酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

この方法は、疾患関連タンパク質の毒性を調節する遺伝的要因や経路など、神経変性疾患分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、酵母交配の非常に効率的なプロセスを使用して、ライブラリ遺伝子の大規模なコレクションに対して酵母モデルをスクリーニングできることです。この方法は、神経変性疾患タンパク質の毒性に関する洞察を提供するだけでなく、他のストレス条件に対する耐性など、酵母の他の細胞プロセスの研究にも適用できます。

この手順は、アレイ化されたプラスミドライブラリーから丸底の96ウェルプレートにプラスミドDNAのウェルあたり5マイクロリットルを分注することから始めます。プレートを摂氏4度に保ちます。次に、一倍体酵母株W303アルファのコロニーを持つ500ミリリットルのフラスコに150ミリリットルの酵母ペプトンデキストロースまたはYPD培地を接種します。

培養物を摂氏30度でインキュベートし、200rpmで一晩振とうします。翌朝、一晩培養したOD600を測定した後、2リットルのYPDで培養物をOD600を0.1に希釈します。200rpmで振とうしながら摂氏30度でインキュベートし、培養物がOD600が0.4〜0.6に達するまで約5時間インキュベー

酵母培養物を回収するには、8本の滅菌250ミリリットル遠心分離ボトルに充填し、室温で3000 xGで10分間遠心分離します。ペレットを乱さずに上澄みを注ぎます。テキストプロトコルに記載されているように酵母を洗浄し、細胞を2本の遠心分離チューブに統合します。

各細胞ペレットを25ミリリットルの0.1モル酢酸リチウム溶液に再懸濁します。再懸濁した細胞を結合し、5ミリリットルのサケ精子DNAを加え、150ミリリットルのフラスコに移します。225rpmで30分間振とうしながら、摂氏30度でインキュベートします。

30分後、細胞混合物を滅菌済み使い捨て試薬リザーバーに注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、35マイクロリットルの細胞混合物を、以前に調製したライブラリープラスミドDNAを含む丸底の96ウェルプレートの各ウェルに移します。96ウェルプレートを1000rpmで1分間ボルテックスします。

プレートを摂氏30度で30分間振とうせずにインキュベートします。プレートを積み重ねて、熱をより効率的に伝達できるようにしてください。96ウェルプレートを摂氏30度のインキュベーターから取り出し、1000rpmで30秒間混合します。

各ウェルに125マイクロリットルの形質転換バッファーを添加し、プレートを1000rpmで1分間ボルテックスします。プレートを摂氏30度で30分間インキュベートします。次に、プレートを摂氏42度のインキュベーターに15分間置いて、酵母にヒートショックを与えます。

プレートを3000 xGで5分間遠心分離します。プレートをゴミ箱の上に反転させ、プレートからバッファーを強制的に捨てることにより、ウェルから変換バッファーを取り外します。逆さにしたプレートを清潔なペーパータオルですばやく拭き取り、プレートの上の液体を取り除きます。

各ウェルに、ライブラリープラスミド上の選択マーカーに対応する200マイクロリットルの最小ドロップアウト培地を添加して細胞をすすぎます。ここでは合成ウラマイナスミディアムを使用します。プレートを3000 xGで5分間遠心分離します。

前に示したように、ゴミ箱の上澄みを取り除きます。各ウェルに2%グルコースを含む160マイクロリットルの最小ウラマイナス培地を加え、プレートを1000rpmで1分間ボルテックスします。プレートを摂氏30度で振とうせずに48時間インキュベートします。

48時間後、形質転換酵母のペレットが各ウェルの底に見えるはずです。液体ディスペンサーを使用して、グルコースを含む100マイクロリットルのウラマイナス培地を、新しい96ウェルプレートのセットの各ウェルに加えます。形質転換酵母を含むプレートを1000rpmで30秒間ボルテックスします。

滅菌プラスチック製の96ピンレプリケーターを使用して、形質転換酵母を含むウェルにピンを配置し、培地で満たされた新しいプレートの対応するウェルに接種します。新しいプレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。24時間後、形質転換に成功した酵母を含む各ウェルの底に酵母のペレットが見えるはずです。

これらの酵母株をグリセロールストックとして保存するには、各ウェルに50マイクロリットルの50%グリセロールを加え、プレートを1000rpmで30秒間ボルテックスし、プレートをアルミホイルで密封し、摂氏マイナス80度で凍結します。グリセロールストックからライブラリー株を復活させるには、マイナス80°Cの冷凍庫から96ウェルプレートを取り出し、アルミホイルを取り出し、酵母を室温で約30分間解凍します。酵母が解凍したら、滅菌プラスチック製の96ピンリプリケーターを使用して、グリセロールストックを96ウェルプレートに2%グルコースを含む160マイクロリットルの新鮮なウラマイナス培地に接種し、摂氏30度で24時間インキュベートします。

ライブラリー菌を使用した直後は、プレートを密封し、マイナス80°Cの冷凍庫に戻してください。ライブラリー菌株が解凍された同じ日に、クエリ酵母株を50ミリリットルのYPDに接種し、250rpmで一晩振とうしながら摂氏30度で増殖させます。翌朝、クエリ酵母株を滅菌済み使い捨て試薬リザーバーに注ぎ、160マイクロリットルのクエリ株を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

液体ディスペンサーを使用して、YPD培地のウェルあたり160マイクロリットルを96ウェルプレートに分注します。クエリ株とライブラリ株プレートを含む96ウェルプレートを短時間ボルテックスし、滅菌済みの96ピンリプリケータを使用して、クエリ株を接種したYPDプレートにライブラリ株を移します。YPDプレートを摂氏30度で24時間インキュベー

24時間後、各ウェルの底に酵母のペレットが見えます。96ウェルプレートに、クエリ株のプラスミドおよびライブラリープラスミド上の選択マーカーに対応する2%ラフィノースを含む最小のドループアウト培地を充填します。滅菌96ピンリプリケーターを使用して、YPD交配培養物から酵母を選択培地に移します。

96ウェルプレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。交配して二倍体細胞を形成し、したがってクエリプラスミドとライブラリープラスミドの両方を含む酵母細胞のみが、この培地で増殖することができます。ラフィノース含有選択培地で48時間増殖した後、二倍体細胞を含むウェルの底にペレットが見えることを確認します。

96ウェルプレートを1000rpmで1分間ボルテックスします。ロボットスポッティングマシンを使用して、寒天プレート上の酵母を4重に、2%のガラクトースと2%の寒天を含むura-his-droupoutプレート、および2%のグルコースと2%の寒天を含むura-his-droupoutプレートにスポットします。スポッティング後、寒天プレートを乾かし、逆さまにして摂氏30度のインキュベーターに4日間置きます。

24時間ごとに、寒天プレートを撮影して酵母の成長を記録します。ALS関連タンパク質FUSの毒性は、最初に二倍体酵母で調べられました。FUSを誘導するガラクトースを含む寒天プレートが示すように、FUS毒性はジプロド酵母と半数体酵母の両方で一貫しています。

形質転換ベースの方法からFUS毒性の抑制因子として以前に同定された5つの遺伝子を、交配法によってテストしました。レーン 1 は、2 つの空のベクトルで変換された制御酵母株です。レーン2は、FUSの発現が非常に有毒である空のベクトルを持つ二倍体FUS酵母株です。

レーン3〜7は、FUSを発現する二倍体酵母と抑制遺伝子を示しています。5つの遺伝子すべてが二倍体酵母のFUSの毒性を救い、交配法が効果的であったことを示しています。次に、この交配ベースの方法を、940遺伝子の過剰発現ライブラリースクリーニングに適用しました。

そして、代表的なプレート1枚の写真が掲載されています。FUSとライブラリ遺伝子が発現するガラクトースプレートに示されているように、FUSはディプロド酵母細胞に対して毒性がありました。緑色の四角で示されたライブラリ遺伝子は、FUSの毒性を救い出しました。

一方、赤い四角で示されているライブラリー遺伝子は、毒性を高めました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、120時間で完了できます。この手順を試行する際は、スクリーニングに使用される表現型が一倍体の交配タイプに依存しないことを事前に確認することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見た後、酵母の疾患関連タンパク質の毒性を救う過剰発現時の遺伝的要因を特定する方法についてよく理解しているはずです。開発後、この技術は、神経変性疾患の分野の研究者が、酵母モデルにおける疾患関連タンパク質の細胞毒性のメカニズムを探求するための道を開くことができる。この手順に続いて、レスキューが特異的であるかどうかなどの追加の質問に答えるために、ベータガラクトシダーゼアッセイなどの他の方法を実行できます。