Name: 酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶ酵母における4-チオウラシルラベリングを用いた新規合成mRNAの定量化法。RNAポリメラーゼII活性を正確に測定し、転写動態と遺伝子発現制御の理解を深めるための実験手法です。

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彼のサポートのためのラズロ寅と V. フィッシャー、k. シューマッハと f. エル Saafin 議論のために感謝しますマリー キュリー ITN フェローシップ (PITN-ジョージア州-2013-606806、NR ネット) に支えられ闘病を続けてと財団アーク。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) からの資金によって支えられました。本研究は、ANR-10-LABX-0030-INRT、フレーム プログラム Investissements d'Avenir ANR-10-アイデックス-0002-02 下のアジャンス ナシオナル デ ラ抜きの運営するフランス国家ファンドによっても支えられました。

1. 細胞培養と佐賀のサブユニットのラパマイシン枯渇
<ol><li>各酵母ひずみと複製は、野生型を含むまたは制御系統は ypd 培地 (2% ペプトン、1% 酵母エキス、グルコース 2%) 5 mL に新鮮なプレートから単一コロニーを接種します。</li>
	<li>定数撹拌 (150 rpm) 30 ° C で一晩出芽酵母細胞を成長します。</li>
	<li>600 の光学濃度を測定 nm (外径600) ypd 培地約 0.1 で 100 mL の OD600文化を希薄化し、OD600が約 0.8 まで育てましょう。</li>
	<li>並行して、50 mL [はい] 媒体の上に新鮮なプレートから, 分裂酵母細胞の単一コロニーを接種する (0.5% 酵母エキス; 250 mg/L アデニン、ヒスチジン、ウラシル、ロイシン、リジン; 3% グルコース) と定数撹拌 (150 32 ° C で一晩細胞を成長rpm)。</li>
	<li>S.pombe一晩文化の外径600を測定し、[はい] 媒体の約 0.1 で 500 mL の OD600文化を希釈、外径600は約まで育てましょう 0.8。</li>
	<li>それぞれの酵母アンカー距離歪みおよび複製、制御系統、または野生型を含む ypd 培地 (2% ペプトン、1% 酵母エキス、グルコース 2%) 5 mL に新鮮なプレートから単一コロニーを接種します。</li>
	<li>セル定数撹拌 (150 rpm) 30 ° C で一晩を育てなさい。</li>
	<li>次の朝、外径600を測定、ypd 培地約 0.1 で 100 mL の OD600文化を希釈し、OD600≈ 0.8 まで育てましょう。</li>
	<li>1 mg/mL (1 μ g/mL の濃度最終ラパマイシン) の原液から文化に rapamycin の 100 μ L を追加し、30 ° C 核 (から条件付きで枯渇する興味の蛋白質のために必要な時間の定数撹拌インキュベート細胞通常、30 分は十分) です。コントロールのようなイースト文化を使用、ラパマイシンを追加するには、代わりにジメチルスルホキシド (DMSO) の同等のボリュームを追加します。</li>
</ol>2. 4tU としてスパイク (カウント) s.pombeのラベリング
<ol><li>
2 M 4-チオウラシルの新鮮なソリューションを準備します。準備が整うと、部屋の温度、光から離れてそれを保ちます。
	<ol>
<li>正確に出芽酵母カルチャごとに 4 チオウラシル 64.1 mg の重量を量る、ジメチルホルムアミド (DMF) の 250 μ L または DMSO の 250 μ L に溶解します。</li>
		<li>スパイクとして使用するs.pombe文化 4-チオウラシル 320.5 mg の重量を量るし、DMSO の 1,250 μ L に溶解します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最終濃度 5 mM の出芽酵母 s.pombe文化 4-チオウラシル ソリューションを追加し、それぞれ 30 ° C、32 ° C で一定の攪拌と 6 分のためそれらを孵化させなさい。</li>
	<li>6 分後に、各文化のセルをカウントするための小さい因数を削除します。セルの自動カウンターまたはノイバウアー チャンバーを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間遠心分離 (2,500 x g) からのセルを収集します。</li>
	<li>(2,500 x g、4 ° C、5 分) 冷たい 1 × PBS と遠心分離機を再び細胞を洗い、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>出芽酵母と分裂酵母米のサンプルのそれぞれのセルの合計数を計算します。</li>
	<li>5 mL の冷たい 1x PBS で細胞を再懸濁し、酵母を混ぜて, 分裂酵母細胞比率は 3:1。</li>
	<li>遠心分離機の細胞 ( g、4 ° C、5 分 x 2,500)、PBS、フラッシュ凍結細胞を液体 N2、取り出して保管-80 ° c サンプルまでさらに使用します。</li>
</ol>3. RNA の抽出と DNase 処理
<ol><li>約 20-30 分間氷の上細胞を解凍します。</li>
	<li>酵母 RNA 抽出キット (材料表) を使用して、いくつかの適応を持つ RNA の抽出を続行します。</li>
	<li>各サンプルごとには、キット付属 1.5 mL スクリュー キャップ チューブに冷たいジルコニア ビーズ 750 μ L を注ぐ。各チューブあたり最大 109細胞からの RNA が効率的に抽出する注意してください。したがって、チューブ各サンプルに必要な数を準備します。たとえば、100 mL (外径600≈ 0.8) の酵母培養は約 2 × 109 3 x 10 の9セル、2.7 x 10 の合計に至るまでをレンダリングできます (後米酵母の 3 分の 1 でスパイク合計で 4 x 10 の9セルに9細胞)。この場合、各サンプル/条件/変異/複製あたり 3-4 反応チューブにアップが必要になります。</li>
	<li>各 1 x 10 の9セルあたりキットに付属の換散バッファーの 480 μ L、10 %sds の 48 μ L とフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1, v/v/v) 480 μ L を追加します。</li>
	<li>渦のミキサーを使用してセルをミックスし、冷たいジルコニア ビーズを含むチューブに転送。</li>
	<li>ボルテックス ミキサー アダプター チューブに対応し、最大速度で渦を有効に 10 分 (4 ° c の部屋) で酵母を溶解するために打ちます。また、自動ビード ・ ビーターで細胞の換散を実行します。</li>
	<li>室温で 5 分間 16,000 x gでチューブを遠心し、慎重に上部の段階 (RNA 含有相) を収集し、15 mL の新鮮なファルコン チューブに。通常、各管ごとリカバリ ボリューム周りは 500-600 μ L。</li>
	<li>部分的に浄化された RNA を含む 15 mL チューブ、キットとミックス徹底的に提供される結合バッファーを追加します。それぞれ 100 μ L の RNA 溶液、1 結合バッファーの 350 μ L を追加 (すなわち、水溶液相解量が 600 μ L、2.1 mL の結合バッファーする必要があります追加する)。</li>
	<li>前の混合物に 100% エタノールを加えて混和します。それぞれ 100 μ L の RNA 溶液、あたり 100% エタノールの 235 μ L を追加 (すなわち、水溶液相解量が 600 μ L、エタノールの 1.41 mL を追加)。</li>
	<li>最大 700 μ L フィルター カートリッジに 3.9 のステップからの混合物のコレクション チューブで組み立てキットに付属の両方を適用します。</li>
	<li>16,000 x gで 1 分間遠心します。遠心時間総量はフィルターを通過するための十分ではなかった、もし 30 の遠心分離を繰り返す s。</li>
	<li>流れを破棄し、同じコレクションの管を再利用します。フィルターと 16,000 x gで再び 1 分間遠心する RNA 結合バッファー エタノール溶液のもう一つの 700 μ L を追加します。</li>
	<li>流れを破棄し、RNA ソリューションが完了するまで 3.11 と 3.12 の手順を繰り返します。</li>
	<li>2 フィルターを洗う洗浄ソリューション 1 700 μ L と x。1 分 16,000 × gで遠心分離を介して洗浄ソリューションを収集し、常にコレクションの管。</li>
	<li>2 フィルターを洗う洗浄ソリューション 2 500 μ L と x。1 分 16,000 × gで遠心分離を介して洗浄ソリューションを収集し、常にコレクションの管。</li>
	<li>16,000 x gフィルターを完全に乾燥する 1 分でもう一度チューブを遠心します。</li>
	<li>最終的なコレクション チューブ (RNA に適したチューブ) にフィルター カートリッジを転送し、50 μ L の DEPC 処理、RNase フリーの H2O (100 ° C に予熱) で RNA を溶出します。</li>
	<li>16,000 x gで 1 分間遠心します。</li>
	<li>予熱した DEPC 処理 RNase フリー H2O を確認すべてのボリュームが、フィルターを通過したことの 50 μ L で再び (同じチューブ) に RNA を溶出します。それ以外の場合、長い期間の遠心分離機します。</li>
	<li>1 つの検体を複数のチューブを使用している場合は、すべて 1 つの管のプールします。</li>
	<li>定量化し、適切な機器を使用してサンプルの純度を確認してください。 注: 4tU は新たに合成された RNA 内に組み込まれただけ、間マイナーな DNA の混入の可能性があります。そのため、サンプルは DNase を治療することをお勧めそれは常に私。そのため、試薬製造元の推奨事項に従う RNA 抽出キット (材料表) に付属を使用します。</li>
</ol>4 新たに合成された RNA のチオール固有ビオチン化
<ol><li>2 mg/mL にプロトコルのセクション 3 で得られた RNA 濃度を調整します。総 RNA の 200 μ g 因数は 60 ° C で 10 分間加熱し、2 分間氷の上それをすぐに冷やします。</li>
	<li>
RNA 因数を次の順序で下記試薬を追加: DEPC 処理、RNase フリー H2O、100 μ L (100 mM トリス-HCl 【 ペーハー 7.5 と 10 mM EDTA、DEPC 処理、RNase フリー H2O) ビオチン化バッファーの 600 μ L、200 μ L1 mg/mL ビオチン-HPDP DMSO の DMF のストックからビオチン HPDP。
	<ol>
<li>いくつかの状況でビオチン HPDP ソリューションは、可能性が高い水に難溶のため、沈殿する傾向があります。このような状況では、DMSO/DMF の音量を上げる反応量の 40% まで (RNA サンプルを 400 μ L の DEPC 処理 H2O、ビオチン化バッファーの 100 μ L とビオチン HPDP の 400 μ L から追加 0.5 mg/mL 在庫)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温でサンプルをインキュベートし、穏やかな動揺と、3 h の光から保護します。</li>
	<li>インキュベーション後、チューブにクロロホルムのほぼ等しい量を追加し、精力的にミックスします。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 13,000 x gでサンプルをスピンします。この手順は、ない biotinylate RNA をしなかった余分なビオチンを削除できます。また、位相ロック チューブ (重い) を使用してこの手順を実行します。そのため、13,000 × gで 1 分の位相ロック チューブ スピンダウン、積極的にそれらをミックスし、4 ° C で 5 分間 13,000 × gで遠心分離機に RNA の混合物、クロロホルムの等しい量を追加</li>
	<li>慎重に上部の段階を新しい 2 mL チューブに転送します。</li>
	<li>5 M の NaCl の量の 10 分の 1 を追加し、サンプルを混ぜます。</li>
	<li>イソプロパノールの等しい量を追加、サンプルを混和、4 ° C で少なくとも 30 分、13,000 x gでスピン</li>
	<li>慎重に上澄みを除去し、冷えた 75% エタノール 1 mL を加えます。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間 13,000 x gでスピンします。</li>
	<li>慎重に上清、クイック スピン チューブを外し、残りのエタノール溶液。RNA の餌が乾燥しないことを確認します。</li>
	<li>DEPC 処理、RNase フリー H2o. の 100 μ L の RNA を中断します。</li>
</ol>5. 新生画分ストレプトアビジン コートした磁気ビーズを使用して合計とラベルの RNA の浄化
<ol><li>65 ° C で 10 分間のビオチン標識 RNA を加熱し、5 分間氷の上のサンプルでリラックスします。</li>
	<li>(200 μ L の最終巻) にビオチン標識 RNA にストレプトアビジン コートした磁気ビーズの 100 μ L を追加します。具体的より一貫性のある、信頼性の高いにこれらに見えた他の研究所との会話後以来、材料表に示されているビーズを使用することをお勧めします。</li>
	<li>90 分間、室温のわずかな揺れでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>マグネット スタンドでキットレンズ (材料表) 提供される列を配置します。</li>
	<li>常温洗浄バッファーの 900 μ L を追加 (100 mM トリス-HCl 【 ペーハー 7.5、10 ミリメートルの EDTA、1 M NaCl と 0.1% Tween 20 DEPC 処理、RNase フリー H2O) (事前実行および平衡) の列に。</li>
	<li>ビーズ/RNA の混合物 (200 μ L) を列に適用されます。</li>
	<li>1.5 mL チューブの流れを収集し、同じ磁気列に再び適用すること。必要に応じて、ラベルの RNA の一部分を表すのでこの流れを維持します。</li>
	<li>5 列を洗う洗浄液の増加に伴い x (600、700、800、900、および 1,000 μ L)。</li>
	<li>0.1 M の DTT の 200 μ L で新たに合成された RNA を溶出します。</li>
	<li>0.1 M の DTT の等量を第 2 溶出、3 分後を実行します。</li>
	<li>RNA を溶出後 0.1 量 3 M NaOAc (pH が 5.2)、冷えた 100% エタノールの 3 つの容積および 20 mg/mL グリコーゲン (RNA グレード) の 2 μ L を追加し、-20 ° C で、RNA の沈殿物一晩</li>
	<li>遠心分離 (13,000 x gで 4 ° C, 10 分間) によって RNA を回復し、15 μ L の DEPC 処理、RNase フリーの H20 でそれを再懸濁します。ラベル ・総 RNA の割合は約 2%-4% (通常以上最下部)、新たに合成された RNA の約 2.0 μ g をレンダリングをする予定です。この量は、マイクロ アレイ/シーケンス解析だけでなく、いくつかの qPCR 実験を行うのに十分です。</li>
</ol>6. RT qPCR の異なる画分の検証
<ol><li>製造元の指示 (材料表) に従って総 RNA の 2 μ g またはランダムな hexamers と選択、逆転写酵素を使用してラベル付けされた RNA の 10 μ L から cDNA を合成します。</li>
	<li>標準的なプロトコル (資材表) を使用してリアルタイムの qPCR による cDNA を増幅します。 注: すべてのサンプルは、2 つの生物学的複製の最小値から 3 通実行する必要があります。S.pombeチューブリンの式のすべての raw 値を修正します。</li>
</ol>7. マイクロ アレイの交配
<ol><li>製造元の指示に従って最寄りのマイクロ アレイ チップに RNA サンプルを交配させなさい (この特定のプロトコルでは、材料の表を参照してください)。簡潔の準備ビオチン標識 cRNA 目標 150 から製造元の指示に従ってプレミアの RNA 増幅キット (資材表) を利用した RNA の ng。16 h 45 ° c およびマイクロ アレイ チップ 60 rpm の断片化の cRNAs の 4 mg を交配させます。</li>
	<li>洗浄、染色、および指定された駅と (材料表) のスキャナーを使用してチップをスキャンします。コマンド コンソール (AGCC、バージョン 4.1.2) を使用してスキャンした画像から生データ (セル強度ファイル) を抽出します。</li>
	<li>式コンソールのソフトウェア バージョン 1.4.1 プローブ セット地球スケールの正規化方法として既定の設定と統計情報を用いたアルゴリズム MAS 5.0 を使用して信号強度を計算すると CEL ファイルをさらに処理します。 注: 各チップのトリム平均ターゲット強さは任意に 100 に設定。少なくとも 2 つの独立した生物学的複製を使用してすべての実験を実行します。S.pombe信号に raw データを正規化し、合計と新たに合成された RNA レベルでのフォールドの変更を計算します。</li>
</ol>8 既存の R パイプラインを用いた解析
<ol><li>合成を計算し、崩壊率前述8,10としてパイプラインと R/Bioconductor パッケージの公開を使用してください。</li>
</ol>

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ゲノムワイドな転写の変化を解析するツールまだ改善している間唯一 RNA の定常状態レベルの定量化によるトランスクリプトーム解析では RNA ポリメラーゼ II の活性の変更は正確に反映可能性があります。確かに、mrna は RNA 合成だけでなく、成熟し、劣化も規制されています。MRNA 分解から非 mRNA 合成を測定するには、明確なプロトコルは、酵母や哺乳類の初期転写の解析のため近年開発されています。
新生転写の定量化のための最も広く使用されているプロトコルの 1 つはグロ seq1です。GRO seq の主な利点は、能力を高解像度で低バック グラウンド発現従事とアクティブなポリメラーゼを発表、その魅力を減らす 2 つの異なる点があります: (i) それは技術的に難しく、必要です、核と、(ii) 核操作の分離は、28のシステムにいくつかの摂動をご紹介します。別の方法としてはネット-seq、初期の RNA、テンプレート DNA と RNA ポリメラーゼ II の間に形成された非常に安定...

セルは、内因性と外因性手がかり、その遺伝子発現プログラムの動的変化に対応します。近年、ゲノム手法の途方もない開発は、さまざまな条件でトランスクリプトーム変更に関する正確な包括的な記述をことができます。ほとんどのトランスクリプトーム研究でマイクロ アレイ交配または高スループット シーケンスは合計定常 RNA 画分からの RNA レベルの定量化に使用されます。転写の変更特定の摂動の下では、特定の遺伝子の表現の変更やアップまたはダウンレギュ レート遺伝子の大きいスペクトルの可能な結果の広い範囲を表示できます。遺伝子発現調整の平衡の結果である- または定常状態-RNA ポリメラーゼが RNA 合成と RNA のレベルに影響を与える他のプロセスの間。Rna ポリメラーゼ II の転写は高度および複雑な mRNA や劣化、翻訳、細胞質のエクスポート処理に関連付けられているが (開始、延長および終了) の 3 つの段階を含みます。
いくつかの最近の研究は Mrna 合成と崩壊結合メカニズムが、とき定常状態の総 RNA 転写効果突然変異または刺激を見落とすことができる示した。まず、常に mRNA の定常状態レベルの分析を通して転写変化の検出は、Mrna の半減期に依存します。摂動を導入すると、短い半減期を持つ Mrna のそれらより長い半減期を持つ Mrna の定常状態レベルにはるかに少ない影響します。したがって、RNA 合成の変化の検出能転写率のダイナミックな変化を明らかにする長寿命の mRNA 種の解析が失敗する中短時間の成績証明書を支持してバイアス強くされています。第二に、いくつかのレポートは、酵母や哺乳類の両方で、転写でグローバルな変更は見落されるかもしれない mRNA の定常状態レベルを解析するとき示されています。これは mRNA 合成と分解の mRNA のバッファリングの結果をリンク機構による可能性が高いです。これは新たに転写された mRNA の解析による劣化から非 mRNA 合成を定量化する新しいプロトコルの開発を促した。近年、グローバル実行シーケンス (GRO seq)1、配列 (NET seq)2,3ネイティブ伸長トラン スクリプトなど、いくつかの選択肢が提示されています。ここで、当初哺乳類セル4,5,6で開発され、酵母7,8,9,10に適応し、プロトコルを紹介して 11, RNA のチオール ヌクレオシドまたは基本アナログで分類に基づく 4-thiouridine (4sU) または 4-チオウラシル (4tU)、それぞれ。
このメソッド具体的には浄化する RNA の細胞から新しく転写 RNA が細胞の恒常性の干渉のほとんどない、4sU 付けパルス。したがって、セルは、4sU にさらされれば、一度、分子は急速に有った、4sU 三リン酸にリン酸化し、転写される Rna に組み込まれているです。(RNA の定常状態レベルに対応する)、総細胞 RNA を抽出することが可能だし、その後、4sU 標識 RNA の一部分はチオール具体的に、パルス標識を変更した後、ビオチン間のジスルフィド結合の形成につながると新しく転写 RNA4,5。ただし、4sU は人間の平衡ヌクレオシド輸送体 (hENT1)、出芽か分裂酵母で、すぐに使用を防止するよう、ヌクレオシド輸送体の発現している細胞によって取り込まれたをできるだけです。酵母は、ヌクレオシドの運送者10,の式を必要とせず、4tU を取ることができるので変更された基本 4tU を使用してより簡単なアプローチを実現できますs.pombeの出芽酵母hENT1 で表現できる 1 つ間11,12,13。 実際には、4tU の代謝は酵素ウラシル phosphoribosyltransferase (UPRT) の活動を必要とします。酵母がない哺乳類を含むいくつかの生物では、UPRT はウリジル酸にウラシルをリサイクル ピリミジンの海難救助の細道に不可欠です。
並行分析の異なるサンプル間の正規化でトランスクリプトーム研究に重要なバイアスを導入できます。確かに、多くの逸脱要因を及ぼします変異体と野生型株のトランスクリプトームの比較分析: セル換散の効率の抽出と RNA およびマイクロ アレイ解析用スキャナーの調整で差異の回復の違い、他の中で。前述したように、RNA ポリメラーゼ II の転写で世界的な効果が期待されるときそのような変化は特に誤解を招くできます。異なるサンプル間の mRNA 合成率を正確に比較するエレガントな意味は、内部標準として遠縁分裂酵母分裂酵母を使用してによって設計されました。そのため一定数のラベル, 分裂酵母出芽酵母のサンプルは、野生型や突然変異細胞、セル換散および RNA 抽出10前にセルが追加されます。その後、 , 分裂酵母と酵母から定常状態と新たに合成された Rna は RT qPCR または経由でマイクロ アレイ チップまたは高スループット シーケンス10の使用によって明らかにした.速度論的モデリングとこれらのデータを組み合わせて、mRNA 合成と出芽酵母における崩壊の絶対速度を測定できます。
この原稿のフレームワークでどの新たに転写された RNA の解析は新進の RNA ポリメラーゼ II の転写のコアクチベーター複合体佐賀と (ディスインテグリン) 酵母14,15のためにグローバル ロールを明らかにするため許可されて表示されます。 16。重要なは、過去の研究は出芽酵母の定常状態の mRNA のレベルを定量化し、佐賀が佐賀で突然変異によって強く影響を受けるが (ディスインテグリン) に比較的耐性酵母遺伝子の限定セットに支配的な機能を果たしていることが示唆されました。突然変異17,18,19。驚いたことに、佐賀酵素は RNA ポリメラーゼ II の転写でこの co 活性剤のより広範な役割を示唆して、全く転写ゲノムに関する法律に示されていた。減少で最も発現遺伝子の RNA ポリメラーゼ II 新卒を募集していた佐賀またはこれらし、コアクチベーターがほとんど遺伝子で一緒に仕事することを示唆している (ディスインテグリン) の不活化に.したがって、新たに転写された mRNA の定量化は、佐賀と (ディスインテグリン) が RNA ポリメラーゼ II14,15,16でほぼすべての遺伝子の転写に必要なことを明らかにしました。代償機構の実装は、細胞 mRNA 分解同時グローバル減少によってバッファリングは mRNA 合成の世界的な減少に対処するための方法として現れます。転写因子 tfiih が不安定21,22 一般、調停コアクチベーター複合20RNA ポリメラーゼ II の転写、RNA Pol II サブユニット10など全体に影響を及ぼす因子のリストに追加します佐賀と間接的に、mRNA 分解機械9,10,23の要素。そのような代償的なイベントは佐賀変異体の mRNA 合成14のグローバルかつ深刻な減少にもかかわらず定常状態の mRNA のレベルのささやかな、限られた変更を会計で普遍的に観察されました。同様の分析は、ヒストン H2B のユビキチン化の完全な損失の結果BRE1の削除のひずみで行われました。酵母の新規転写された RNA の代謝ラベリングすることができます検出し、mRNA の変化の広い範囲を定量化することを示す、Bre1 の不在で、穏やかな、一貫したグローバルに大きな影響 RNA ポリメラーゼ II の転写を検出できる興味深いことに、合成料金です。

<table><tbody><tr><td>4-チオウラシル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automated Cell Counter</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure RNA Purification kit, yeast</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度計</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNAフリーキット</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Thiolutin</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro;MACS ストレプトアビジンキット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>トランスクリプト 逆転写酵素</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 酵母 ゲノム 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChipスキャナー3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mrna rna ポリメラーゼ ii の活性のためのプロキシとして

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

RNA ポリメラーゼ II の転写で世界的な欠陥は、トランスクリプトーム研究は、定常状態の RNA を分析によって見落されるかもしれない。確かに、mRNA 合成の世界的な減少は通常定常状態レベルを復元する mRNA 分解の同時減少で補償されるように示されています。したがって、mrna から独立して、mRNA が合成のゲノムワイドな定量化は RNA ポリメラーゼ II の転写活性の最高の直接の反射です。ここでは、酵母(出芽酵母) における初期の rna 代謝ラベリングの非摂動法について述べる。具体的には、ウラシル、アナログ 4-チオウラシルと 6 分のため培養されるセルとラベル新しく転写された Rna の精製しすべての個々 の mRNA の合成レートを決定する定量化します。さらに、内部標準により異なる酵母mRNA 合成の比較として分裂酵母細胞のラベルを使用して系統。このプロトコルを使用して、継ぎ手の動的な運動モデルとデータは、対応する mRNA の腐食率を決定できます。

制御する必要があるいくつかの側面、新たに転写された RNA の代謝ラベル付けを実行するとき: 時間とラベリング、スパイクの割合、抽出のプロトコル、ビオチン化効果 (含む信号対雑音比) の効率他の中。これらの条件広範囲、組織的が示されている他の人が7,10,11。ここで我々 は主に解釈とサンプルが処理されて、RT qPCR、マイクロ アレイ、またはシーケンスで実行できる即時解析に焦点を当てます。別の変異株の解析が佐賀変異酵母の場合、mRNA 合成だけでなく劇的な世界的な減少を検出するメソッドの力を発揮株だけでなく、非常に穏やかな時に RNA ポリメラーゼ II の活性化monoubiquitination ヒストン H2B の抑制。
佐賀酵素活性の分析...

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II のトランスクリプションの正確な測定を提供します。

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

この技術の主な利点は、RNA分解の影響を受けていない新たに合成されたmRNAを測定することによってRNAポリメラーゼII活性を反映していることである。このプロトコルは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを用いて記述されたが、新たに転写されたmRNAのハイ・エアー・シーケンシングに容易に採用することができる。この手順を実証することは、私たちの研究室の元大学院生ティアゴ・バティスタです。S.cerevisiae細胞を接種した後、150 RPMで一定の攪拌で摂氏30度で一晩成長させる。翌日、600ナノメートルで光学密度を測定する。培養液を約0.1のOD600に100ミリリットルのYPD培地で希釈する。OD600が約0.8になるまで細胞を成長させます。この後、S.pombeの一晩培養物のOD600を測定する。この培養液を約0.1のOD600に希釈し、500ミリリットルのYAS培地で、OD600が約0.8になるまで成長させます。まず、2つのモル4チオウラシルの新鮮な溶液を調製する。調製した溶液を室温に保ち、光から保護します。4チオウラシル溶液をS.cerevisiaeおよびS.pombe培養物に加え、最終的な濃度が5ミリモルになるようにします。摂氏30度と摂氏32度でS.cerevisiaeとS.pombeの文化を6分間一定の攪拌でインキュベートします。この後、各培養物の小さなアリコートを取り除き、自動細胞カウンターまたはノイバウアーチャンバーのいずれかを使用して細胞を数えます。遠心分離機を2、500倍g、摂氏4度で5分間細胞を採取する。上清を捨て、氷冷で細胞を1回PBSで洗います。2、500倍g、摂氏4度で5分間再び遠心分離機。次に、5ミリリットルの氷冷中の細胞をPBSを1回再懸濁する。S.cerevisiaeとS.pombe細胞を3対1の比率で混ぜます。混合サンプルを2、500倍g、摂氏4度で5分間遠心分離する。その後、PBSを取り除き、液体窒素中の細胞をフラッシュ凍結します。使用できる状態になるまで、サンプルをマイナス80°Cで保存します。進行する準備ができたら、約20〜30分間氷上の細胞を解凍します。テキストプロトコルで概説されているようにRNAを抽出するために適応された酵母RNA抽出キットを使用してください。その後、フィルターカートリッジを最終回収管に移します。100°Cに予熱されたDEPC処理RNaseフリー水の50マイクロリットルでRNAをエルプ。遠心分離機は16,000回gで1分間行う。その後、50マイクロリットルの予熱DEPC処理RNaseフリー水を使用して、RNAを同じチューブに再び溶出させます。16,000回gの遠心分離機で1分間、サンプルボリューム全体がフィルタを通過したことを確認します。それがない場合は、遠心分離機を再び長い期間待たします。完了したら、適切な装置を使用してサンプルの純度を定量化し、確認します。DEPC処理ヌクレアーゼフリー水を使用して、以前に獲得したRNAの濃度を1ミリリットル当たり2ミリグラムに調整します。アリコート200マイクログラムの全RNAを摂氏60度で10分間加熱します。すぐに氷の上で2分間冷やします。600マイクロリットルのDEPC処理RNaseフリー水を加えます。100マイクロリットルのビオチン化バッファーを加え、200マイクロリットルのビオチンHPDPを加えます。バイオチン HPDP 溶液が溶液から沈殿する場合は、テキスト プロトコルで概説されているように、DMSO または DMF の量を最大 40% の反応量まで増やします。光からサンプルを保護し、3時間穏やかな攪拌で室温でインキュベートします。この後、ほぼ等量のクロロホルムをチューブに加え、激しく混ぜます。13,000倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。次に、上相を新しい2ミリリットルチューブに慎重に移します。サンプル量の約1/10に等しい5モル塩化ナトリウムの量を加えます。その後、サンプルを混ぜます。まず、ビオチン化したRNAを摂氏65度で10分間加熱します。その後、氷の上でサンプルを5分間冷やします。ビオチン化されたRNAにストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを100マイクロリットル加えます。90分間わずかな揺れで室温でインキュベートします。キットに付属の柱を磁気スタンドに置きます。次に、900マイクロリットルの室温洗浄バッファーをカラムに加えます。200マイクロリットルビーズとRNA混合物をカラムに塗布します。1.5ミリリットルのチューブでフロースルーを収集し、同じ磁気カラムに再度適用します。ラベルなし RNA の端数を表すため、必要に応じてこのフロースルーを保持します。異なる分数のRT-qPCR検証を開始するには、まずテキストに概説されているようにcDNAを合成します。次に、標準プロトコルを使用してリアルタイムqPCRでcDNAを増幅します。4チオウラシルの有無にかかわらず培養した野生型細胞から精製された分画中の転写物の測定レベルは、この手順が特異的に標識RNAを精製したことを確認した。spt20デルタ株の分析は、全定常RNAの量がほとんど変わらないか、または試験された遺伝子に対して軽度にしか減少しないことが明らかである。bre1 で削除された株に対しても同様の結果が見られます。しかし、spt20デルタ株における新たに転写されたRNAの分析は、すべての試験された遺伝子に対するmRNA合成の3〜5倍の減少を明らかにする。一方、bre1の損失は、より控えめですが、まだ目に見える減少につながります。spt7の誘導可能な枯渇に際して、サガ複合体の構造サブユニットは、新たに転写されたmRNAレベルが、欠失株と同様の程度に減少する。全RNAレベルをゲノム全体解析で測定すると、spt20の欠失時に、調節または下方調節のいずれかによって発現レベルが変化すると見られる遺伝子はわずかです。しかし、新たに転写されたRNAの分析は、4,000以上の遺伝子のレベルがspt20の欠失時に有意に2倍有意に減少することを明らかにし、芽出芽酵母におけるRNAポリメラーゼII転写に対するサガの世界的なプラス効果を示唆している。この方法はサッカロミセス・セレビシエの転写に関する洞察を提供することができるが、このプロトコルを用いてわずかなばらつきでしか適用されなかったが、mRNA分解の世界的な減少によって補償されたmRNA合成の世界的な減少を検出することができた。

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

全細胞RNAは、短期的RNA合成と崩壊の変化と同様に、RNAプロセシングの動態を研究するための貧乏人のテンプレートが用意されています。ここでは、これらの制限を克服することができ、新たに転写されたRNAのチオール特有のビオチン化および精製し、4  -...

細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明...

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。...

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

酵母サッカロマイセスセレビシエから新たに転写されたRNAを敏感かつ特異的に精製するためにチオレートされたウラシルを使用する。...

4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

ベーカーの酵母ミトコンドリアゲノムは8つのポリペプチドをコードする。現在のプロトコルの目的は、すべてのラベルを付け、後で別々のバンドとして視覚化することです。...

ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

RNAの二次構造は主に成熟RNAで構造プローブ法を用いて観察されています。共転写構造追跡シーケンシング(CoSTseq)は、新生RNA上のポリメラーゼ位置の研究に用いられてきた核ランオンと構造プロービングを統合します。これにより、活性転写下のRNAのRNA二次構造の観察が可能になります。...

サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析

学ぶ酵母における4-チオウラシルラベリングを用いた新規合成mRNAの定量化法。RNAポリメラーゼII活性を正確に測定し、転写動態と遺伝子発現制御の理解を深めるための実験手法です。

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

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