Name: ダイコン品種使用 PNGase H+からN型糖鎖の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶダイコンRaphanus sativusからのN型糖鎖の迅速な調製と解析法。PNGase H⁺を用いて酵素処理と2-アミノベンズアミド誘導体化をバッファー交換なしで連続して行い、植物グライコサイエンス研究の効率化に貢献します。

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この作品は自然科学基金、中国のによって部分的に支えられた (許可番号 31471703、A0201300537、J.V.、l. l.、31671854 許可番号 31470435 G.Y.)、および 100 外国の才能計画 (合弁会社許可番号 JSB2014012)。

1. サンプル コレクション
<ol><li>新鮮な大根 (ダイコン) の異なる品種を購入します。</li>
</ol>2. 大根から蛋白質の分離
<ol><li>10 分間キッチン ミキサーで新鮮な大根の約 100 g をホモジナイズしてください。</li>
	<li>50 mL の遠心管と不溶性物質を削除する 20 分のための 4 ° C で 14,000 × gで遠心スラリーに転送します。</li>
	<li>新しい 50 mL 遠心チューブに上清を慎重に転送し、2 M トリクロロ酢酸 (TCA) ソリューションの等しい量を追加します。 注: TCA を追加は、水溶性 (糖) タンパク質を沈殿させます。</li>
	<li>4 ° C、30 分で 14,000 × gで遠心分離機、ペレット (糖) 蛋白質から上澄みを取り外します。</li>
	<li>14,000 × g水溶性オリゴ糖や多糖類を削除する 5 分の 4 ° c で 20 ml の脱イオン水と遠心分離機のペレットを洗浄します。</li>
	<li>手順 2.5 を繰り返します。4 回。</li>
	<li>再 1 mL の脱イオン水と新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに転送でペレットを中断します。</li>
</ol>3. N型糖鎖の調製
<ol><li>手順 2.7 からタンパク質溶液のミックス 50 μ L。(新鮮な大根の 5 g に等しい) 組換え PNGase h+ 10 mM 酢酸 0.2 mu。</li>
	<li>12 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。、孵化後余分な蛋白質および酵素を削除する 5 分 14,000 × gで遠心分離機します。</li>
	<li>新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送します。</li>
</ol>4 N型糖鎖の精製
<ol><li>N型糖鎖を豊かにし、 N型糖鎖の蛍光 2 aminobenzamide (2 AB) ラベル エージェントの選択性を増やす反応混合物から塩および他の不純物を削除する固相抽出 (SPE) の列を準備します。誘導体化。<ol>
<li>3 mL の脱イオン水を洗い流すを追加します。</li>
		<li>アクティブにトリフルオロ酢酸 (TFA, 0.1 %v/v) を含む 80% アセトニ トリル溶液 3 mL SPE カラムを追加します。</li>
		<li>SPE コラムを平衡させ脱イオン水 3 mL を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ 3.3 列上からサンプルを転送し、流れを破棄します。</li>
	<li>1.5 mL の脱イオン水コラムを洗浄し、流れを破棄するを追加します。</li>
	<li>1.5 mL の 0.1% を含む 20% アセトニ トリル水溶液を使用して、列からリリースされたN型糖鎖を溶出 TFA (v/v) 2 mL の遠心管に。</li>
	<li>室温で遠心蒸発溶剤を削除します。このサンプルは、完全に乾燥するまでに蒸発させます。</li>
</ol>5 N型糖鎖の蛍光誘導体化
<ol><li>35 mM 2 AB と 0.1 M ナトリウム シアノ水素化ホウ素ジメチル ジメチルスルホキシド/酢酸酸溶液 (7:3 v/v) から成る、2 AB 溶液 1 mL を準備します。</li>
	<li>六つの異なる大根由来の乾燥サンプル (ステップ 4.5.) 2 AB ソリューションの 5 μ L を追加します。渦各サンプルまで完全に分解します。</li>
	<li>65 ° C で 2 h の混合物を孵化させなさい</li>
	<li>5 分間室温までサンプルの涼しい許可し、5 μ L の脱イオン水とアセトニ トリル 40 μ L を追加します。3 分間 14,000 x g でチューブを遠心します。</li>
	<li>300 μ L 高回復高速液体クロマトグラフィー バイアルに上澄みから 48 μ L を転送します。1 ヶ月の-20 ° C で derivatized のN型糖鎖のサンプルを格納します。</li>
</ol>6. 構築高精度のN型糖鎖のプロファイリング
<ol><li>それぞれ 330 nm/420 nm の励起/蛍光波長オンライン蛍光 detectorset に接続されている標準の高精度システムを使用してサンプルを分析します。</li>
	<li>疎水性相互作用クロマトグラフィー (構築) を使用して-分析のための 60 ° C のカラム温度の高精度糖鎖列。</li>
	<li>50 mL の原液 (1 M, ギ酸アンモニウム溶液、pH 4.5) の液体クロマトグラフィー質量分析計 (LCMS) 950 mL で希釈することによって溶剤 A を準備-水のグレードします。とおり、在庫ソリューションを準備します。<ol>
<li>LCMS グレード H2O を 700 mL にギ酸の 43 mL を追加します。</li>
		<li>(奥行 25% アンモニア水を滴下して 4.5 に pH を調整します。</li>
		<li>溶媒をメスシリンダーに転送し、3 ヵ月の LCMS グレード H2o. ストア 4-6 ° c と 1000 mL を入力します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶剤 B として LCMS グレード アセトニ トリルを使用します。</li>
	<li>N型糖鎖を次のグラジエントで区切ります。<ol>
<li>まず 0 から 44.5 分溶媒 A. セット 0.5 mL/min の流量に溶剤 B の 95% を追加します。</li>
		<li>0 分から 6 分、線形のグラデーションの to78% の溶媒 B の割合を徐々 に減少します。</li>
		<li>6 分から 44.5 分、55.9% に線形グラデーションの溶媒 B の割合を徐々 に減少します。</li>
		<li>46.5 分 44.5 分からには、急速に 55.9% から 0% への線形グラデーションで溶剤 B の割合を減らすと 2 分 0% を保持し、列の洗濯を開始します。55 分 44.5 から 0.25 mL/分への流量を減らします。</li>
		<li>50.5 分 48.5 分から 95% に溶剤 B を増やすことによってさらに列を洗って、4.5 分の 95% を保持します。</li>
		<li>再度 0.5 mL/min で 95% 溶剤 B の開始条件にコラムを平衡させ、57 分 50.5 から。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高精度システムに 45 μ L のサンプルを注入します。</li>
	<li>15 と 40 分間保持時間と、高精度での糖鎖を溶出します。</li>
	<li>2 mL 遠心管を使用して各観測の高精度ピーク分数を収集し、遠心蒸発によってサンプルを乾燥します。</li>
	<li>2 AB デキストラン標準 (2−20 グルコース単位) 工場 -N型糖鎖プロファイリング、調整し、標準化されたグルコース単位への溶出時間を割り当てるをラベルの約 1 pmol を注入します。</li>
</ol>7. MALDI-TOF 質量分析
<ol><li>LCMS のステップ 5 で 6.8 μ L のサンプルを溶解-水のグレードします。ミックス 1 μ L の試料溶液及び 1 μ L 6 字-2 thiothymine (ATT) ソリューション (0.3 %w/v 70 %v/v アセトニ トリル水溶液中で)、およびピペット MALDI-TOF サンプル キャリアの上に混合物の。</li>
	<li>[スタート] ボタンを押すことによって肯定的なイオン モードで MALDI-TOF 質量分析計の計測器を使用してサンプルを分析します。</li>
	<li>付属の MALDI TOF MS 解析ソフトウェアを使用して質量スペクトルを分析します。</li>
	<li>オープン ソース糖解釈ソフトウェア19を使用してスペクトルを解釈します。2 AB のラベル、[M+na]+の検索パラメーターを設定し、2.0 da 精度パラメーターを設定します。</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

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我々 はここで提示しているプロトコルは、さまざまな品種の大根のN型糖鎖のプロファイルの比較をできます。既存のプロトコルと比較してこの方法の重要な利点は、 N型糖鎖の酵素的リリースと 2 AB と誘導体化反応のバッファーの変更が必要ないことです。この手順の最も重要なステップは塩を削除する失敗として SPE カラムを用いたN型糖鎖の精製や反応混合物の他の不純物を蛍光誘導体化効率低下可能性があります。ここで示すだけを許可異なるN 型糖鎖の相対的な存在量の評価法絶対定量には、手順 2.1 (maltopentose) など内部標準添加が必要となります。
また、ここで使用される誘導体化剤 (2 AB) は、2-アミノピリジン (2 AP) またはその他の誘導体化剤を使用して簡単に変更できます。ステップ 5.3 から得られたN型糖鎖誘導体はサイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、強いによっても分けることがまたは、弱陰イオン交換クロマトグラフィー (SAX またはワックス) または逆相高速液体クロマトグラ...

植物におけるN型糖鎖が注目増加近年、前の研究がアレルギー反応1,2 を引き起こすかもしれない免疫の内の潜在的なソースとしてN型糖鎖をハイライト表示します。.それが実証されて以前植物糖タンパク質糖鎖のNは、触媒活性3,4、耐熱性と折りたたみ式5,6または細胞レベル下のローカリゼーションに影響を与えることができ、分泌7。糖鎖構造をそれぞれの機能に関連付ける、するためにN型糖鎖最初から解放しなければならない糖タンパク質化学的にまたは酵素によって。N- とO型糖鎖を解放するための古典的な化学方法は β-除去するアルカリ サンプル治療と一緒に伴われる還元糖アルコール8を生成する水素化ホウ素。ただし、この手順は、蛍光でラベルを排除、糖鎖構造の還元末端から単糖類の単位の重要な崩壊を引き起こします。水酸化アンモニウム炭酸塩治療に基づいて化学糖鎖切り出しも一般的に使用される代替方法9です。これらの化学物質の放出方法のどちらも同じ質量範囲にラベルのない糖ペプチド フラグメントの干渉なしプールの質量分析が可能そのまま蛋白質が低下します。ただし、これらのメソッドの 1 つの欠点である α 1, 3 次N型糖鎖の増加の分解速度は共通の炭水化物構造植物10。また、ペプチドを用いた酵素リリース方法:N- 多糖分解酵素 (PNGases、EC 3.5.1.52) も広く適用されています。(病菌 meningosepticum) から組換え PNGase F は最も一般的な選択であり、コア α 1, 3 フコース11,12軸受構造を除いて、 N型糖鎖のすべてのタイプのリリースを許可します。したがって、PNGase A (アーモンドの種子から分離された) は通常植物13 N型糖鎖の解析に使用されます。しかし、この酵素 deglycosylates のみ生由来ペプチド、deglycosylate ネイティブ糖14ことができないと。したがって、詳細な分析、糖、低豊富15の特にそれらの広汎な損失を引き起こす前にマルチ ステップ サンプル精密検査が必要です。メソッドの全体的な目標は、 N型糖鎖のリリースとシンプルで堅牢な方法で蛍光のために最適化されたワークフローを提示することです。基になる根拠は PNGase H+ Terriglobus ニチニチソウの最近発見された recombinantly , 大腸菌で発現することができます、ことができる酸性のタンパク質足場から直接N型糖鎖を加水分解条件16。PNGase H+を使った代替方法の主な利点は、反応バッファー17,18を変更することがなく同じ反応管内の蛍光標識反応が可能です。簡単な調製条件と低豊富なオリゴ糖の高回収率このメソッドは、 N型糖鎖の解析で貴重なツールを作る。このプロトコルは、さまざまな植物の種からN型糖鎖の解析に適しています。

<table><tbody><tr><td><ストロング>ケミカル:</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸&nbsp;</td><td>SCR、上海</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>酢酸氷河</td><td>Huada、広州</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>一般試薬</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>エネルギー化学</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-アミノベンズアミド</td><td>Heowns、天津</td><td>A41900</td><td></td></tr>シア<tr><td>ノ水素化ホウ素ナトリウム</td><td>J&K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Huada、広州</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2ABラベルデキストランラダー、200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-チオチミン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>ツール/材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キッチンブレンダー</td><td>ベア、広州</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>遠心蒸発器</td><td>Hualida、Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPEカラム</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPEカラム</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF質量分析計</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 分析:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高回収HPLCバイアル</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLCシステム</td><td>島津</td><td>製作所 Nexera</td><td></td></tr><tr><td>HPLC用蛍光検出器</td><td>島津</td>製作所 <td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カラムオーブン</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC BEH glycan カラム</td><td>2.1 &times; 150 mm, 1.7 &mu;m 粒径</td></tr><tr><td>LCMS グレード ウォーター</td><td>メルク ミリポア</td> <td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS グレード アセトニトリル</td><td>メルク ミリポア</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>アラジン</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>アンモニア溶液</td><td>アラジン</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

ダイコン品種使用 pngase h+からn型糖鎖の解析

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

近年、植物の糖鎖は、十字反応、アレルギー誘発の免疫応答の潜在的なソースは、かなりの注目を受けた。さらに、炭水化物の構造はまた植物の代謝に重要な役割を果たします。簡便・迅速な準備と、 N型糖鎖大根 (ダイコン) の品種から植物由来の炭水化物構造の解放のためのN- glycanase 固有を使用しての分析法を紹介します。これを達成するには、大根ホモジネートの原油のトリクロロ酸析出された PNGase H+で扱われ、蛍光タグとして 2 aminobenzamide を使用してラベル付け。ラベル付きのN型糖鎖のサンプルを超高性能液体クロマトグラフィー (高精度) 分離して飛行 (MALDI-TOF) 質量分析法による詳細な構造のマトリックス支援レーザー脱離イオン化時間行った後評価と大根由来のN型糖鎖構造の相対的な abundancies を定量化します。このプロトコルは、他の各種の植物の種からN型糖鎖の解析も使用でき、関数のさらなる調査と人間の健康に及ぼすN型糖鎖の役に立つかもしれません。

図 1は、(糖-) 大根、 N型糖鎖の調製、高精度分析とこれらのコンポーネントの MALDI TOF MS 分析からの蛋白質の分離を含む記述のプロトコルの概要を示しています。誘導体N型分析ダイコン品種の糖鎖の代表的な高精度のクロマト グラムを図 2に示します。図 3は、MALDI TOF 質量分析を用いた 2 ab 誘導体のN型糖鎖構造の結果を示しています。図 4は、各大根品種からN型糖鎖の定量的組成を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57979/...

簡便・迅速な準備と大根 (ダイコン) の品種間におけるN型糖鎖の解析法について述べる。

ダイコン品種使用 PNGase H+からN型糖鎖の解析

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

この方法は、植物由来のN型糖鎖を迅速に分析し、特性評価する方法など、植物糖質科学の分野における疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、N型糖鎖の酵素放出と2-アミノベンズアミドによる誘導体化反応との間にバッファーを変更する必要がないことです。手順を実演するのは、ミスYa-Min DuとミスShen-LiZhenです。南京農業大学のグライコミクスおよびグリカンバイオエンジニアリング研究センターの大学院生2名。タンパク質の単離を開始するには、キッチンブレンダーを使用して、約100グラムの新鮮な大根を10分間均質化します。得られたスラリーを50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。不溶性物質を除去するために、摂氏4度の重力の14、000倍で20分間遠心分離します。この後、上清を新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに慎重に移します。等量の2モルトリクロロ酢酸溶液を追加します。重力の14, 000倍、摂氏4度で30分間遠心分離します。そして、上澄み物を取り除きます。ペレットを20ミリリットルの脱イオン水で洗います。再び重力14,000倍、摂氏4度で5分間遠心分離し、可溶性オリゴ糖と多糖類を除去します。次に、ペレットを1ミリリットルの脱イオン水で再懸濁します。そして、タンパク質溶液を新鮮な1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。N型糖鎖の調製を開始するには、50 μリットルのタンパク質溶液を0.2 munitの組換えPNGase H+in 10ミリモル酢酸と混合します。摂氏37度で12時間インキュベートします。次に、重力の 14 、 000 倍で 5 分間遠心分離し、余分なタンパク質と酵素を除去します。上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに移し、N 型糖鎖を精製する準備ができるまで待ちます。N型糖鎖の精製を開始するには、固相抽出カラムを3ミリリットルの水で洗浄します。トリフルオロ酢酸を含む80%アセトニトリル溶液を3ミリリットル加えてカラムを活性化します。次に、3ミリリットルの脱イオン水を使用してカラムを平衡化します。サンプルをカラムに移し、流動を廃棄します。1.5ミリリットルの脱イオン水を加えてカラムを洗浄します。サンプル混合物中の塩類の除去や不純物の添加を怠ると、蛍光誘導体化反応の効率に悪影響を及ぼす可能性があります。次に、0.1% TFA を含む 20% アセトニトリル水溶液 1.5 mL を加えて、N 型糖鎖を 2 mL チューブに溶出します。室温で遠心蒸発させて溶媒を除去し、サンプルが完全に乾くまで蒸発させます。N-グリカンの蛍光誘導体化を開始するには、テキストプロトコールに記載されているように2-AB溶液を調製します。調製した2-AB溶液の5マイクロリットルを乾燥サンプルに加えます。各サンプルが完全に溶解するまでボルテックスします。摂氏65度で2時間インキュベートします。この後、サンプルを室温まで5分間冷まします。冷却したサンプルに5マイクロリットルの脱イオン水と40マイクロリットルのアセトニトリルを加えます。重力の 14 、 000 倍で 3 分間遠心分離します。次に、得られた上清48マイクロリットルを300マイクロリットルの高回収HPLCバイアルに移します。マイナス20°Cで最大1か月間、または使用する準備ができたときに保管してください。プロファイリングを開始するには、疎水性相互作用液体クロマトグラフィーUPLC糖鎖カラムを備えた標準的なUPLCシステムを使用し、それをオンライン蛍光検出器に接続してサンプルを分析します。励起波長と発光波長をそれぞれ330ナノメートルと420ナノメートルに設定します。カラムの温度を摂氏60度に設定します。次に、45 マイクロリットルのサンプルを UPLC システムに注入します。15 分および 40 分の保持時間を使用して、UPLC によって N 型糖鎖を溶出します。2ミリリットルの遠心分離チューブを使用して、観察された各UPLCピーク画分を収集します。次に、遠心蒸発を使用してサンプルを乾燥させます。2-AB標識デキストラン標準試料のピコモルを約1個注入して、植物のN型糖鎖プロファイリングを較正し、それらの溶出時間を割り当て、グルコース単位を標準化します。MALDI-TOF分析を開始するには、乾燥したサンプルを5マイクロリットルのLCMSグレードの水に溶解します。この溶液1マイクロリットルをATT溶液1マイクロリットルと混合します。次に、この混合物をMALDI-TOFサンプルキャリアにピペットで移します。その後、MALDI-TOF質量分析計装置を使用して、テキストプロトコルに概説されているようにサンプルを分析します。この研究では、大根のさまざまな品種からN型糖鎖プロファイルを比較します。代表的な UPLC クロマトグラムは、誘導体化された N 型糖鎖と、各大根および異なる大根の相対存在量をこのプロセスを通じて良好に分析できることを示しています。その後、MALDI-TOF質量分析法を用いて、2-AB誘導体化N型糖鎖の構造を解析します。この方法は、さまざまなRaphanus sativus品種のN型糖鎖の組成に関する洞察を得ることができますが、ピーナッツや他のアレルギー性植物種などの他のシステムにも適用できます。習得すると、UPLC分析手順を含む2営業日以内にサンプルを調製できます。この手順を試みる際には、N型糖鎖の単離に使用される固相抽出カラムが、サンプルアプリケーションの前に蒸留水で十分に湿らされていることを覚えておくことが重要です。そうしないと、N型糖鎖のカラムへの結合が妨げられる可能性があります。N型糖鎖の構造をさらに検証するために、他の方法も使用できます。これは、例えば、逐次エキソグリコシダーゼ処理やMALDI-TOF MS N ベースのフラグメンテーション技術などです。この技術は、その開発後、糖質科学の分野の研究者が植物のN型糖鎖の組成と機能をより迅速に探求する道を開きました。このビデオをご覧いただければ、PNGase H+を使用してさまざまな品種の大根からN型糖鎖を調製する方法と、UPLCによる2-アミノベンズアミド誘導体の分析方法について十分に理解できるはずです。トリフルオロ酢酸とトリクロロ酢酸の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

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Biochemistry

生物化学

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ダイコン品種使用 PNGase H⁺からN型糖鎖の解析

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