+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways.</a> Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).</li>
<li>Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase-dependent+effects+of+okadaic+acid+on+hepatocytic+autophagy+and+cytoskeletal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity.</a> Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+j%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Szalai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+bulk+sequestration+of+cytosolic+cargo+is+independent+of+LC3%2C+but+requires+GABARAPs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs.</a> Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> J Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+human+cells+lacking+ATG8+proteins+uncovers+roles+for+GABARAPs+and+the+CCZ1%2FMON1+regulator+C18orf8%2FRMC1+in+macro+and+selective+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux.</a> Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonselective+autophagy+of+cytosolic+enzymes+by+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes.</a> J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).</li>
<li>Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins%3A+a+class+of+inhibitors+of+membrane+ATPases+from+microorganisms%2C+animal+cells%2C+and+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).</li>
<li>Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+assay+of+pyruvic+and+lactic+acids.+A+definitive+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure.</a> Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).</li>
<li>Bergmeyer, H. U., Bernt, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis+%282nd+English+ed%29%22">Methods of enzymatic analysis (2nd English ed)</a>. Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).</li>
<li>Engedal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+intracellular+calcium+homeostasis+blocks+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation.</a> Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).</li>
<li>Luhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Cargo+Sequestration+Assay+for+Quantitative+Measurement+of+Nonselective+Autophagy+in+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells.</a> Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).</li>
<li>Mousavi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibitors+of+the+vacuolar+proton+pump+on+hepatic+heterophagy+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy.</a> Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).</li>
<li>Seglen, P. O., Gordon, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Methyladenine%3A+specific+inhibitor+of+autophagic%2Flysosomal+protein+degradation+in+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).</li>
<li>Ronan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+potent+and+selective+Vps34+inhibitor+alters+vesicle+trafficking+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy.</a> Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).</li>
<li>Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+steps+in+the+autophagic-lysosomal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+j%22%5BJournal%5D)">Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway.</a> Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+assays+for+mammalian+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Sequestration assays for mammalian autophagy.</a> Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).</li>
<li>Hurley, J. H., Young, L. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28301741">Mechanisms of Autophagy Initiation.</a> Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).</li>
<li>Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin%2C+a+tumor+promoter%2C+discharges+intracellular+Ca2%2B+stores+by+specific+inhibition+of+the+endoplasmic+reticulum+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).</li>
<li>Kuma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autophagy+during+the+early+neonatal+starvation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of autophagy during the early neonatal starvation period.</a> Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+starvation-induced+and+constitutive+autophagy+in+Atg7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice.</a> J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9a+controls+dsDNA-driven+dynamic+translocation+of+STING+and+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).</li>
<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7140848">Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization.</a> Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>An, H., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+ribophagy+in+human+cells+reveals+bystander+flux+during+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy.</a> Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).</li>
<li>Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+support+production+of+starvation-induced+autophagosomes+but+not+their+targeting+and+fusion+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).</li>
<li>Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Atg2+proteins+are+essential+for+autophagosome+formation+and+important+for+regulation+of+size+and+distribution+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).</li>
<li>Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+activity+measured+in+whole+rat+hepatocytes+as+the+accumulation+of+a+novel+BHMT+fragment+%28p10%29%2C+generated+in+amphisomes+by+the+asparaginyl+proteinase%2C+legumain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain.</a> Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).</li>
<li>Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+cytoplasmic+enzymes+in+an+autophagic+vacuole-lysosomal+system+induced+by+injection+of+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin.</a> J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Ogier-Denis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotrimeric+Gi3-protein+controls+autophagic+sequestration+in+the+human+colon+cancer+cell+line+HT-29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29.</a> J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).</li>
<li>Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%5B3H%5Draffinose+as+a+specific+probe+of+autophagic+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration.</a> Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).</li>
<li>Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Long-lived+Protein+Degradation+Assay%3A+an+Efficient+Method+for+Quantitative+Determination+of+the+Autophagic+Flux+of+Endogenous+Proteins+in+Adherent+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines.</a> Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).</li>
<li>Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+protein+degradation+through+the+cell+cycle+of+human+NHIK+3025+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro.</a> Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).</li>
<li>Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+lysosomal+pathway+of+protein+degradation+in+isolated+rat+hepatocytes+by+ammonia%2C+methylamine%2C+chloroquine+and+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin.</a> Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).</li>
<li>Seglen, P. O., Solheim, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valine+uptake+and+incorporation+into+protein+in+isolated+rat+hepatocytes.+Nature+of+the+precursor+pool+for+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis.</a> Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).</li>
<li>Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+of+autophagic+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assaying of autophagic protein degradation.</a> Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).</li>
<li>Engedal, N., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+of+cytoplasmic+bulk+cargo+does+not+require+LC3%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3.</a> Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).</li>
</ol>

著者は利害の対立があります。

要約するは、ここで説明されているプロトコルは哺乳類セルの一括 autophagic 隔離アクティビティを監視する信頼性が高く、広く適用できるメソッドを表します。元法12,16と比較して、いくつかの不要なステップを削除、残りの手順のいくつかを簡略化して実質的なダウンスケー リング手法を導入します。結果として、プロトコルが大幅に効率に関連してコスト- と時間- と同じサンプル量は、元のプロトコルと比較すると半分以下の時間で処理できるようです。24 サンプル手順 2-3 (1 日目) が必要になります準備プラスの約 1/2 h 効率的な作業の 3 h ~ 2 h でステップ 4 (2 日目) を実行できるに対し (時間のことを考えると必要なすべてのバッファーはあらかじめ準備された見積もり)。1 通常 baf は 3-4 時間培養 autolysosomal LDH 劣化の他の阻害剤など細胞治療で前の日に試金から 2 日連続でアッセイを分割すると便利です。しかし、それも、同じ日に全体の分析を実行する可能です。その場合は、それはス...

オートファジー (「自己を食べる」のギリシャ語) は、細胞内物質の液胞/ライソゾームの分解の進化保存されたプロセスです。酵母とヒトのオートファジーのために重要であるオートファジー関連 (「ATG」) 遺伝子の発見時に実現オートファジーは、人間の健康と病気 (2016年ノーベル医学・生理学によって認められる重要な役割を果たしています。大隅良典)、オートファジーは細胞生物学1,2で最も激しく学びのプロセスの 1 つになるすぐに。
Macroautophagy (以下「オートファジー」といいます) 延長で特徴づけられると効果的に隔離密閉、ダブル membrane の構造 (「オートファゴソーム」) に細胞内膜 cisternae ("phagophores") の折りたたみ、細胞質の残りの部分からそのただ中の材料。オートファゴソーム リソソームとの融合、時に内側 autophagosomal 膜と隔離の貨物は劣化や再生します。オートファゴソームは、ランダムな (非選択的オートファジー) と選択 (選択的オートファジー) マナーの両方で細胞質材料を隔離することができます。最も可能性の高い一括オートファジーは、非選択的、選択的オートファジーのミックスを表します。
1960 年代および 70 年代 (「形態」の時代オートファジー研究)、オートファジー隔離主に微細構造分析によって評価しました。1980 年代と 1990 年代 (「生化学的時代」) あたり Seglen と同僚の初め-初代ラット肝細胞でオートファジーを勉強した-定量的 autophagic 隔離アクティビティ3を測定する最初方法を開発しました。これらの試金を使用して、Seglen 定義しオートファジー ・ リソソーム経路4、5の異なるステップを特徴と、発見し amphisome6 (エンドソーム オートファゴソーム融合の製品) を鋳造し、初めてオートファジー規制7蛋白質のリン酸化の役割を説明します。ただし、1990 年代に ATGs (「分子時代」) の発見と哺乳類 ATG8 蛋白質の最初の特徴の後微小管結合蛋白質 1A 1B 光鎖 3 (LC3) の 2000年8、ATG タンパク質ためのマーカーとしての使用、オートファジーの古いより困難な生化学的置き去りになったプロセスはすぐに人気を得た。実際には、過去 18 年間、西部のしみ、LC3 の蛍光顕微鏡による解析で最も人気となっている (と多くの場合、唯一) 哺乳類細胞におけるオートファジーの勉強の手段。利点は、これらの方法を実施したことが比較的容易です。欠点は、1 つは実際のオートファジーの貨物ではなくカート コンポーネント (LC3) を勉強しています。これは、状態や隔離対経路を介して LC3 のフラックスと貨物のフラックスとの関係は非常に不透明なためより深刻な不利な点です。実際には、我々 はバルク貨物フラックスを条件下で高いレベルで保つことが、示されているセル9共役 LC3 の存在にもかかわらず、LC3 フラックスがないです。さらに、我々 はバルク オートファジー効率的 LC3 枯渇による影響はありません、したがって可能性が高い LC3 独立9を示した。この発見は後 LC3 ノックアウト研究10、11、パーキン依存 mitophagy (ミトコンドリアの選択的オートファジー) は LC310,11 の独立をも示すによって確認されています.
要約すると、明確な貨物に基づく試金 autophagic 活動を監視するために必要です。最適適用、明確、かつ簡単に実行、このような試金を広くする必要があります。最後の数年間で121980 年代にあたり Seglen によって開発された、sedimentable、autophagic 液胞を含む細胞へのゾル性細胞質の LDH の転送を測定に基づく LDH の隔離の試金に特に興味を採用して分数。LDH は、phagophores enwrap 細胞質の貨物と共同隔離が容易に安定した、水溶性ゾル性細胞質蛋白質であります。したがって、LDH の隔離です autophagic 隔離の一般的なメジャーです。オートファジー ・ リソソーム経路12LDH は低下のみ。したがって、ライソゾームの分解阻害剤バフィロマイシン A1などの存在下で (Baf)13日実験的治療の効果の直接 autophagic 隔離活動に変更を反映します。分解阻害剤がない場合は、LDH の隔離と劣化の変化の正味の効果を測定できます。
LDH はすべての細胞型で高度と普遍的表現され酵素アッセイ14,15によって LDH レベル、正確に定量化することができますので、LDH 隔離アッセイは広く適用可能で。しかし、元プロトコル12 -初代ラット肝細胞の確立、かなり時間がかかるは、開始材料としてカスタムメイド放電コンデンサーを大量を必要があります。段階的に徐々 に簡単で汎用性の高い方法にアッセイを変換している私たち。まず、元のプロトコルは哺乳類の細胞ライン16で使用用に脚色されました。第二に、メソッドは、大幅に縮小した3,9だった。第三に、プロトコルのいくつかの手順が排除された、手順17を骨の折れる密度クッションなど。これは同時に、さらにダウンスケー リング サンプル (すなわちより少ない約 15-fold を開始あたり 12 ウェル プレートから単一の井戸を使用してサンプル16あたり 10 cm の板を使用しての最初の出発点から、メソッドの有効になっています。素材)17。第四に、カスタムメイド放電コンデンサー17を置き換えることができます商業エレクトロポレーション機器を識別されます。
ここで LDH 隔離アッセイは、以前に公開された17と比較してメソッドのいくつかのさらなる簡略化が含まれています私たちの最新のプロトコルが表示されます。さらに、異なる種類の細胞の数で得られた典型的な結果のセットを表示すると、重要なは、薬理学的として遺伝子ノックダウンとノックアウト アプローチを用いた手法の実験的検証の複数行が提供されます。全体のプロトコルの全体フロー方式、図 1を参照してください。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLおよび2 mLの微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130 および 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェルプレート&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Accumax&nbsp; 細胞剥離ソリューション</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>A7089</td><td>アリコートを-20°Cに保ちます。Cは何年もの間、そして数ヶ月間冷蔵庫で</td></tr><tr><td>バフィロマイシンA1</td>エン<td>ツォ</td><td>BML-CM110-0100</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>BJ細胞</td>に溶解します <td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>継代で使用します <30</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>バーカーカウンティングチャンバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>カウンテスセルカウンティングチャンバースライド</td><td>サーモフィッシャーサイエントフィック</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>カウンテスII 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエントフィック</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>バーカーカウンティングチャンバー</td><td>用カバーガラスフィッシャーサイエンティフィック</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>クライテリオントリス-HClゲル、4&ndash;20%、26ウェル、15&micro;L、13.3 cm x 8.7 cm(W x L)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Earle's balanced salt solution (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>conatains 0.1% glucose</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Exponential Decay Wave Electroporator</td><td>BTX Harvard装置</td><td>&nbsp;EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>RPMI 1640 中HEK293細胞中の10%最終濃度</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>オートクレーブ 65 mM 溶液を冷蔵庫で数ヶ月間保管</td></tr><tr><td>インキュベーター;自動流れ IR 直接加熱 CO2 インキュベーター</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>LNCaP 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>継代での使用 <30</td></tr><tr><td>3-メチルアデニン (3MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>-20°CでRPMI中の100 mMをストックします。ヒートストックを65°CにCを10分間、最終濃度10mMで使用</td></tr><tr><td>冷蔵マイクロ遠心機</td><td>ベックマン・コールター ライフサイエンス</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>ソフトモード機能付きリフチルドミニージュ</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MRT67307塩酸塩(ULKi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0702</td><td>ULKキナーゼ活性を阻害します。DMSOに溶解します。</td></tr><tr><td>MaxMat Multianalyzer Instrument</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>MCF7 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットチップ3(0.5-20&マイクロ;L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART バリアチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ (1-200 &micro;L)</td><td>VWR</td><td>732-2207&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーARTバリアチップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ(100-1,000 & マイクロ;L)</td><td>VWR</td><td>732-2355&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーARTバリアチップ</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4701070</td><td>フィンピペット F2 GLP キット</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>滅菌済みのH2Oで1 mg/mLのストック溶液を作ります。この溶液は-20°Cで安定しています。Cを少なくとも1年間。</td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>メルク・ミリポア</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1細胞(hTERT RPE-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>ホスホイノシチド 3-キナーゼ クラス III (PIK3C3) を阻害します。DMSOに溶解します。</td></tr><tr><td>サイレンサー セレクト ネガティブ コントロール #1 (siCtrl)</td><td>サーモフィッシャー/アンビオン</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>サイレンサー セレクト ATG9 ターゲット siRNA (siATG9A)</td><td>サーモフィッシャー/アンビオン</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>サイレンサー セレクト FIP200 ターゲット siRNA (siFIP200)サー</td><td>モフィッシャー/アンビオン</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>サイレンサー セレクト ULK1 ターゲット siRNA (siULK1)</td><td>サーモフィッシャー/アンビオン</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher</td><td>/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性二水和物(NaH2PO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>メルク・ミリポア</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性二水和物 (Na2HPO4 &bull; 2H2O )&nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>10%最終濃度の水; 0.45 & microを通してろ過;mフィルターをろ過し、数ヶ月間冷蔵庫で保つ</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>は、SERCA ERのCa2+ポンプを阻害します。DMSOに溶解します。</td></tr><tr><td>トリトンX-405&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1% 最終</td></tr><tr><td>トリパン ブルー染色 0.4%</td><td>分子プローブ</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25% w/v トリプシン)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0.01% 最終</td></tr></tbody></table>

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

一括オートファジーは、ダブル/多 membrane 構造オートファゴソームと呼ばれる細胞質の大部分の隔離によって特徴付けられます。ここでこのプロセスを監視する単純なプロトコルを説明します。また、典型的な結果と各種培養細胞におけるオートファジー誘導下法の実験的検証を提供します。一括オートファジーの中にオートファゴソームは、細胞質、およびそれによりまた他のオートファジーの貨物と一緒に、可溶性細胞質蛋白質を隔離します。LDH は、安定と高い非選択的にオートファゴソームに隔離されます豊富な水溶性のゾル性細胞質酵素です。LDH 貯留量したがって一括 autophagic 貯留量が反映されます。Sedimentable 中の酵素活性の測定に続いて、ゾル性細胞質の LDH から sedimentable から効果的に分離分別の electrodisruption ベース プロトコルを用いて効率的かつ正確にセルで LDH 隔離の決定、全細胞サンプル対分数。オートファジーの隔離は、sedimentable その扱われた細胞から未処理細胞の LDH の割合を減算して決定されます。LDH 隔離アッセイの利点は、どちらかが隔離プローブまたは半定量的なプロテアーゼの異所性発現を含む他の方法ではなく、内因性の貨物のオートファジーの隔離の定量的測定を与えることオートファジーのマーカーや受容体の解析を保護。

プロトコルを使用して記載、LAPC4、DU145、Huh7、PNT2A、hela 細胞、VCaP、H3122、Hec1A を含む、別の哺乳類の細胞ライン数の一括 autophagic 隔離活動 MCF 7 T47D、U2OS、PC3、G361、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs)、網膜色素上皮-1LNCaP、BJ、HEK293 細胞を測定しました。隔離された (完全な栄養豊富な媒体) の基底条件下で査定や細胞における血清およびアミノ酸 ( bona fideオートファジー誘導条件22) 飢えた鋭く。その結果, ldh 飢餓条件下での隔離は広く異なる細胞株、LAPC4, DU145, Huh7 かろうじて検出可能レベルに至るによって異なります、PNT2 細胞 LNCaP 細胞 (図 2 ~1.6%/h (データは示されていない) A)。飢えた初代ラット肝細胞の観察率、上記細胞と通常 2.5–4%/h<sup cla...

ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH) の割合を定量化に基づいています。

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

この方法は、オートファゴソーム形成がどのように制御されているか、さまざまな細胞処理や条件がバルクオートフォジーにどのように影響するかなど、オートファジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、内因性貨物隔離を測定することです。したがって、この方法は広く適用可能であり、人為的な過剰発現またはカーゴプローブの導入とは無関係である。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるPaula SzalaiとMorten Luhrです。まず、75平方センチメートルの組織培養フラスコで、摂氏37度で5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで接着細胞を培養します。細胞がほぼコンフルエントな細胞層に到達するまで細胞を成長させます。この後、pH 7.4で摂氏37度の3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。PBSを取り外し、0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルと交換します。加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を摂氏37度で、細胞が剥離するまでインキュベートします。次に、10%FBSを含有する7ミリリットルの培養培地に細胞を再懸濁し、滅菌した50ミリリットルチューブに移します。0.5〜20マイクロリットルのピペットチップを使用して、10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルーが入ったマイクロ遠心チューブに移します。同じピペットチップを使用して、計数チャンバースライドにすぐに充填し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。次に、10%FBSを含む培地を使用して、細胞懸濁液の適切な希釈液を調製します。無菌技術を使用して、希薄細胞懸濁液の1ミリリットルを12ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種します。加湿インキュベーターで、5%二酸化炭素を摂氏37度でインキュベートし、目的の細胞密度に達するまでインキュベートします。所望の実験的処理では、沈降性LDHのバックグラウンドレベルを定義するために、1セットのウェルを未処理のままにします。収穫の3〜4時間前に、各ウェルに飽和量のポストセキュレーション阻害剤Bafilomycin A1を添加します。加湿インキュベーターで、摂氏37度で5%二酸化炭素とインキュベートします。治療期間の終わりに、あなたは媒体を吸引するために吸引します。37°Cに予熱した200μリットルの細胞剥離溶液を各ウェルに加えます。細胞が剥離するまで摂氏37度でインキュベートします。各ウェルに2%BSAを含むpH 7.4の室温PBS500マイクロリットルを添加します。ピペットを使用して、細胞の塊が見えなくなるまで各ウェルを再懸濁します。この後、直ちに各ウェル内の細胞懸濁液を氷上の別々の1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。チューブを400倍g、摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞を沈殿させます。吸引を使

the-lactate-dehydrogenase-sequestration-assay-simple-reliable-method

Research

JoVE Journal

Biology

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細胞内LC3陽性小胞の蓄積に対する細胞外小胞を介したLC3-II放出の評価

学ぶ乳酸脱水素酵素試金によるオートファジー隔離活性測定法。哺乳類細胞における一括オートファジー活性を定量的に評価し、細胞内タンパク質分解メカニズムの理解に貢献します。

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