Name: 多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 学ぶ半自動化プラットフォームを用いた肝細胞様細胞の96ウェル板生産法。多能性幹細胞からの迅速かつ再現性の高い分化プロセスを解説し、肝疾患モデリングや薬物スクリーニング研究に活用可能です。

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この作品は、主任科学者のオフィス (TCS/16/37) と MRC 博士奨学金からの賞でサポートされていました。

1. ひと多能性幹細胞 (hPSCs) に 96 もプレートの肝細胞分化の播種
注: 試薬、このプロトコルで使用する機器は、表 1に記載されています。この実験で使用されるメディアは、生殖不能および細胞培養のため室温でにある必要があります。特に指定しない限り、プロトコルのこの部分に記載されているすべての試薬/ソリューション ボリュームは 96 ウェル プレートの単一の井戸に基づいています。
<ol><li>
準備ラミニン コート 96 ウェル プレート。
	<ol>
<li>組換えラミニン 521 (100 μ g/mL) のバイアルを解凍 (LN 521) 一夜に 4 ° C で 2 時間</li>
		<li>5 μ g/mL の溶液を準備するには、冷たい 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (Ca2 +/Mg で2 +) x LN 521 を希釈します。</li>
		<li>調剤カセット標準チューブでディスペンサーを扱う自動液体を使用すると、50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート LN 521 ソリューションを追加できます。 注: すべてのボリューム分配が特に指定しない限り、カセットを調剤標準管自動液体ハンドリング ディスペンサーと実行されます。プライム ソリューション、カセットの調剤の終わりに到達するまでは、調剤に進みます。複数の 96 ウェル プレートは、回数に応じて手順を繰り返して、同じ実験で用意できます。</li>
		<li>37 °C/5% CO2 2 に 4 h で LN521 コーティング版を孵化させなさい。 注: LN521 コーティング プレートに格納できる 4 ° C で 2 週間蒸発し、汚染を避けるために平らな面にシール プレートを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 時間に 30 分の 37 ° C でプレコート板の必要な数を暖かい。</li>
	<li>8 ch 吸引アダプターを使用して塗装面の残りの LN 521 溶液を吸引します。 注: コーティングの劣化を避けるために表面との接触を避けるために重要です。</li>
	<li>すぐに 10 μ M (ロック) Rho 関連キナーゼ阻害剤 Y27632 mTeSR1 培のウェルあたり 50 μ L を追加し、細胞 37 °C/5% CO2播種までインキュベーターでプレートを保ちます。 注: は、乾燥するラミニン コート井戸は認めません。</li>
	<li>
3 x 105セル/10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培 mL の細胞懸濁液を準備します。 注: 各セルライン播種密度の最適化が必要になります。<ol>
<li>培地を吸引 hPSCs で約 75% から 85% の未分化文化シャーレから LN 521 で培養の confluency 前述12。 注: hPSCs が上で培養した LN 521 mTSER1 のすべての 24 h を変更し、セル前述12として密度の 80% に到達後、定期的に継代培地で。</li>
		<li>洗浄室内温度 1 の 5 mL のセル (せずに Ca2 +/Mg2 +) x DPBS と吸引バッファー。</li>
		<li>セルに優しく細胞解離試薬 × 1 の 5 mL を追加し、, 細胞解離の 6 ~ 8 分くらいの 37 ° C で。 注: 反作用を停止し、するには、顕微鏡下でマトリックスから細胞の剥離を調べます。セルは、プレートから部分的に切断する必要があります。ない場合は、余分な 1 を 2 分間インキュベーションを拡張します。</li>
		<li>穏やかな細胞解離試薬の吸引によって、反応を終了し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 細胞に新鮮な mTeSR1 培の 5 mL を追加します。細胞スクレーパーを使用して、マトリックスとピペットをミックスする数回 P1000 ヒントを使用して上下から細胞を持ち上げます。</li>
		<li>トリパン ブルー染色除外法に基づく検定を使用して実行可能なセルをカウントし、必要な濃度と細胞懸濁液を準備します。</li>
		<li>滅菌 15 mL や 50 mL の遠心管に必要な細胞数をピペット又それらを室温で 5 分間 115 x gで遠心分離によって細胞をスピンダウンします。 注: 1 つの 96 ウェル プレート、mTeSR1 培 3 × 105セル/mL の 5 mL は H9 セル行必要です。</li>
		<li>上清を吸引し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培の 37 ° C で同種のソリューションが得られるまで優しく細胞ペレットを再懸濁します。 注: セル生存ポスト再めっきを改善しながら、ROCK 阻害剤の使用はお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 と mTeSR1 の 50 μ L を含む 96 well プレートに細胞懸濁液の 50 μ L を追加します。</li>
	<li>播種後、プレートを 37 °C/5% CO2を付けるセルを許可するように 24 時間で細胞インキュベータに戻ります。</li>
	<li>次の日細胞を調べるし、細胞に細胞の接触が確立されたら、ROCK 阻害剤を撤回します。40% の confluency で分化培地 (図 1 b) に切り替えます。 注: セル密度が 40% 以上の場合、プレートは、H9 セルラインで足 HLC の差別化のため適していません。</li>
</ol>2. 96 プレートで組換え Laminins の肝細胞様細胞に hPSCs を区別します。
<ol><li>
中小企業の成長要因の分化を準備します。
	<ol>
<li>滅菌 0.2% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS で人間のアクチビン A 粉末を溶解することにより、人間のアクチビン A 原液 (100 μ g/mL) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。</li>
		<li>0.2 %bsa を無菌のマウス Wnt3a 粉末を溶解することによりマウス Wnt3a 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 200 で使用します。</li>
		<li>滅菌 0.2 %bsa で人間 HGF の粉末を溶解することにより、ひと肝細胞増殖因子 (HGF) 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 1000 で使用します。</li>
		<li>オンコスタチン M (OSM) 原液 (20 μ g/mL) を準備するには、滅菌の 0.2 %bsa の粉末を溶解します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。</li>
		<li>決定的な内胚葉: 2 %b27 サプリメント (50 x、インスリンがなければ)、1% ペニシリン/ストレプトマイシンから成る、内胚葉分化培地を準備 (最終濃度: 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (追加RPMI 1640) 基礎培地。4 ° C で保存し、2 週間以内に使用します。それぞれの媒体の変更で必要なボリュームやで補うアクチビン A Wnt3a 100 ng/mL と 50 ng/mL、最終濃度でそれぞれ。</li>
		<li>Hepatoblast 分化: 20% ノックアウト血清交換 (KSR) 0.5% 1%、1% DMSO 0.1 mM β-メルカプトエタノール 1% 非必須アミノ酸 (NEAA) L-グルタミンの代替補完から成る、hepatoblast 分化培地の準備ペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ノックアウト DMEM (KO DMEM) に追加されます。真空下でフィルターし、4 ° C で保存2 週間以内に使用します。</li>
		<li>肝細胞の分化: 肝細胞分化培地、L-グルタミン、10 μ M ヒドロコルチゾン 21 hemisuccinate ナトリウム塩 (HCC) 1% ペニシリン/ストレプトマイシンに代わる補足 1% から成るを準備 (最終濃度 100 IU/mL と100 μ g/mL、それぞれ) HepatoZYME 培地に添加します。4 ° C で、在庫を保管し、2 週間以内使用します。HGF と OSM 必要なボリュームを補う、それぞれの媒体の変更について (最終濃度 10 ng/mL で 20 ng/mL、それぞれ)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>播種、24 h の記事は慎重にハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアを取り出して、100 ng/mL アクチビン A と 50 ng/mL Wnt3a と新鮮な内胚葉プライミング培の 100 μ L を追加します。 注: 分化過程開始決定的な内胚葉媒体が追加されます。細胞の播種を最適化すると、細胞の分化は通常 24 h 内で開始されます。すべての媒体の変更はハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムとメディアを削除して、標準で自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して新鮮な媒体の 100 μ L を分注した調剤カセットをチューブは、しない限り、それ以外の場合指定します。ハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムは、300 μ L のヒントを使用して、よく頭 96 で使用されました。簡単に言えば、90 μ L もの細胞が付いている接触を避けるから吸気された、細胞のストレスを軽減する中型の変更時にセルを乾燥しないことが重要です。</li>
	<li>ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、三日間内胚葉分化培地毎日を変更します。ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の分化を実行すると、2 の余分な日だけアクチビン A を使用して決定的な内胚葉ステージを拡張します。</li>
	<li>決定的な内胚葉誘導後、hepatoblast 仕様 KSR/DMSO 中に切り替えて、5 日間ごとに 2 日間媒体を変更します。 注: 非添付も細胞数が存在する場合は、次の媒体の変更の前に 1 回血球を洗浄する以外の添加 KO DMEM を使用します。プロトコル (5 日) の第二期の期間のため、hepatoblast 仕様の最後の日の最後の 1 と 3 の中変更があります。</li>
	<li>次の hepatoblast 分化肝細胞成熟の HepatoZYME 中に切り替えます。KSR/DMSO 中を削除した後の補足なし HepatoZYME で血球を洗浄し、10 ng/mL HGF と 20 ng/mL OSM HepatoZYME 成熟培の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>7 ~ 10 日間、媒体ごとの 48 h を変更します。日 18、分化、遺伝子発現と CYP P450 代謝活性を分析することによって HLCs を特徴付けます。</li>
</ol>3. 肝細胞様の細胞組換え Laminins の区別
<ol><li>肝細胞特異的マーカーと免疫染色を用いた偏波マーカーの発現を検出します。</li>
	<li>12前に説明したように CYP P450 の試金を使用して肝細胞の代謝機能をテストします。</li>
	<li>プレートごとウェルあたりの細胞の総数を数えるプレート バリエーションを決定します。</li>
</ol>4. 高スループット免疫細胞化学、画像集録
<ol><li>分化の 18 日に 1 x DPBS と 3 回洗浄、4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 50 μ L 分注によって、HLCs を修正し、15 〜 30 分間室温でインキュベートします。固定、3 回で洗い流して PBST (0.1% トゥイーン) (Ca2 +/Mg2 +) を使用せずに自動皿洗浄機。 注: このセクションですべての洗浄は、特に指定しない限り、自動皿洗浄機を使用して実行します。すべての洗浄は、同じプロトコルに従って行われます。</li>
	<li>(せずに Ca2 +/Mg2 +) PBST の 100 μ L 分注で膜を permeabilize、室温で 20 分間インキュベートします。次に、pbst; 10 %bsa の 100 μ L 分注による蛋白質のブロックを実行し、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで 1 時間インキュベートします。タンパク質をブロック後、1 %bsa の 50 μ L を加えて pbst; 一次抗体を含む、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで一晩, 4 ° C で。 注意: 蛋白質のブロックと抗体の添加の間洗わないでください。</li>
	<li>24 h 後 (せずに Ca2 +/Mg2 +) 1 x DPBS にて 3 回洗浄し、pbst; で 1 %bsa の 50 μ L 分注による二次抗体を追加します。暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>二次抗体の孵化後 1 x DPBS で 3 回を洗ってください。DAPI の DPBS の 50 μ L を追加 (10 μ G/ml) と暗闇の中で部屋の温度で 5-10 分間インキュベートします。</li>
	<li>最後に、DPBS 3 回洗うし、井戸の 1 x DPBS の 100 μ L を残します。プレートは、イメージングのため準備ができています。 注: プレートは、イメージングまで暗闇の中で 4 の ° C で保存する必要があります。</li>
	<li>高コンテンツ イメージング システムを使用してプレートをイメージし、井戸の良い表現を取得するだけにいくつかのフィールドを取得します。コロンバス ソフトウェア (高コンテンツ イメージング解析システム ソフトウェア) を使用して、HLCs の別のマーカーの発現を定量化します。 注: コロンバスは、細胞表現型解析のためのセル分割分析を提供しています高いコンテンツ解析ソフトウェアです。同様の結果は、CellProfiler、生物画像22の定量分析のためのオープン ソース ソフトウェアを使用して実現できます。</li>
</ol>

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</ol>

教授デビッド C. Hay は共同創設者兼 Stemnovate 限定のディレクターです。
教授デビッド c. ヘイ HigherSteaks 限定のディレクターであります。

私たちの半自動の手順は効率、信頼性と経済性、規模 (図 1) で HLCs の生産を許可します。このプラットフォームのセル ベースのスクリーニング (図 2) の適切なアプローチを行う、プレートの井戸間に細胞数の面で有意差がなかった。さらに、半自動化ワークフローは手動プロセス5,12を使用する前にできなかった、一度にプレートの数が多いを生成するユーザーをできます。
重要なは、自動化プロセスは HNF4α を発現する細胞の大半との分化収量に影響しなかった (89.2% ± 2) および ALB (92.8% ± 6) (図 3)。HLCs は、CYP P450 酵素 CYP2D6、CYP3A4 の発現し、CYP1A2 と CYP3A 代謝活性以前報告された実験 (図 3)5に匹敵するが表示します。にもかかわらず、プロトコルの標準化、分化前のセル密度は純粋な足 HLC 分化にとって重要です。したがって、井戸に良い細胞分布を確保は、重要な考察 (図 1) です。これは依存のセルラインをあると証明した、従って細胞の播種と密度の最適化は各セル行前にスケール アップに必要です。
現在の形態でこのプラットフォームは適していません HLCs の臨床応用のための大量生産に、これは最も可能性の高いセル工場とバイオリアクターを使用して達成します。ただし、疾患モデリング、薬剤のスクリーニングおよび/または薬物の研究を転用のためひと肝細胞の急速な生成のため開発された方法論が許可されます。また、アッセイは、解明の多重データセットの生成を許可する多重化、影響を受けやすいです。今後は、我々 はまたこの技術が 3 D 分化など足 HLC 表現型生体外で改善するためのプラットフォームとしてシステムの in vitro複雑に適用することと考えています。
結論としては、考えています私たちの単純な半自動システムを実験のスループットを増加し、実験的な変化を減らす人間の生理への外挿と生物学的データセットの品質が向上します。

ひと肝細胞 (PHHs) は、肝の生物医学研究のための現在の標準を表します。彼らの利点にもかかわらず、PHHs は不安定な表現型1成熟肝細胞の限られたソースを表しています。ヒト胚性幹細胞 (Esc)、ひと誘導多能性幹細胞 (iPSC) は肝2,34,を含む人間のティッシュの再生可能エネルギー源を有望な医学研究の強力なリソースとして提案されています。.現在の肝細胞分化プロシージャ肝細胞マーカー、遺伝子、PHHs3,4,5,6,7に類似した機能を発現する細胞を生成します。 8,9,10,11。最近では、定義された材料と組換え laminins など行列の使用は、改良された細胞表現型と実験的再現性5,12,13,14。
従来の細胞培養の技術は、時間がかかり、エラーを起こしやすいです、手動ピペッティングに重く頼る。これは、アッセイおよび 1 つを扱うことができますプレート形式のスループットを制限します。まで、HLCs の生成を記述する研究のほとんどが労働集約的な性質で、サイズ15,16,17したがって小規模となっています。
最近の液体ハンドリング、ピペッティング システム研究所分析器、自動顕微鏡との組み合わせで可能となって人間の介入のための要件を最小限に抑えるための手順を開発します。これらの技術の利点を撮影し基本的な人間の肝臓組織を大量に生成する半自動化された分化システムを開発し、応用医学研究。このアプローチは、人間の ESC と iPSC 行セル行に応じて、必要な若干の調整を実行できます。高の内容分析とこのシステムを組み合わせて、我々 は足 HLC フェノタイピングより時間がかかり、スケール18,19,20,21で実行ことを示します。
要約すると、細胞培養の技術が記載のオートメーションは信頼性、実験時間管理、測定スループットの改善につながっています。

<table><tbody><tr><td>405 LSワ</td><td>ッシャーBiotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ12587-010</td><td></td></tr><tr><td>ベータメルカプトエタノール</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ31350</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマアルブリッチ</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBSカルシウムとマグネシウム</td>サー<td>モフィッシャー</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>穏やかな細胞解離試薬</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>ヒト肝細胞成長因子</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>ヒト オンコスタチン M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換えラミニン 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 21-ヘミスコハク酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 10829</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 培地</td><td>STEMCELL テクノロジー</td><td>ズ 5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi 試薬ディスペンサー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11140</td><td></td></tr><tr><td>オペレッタ ハイコンテントイメージングシステム</td><td>パーキンエルマー</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤 Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube 分注カセット</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 電子式 96 チャンネルピペット</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS、カルシウム、マグネシウム不使用</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液 4%、緩衝液、pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (マウス)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (マウス)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>ダンディー大学</td> ダン<td>ディー大学</td><td>1:200 (羊)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>ダンディー大学</td> ダン<td>ディー大学</td><td>1:200 (羊)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズA-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞は、人体組織の再生可能エネルギー源を表します。本研究では、ヒト胚性幹細胞 (hESCs) からひと肝組織の生成に焦点を当てたし、誘導多能性幹細胞 (Ips)。現在の差別化の手順は、ひと肝細胞様細胞 (HLCs) 胎児および大人の特性の混合物を表示するを生成します。細胞表現型を改善するために完全に定義しました私たちの分化の手順と細胞ニッチ表示改善された遺伝子発現と機能細胞の生成に終っています。一方、これらの研究は、進行状況をマーク、マルチ プレートのスクリーニングのための大量を生成する能力は労働集約的なプロシージャとバッチ変化されています。この問題に取り組むため、我々 は HLCs。 幹細胞播種に多能性幹細胞を分化する半自動化されたプラットフォームを開発しているし、分化は、96 ウェル プレート形式の液体処理と自動ピペッティング システムを使用して行われました。次の分化、細胞表現型を自動顕微鏡とマルチもルミノを使用して行った。

細胞の分化は萌芽期の幹細胞ライン (H9) を用いて行った。半自動化されたプラットフォームは、差別化し、細胞 (図 1 a) の特徴に慣れていた。自動液体ハンドリング ディスペンサーは、行列をコートで単一のセルをシードに使用されました。細胞の分化は、細胞に達すると 40% の confluency (0 日) に開始されました。媒体および媒体追加 (図 1 a) の液体ハンドリング ディスペンサーを削除するハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアの変更を行った。細胞の固定・染色を自動皿洗浄機との組み合わせで自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して行った。コロンバス ソフトウェア高コンテンツ イメージング システムを用いたイメージングと定量を行った。確立されたアッセイを用いたシトクロム P450 活性を測定しました。基板培養、細胞培養上清が収穫され、発光記録マルチモード マイクロ プレート リーダー (図 1 a) を使用しています。さらに、従来の位相差顕微鏡は、肝細胞の分化 (図 1 b) に細胞の形態の変化を測定する使用されました。
日 18 日 (図 2 a) を汚す DAPI 以下ウェル間の細胞数の変動を調べた。7 つのフィールドの表示は、井戸と核の定量化 (図 2 a) 数ごと捕獲されました。我々 は井戸 41,662 ± 3 の平均とよく (図 2 b) あたり 366 細胞間の統計的な差異を検出されません。
18 日に HLCs が固定し、典型的な肝細胞マーカー (図 3A G) 染色 CYP P450 活性をテストします。HLCs 表現 HNF4α など肝細胞マーカー (89.2% ± 2 陽性細胞) ALB (92.8% ± 6 陽性細胞)、AFP (61.8% ± 2 陽性細胞)。HLCs も CYP P450 タンパク質、CYP2D6、CYP3A4 の発現し、E-カドヘリン蛋白質の発現によって示すように多角形に独自の外観を表示します。18 日 HLCs CYP P450 活性を測定しました。HLCs は、295,906 ± 45、828 RLU/mL/mg タンパク質と 1,066,112 ±177、416 RLU/mL/mg タンパク質 (図 3 H) で CYP3A で CYP1A2 活性を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> 図 1: 96 で Psc からの肝細胞分化もフォーマットします。細胞分化の半自動化、固定、染色・ イメージングと運動機能に使用される装置の(A) します。ダイアグラムです。(B).代表は足 HLC 分化細胞形態の変化します。簡単に言えば、Psc は決定的な内胚葉、石畳のような形態を表示する細胞と肝細胞成熟前の特徴細胞多角形を取得を hepatoblast 仕様に続いてに向けて準備万端します。スケールバー = 100 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> 図 2: HLCs 井戸-井戸変動の評価。(A)表現、96 ウェル プレート HLCs DAPI 染色のビュー。スケール バー = 1 ミリメートル。 (B)ウェルあたりのセル数の定量化。列 (上) とも、コロンバスのソフトウェアを使用して定量化されたあたりの 7 つのフィールドから行 (下) の井戸あたりのセル数の平均です。板全体平均セル数は 41,662 ± 3,366 SEM 細胞/ウェルです。井戸間に統計的有意差は認められなかった。テューキー事後検定と一方向の分散分析を用いて.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> 図 3: 肝細胞マーカーの発現と 18 日 HLCs CYP P450 活性測定。(A)肝細胞核因子 4 α の割合(HNF4α) 式 ± SEM 30 井戸井戸あたり 10 フィールドのビューに基づいています。(B) SEM、+/-アルブミン (ALB) 式の割合は、ウェルあたり 10 のフィールドの表示と 3 つの井戸に基づいています。(C) SEM ± α フェトプロテイン (AFP) の割合は、ウェルあたり 10 のフィールドの表示と 3 つの井戸に基づいています。(D) E-カドヘリンの汚損。(E) CYP2D6 の汚損。(F) CYP3A4 の汚損。(G). 免疫グロブリン G (IgG) コントロールを染色します。スケールバー = 50 μ m (H) CYP 1 a 2 と 3 a 代謝内 P450 活性 HLCs 18 日目。6 生物複製 SEM. 活動 +/-が表すデータは蛋白 1 mg 当たりの相対的なライト ユニット (RLUs)/mL として引用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、96 well プレート形式でひと多能性幹細胞からの肝細胞様細胞を生成する半自動化されたアプローチについて説明します。このプロセスは、迅速かつコスト効率の高い、品質の生産保証基礎・応用研究の肝細胞のような細胞のバッチを許可します。

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

この方法では、半自動プラットフォームを使用して、再現性の高い肝細胞様細胞を96ウェルフォーマットで作製します。この技術の主な利点は、迅速で費用対効果が高く、ばらつきが少なく、肝細胞様細胞の96ウェルプレートを大量生産できることです。解凍したラミニン521の5マイクログラム/ミリリットル溶液を、氷冷した1回のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはカルシウムマグネシウムを含むDPBSで希釈することにより調製します。標準のチューブ分注カセットを備えた自動リキッドハンドリングディスペンサーを使用して、96ウェルプレートのウェルあたり50マイクロリットルのラミニン521溶液を追加します。ラミニン521コーティングプレートをインキュベートします。インキュベーション後、8チャンネル吸引アダプターを使用してラミニン521溶液をコーティング表面から吸引し、コーティング表面との接触を避けます。1ウェルあたり50マイクロリットルのmTeSR1培地に10マイクロモルのRho関連キナーゼまたはROCK阻害剤Y27632を直ちに追加します。プレートをインキュベーターに保管し、細胞が摂氏37度、CO2の5%になるまで播種します。10マイクロモルのROCK阻害剤Y27632を添加したmTeSR1培地中の1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の細胞懸濁液から。50マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートに加えます。播種後、プレートを摂氏37度、5%CO2の細胞インキュベーターに24時間戻し、細胞が付着するのを待ちます。インキュベーターからプレートを取り出した後、翌日プレートを検査し、細胞間の接触が確立され、密度が40%に達していることを確認してから、分化培地に切り替えます。細胞のコンフルエンシーは、分化の開始をアピールします。肝細胞のような細胞を良質にするための鍵です。分化の開始は、合流性が40%に達すると、分化に適していないプレートです。播種後24時間後、自動ハンドヘルド電動チャンネルピペットを使用して培地を慎重に取り出します。そして、100マイクロリットルの新鮮な内胚葉プライミング培地に、100ナノグラム/ミリリットルのアクチビンAと50ナノグラム/ミリリットルのWnt3aを添加します。最終的な内胚葉導入後、肝芽球仕様のKSR DMSO培地に切り替えます。そして、5日間、2日ごとに媒体を交換します。肝芽球の分化後、KSR DMSO培地を取り出し、サプリメントを含まないHepatoZYME培地で細胞を一度洗浄します。洗浄後、100マイクロリットルのHepatoZYME成熟培地を追加し、10ナノグラム/ミリリットルの肝細胞成長因子と20ナノグラム/ミリリットルのオンコスタチンM.7〜10日間、48時間ごとに培地を交換します。分化の18日目に、細胞を固定し、液体処理と自動プレートウォッシャーを使用して免疫細胞化学を行います。プレートは、イメージングするまで暗所で摂氏4度で保管します。続いて、イメージングと定量化を行います。18日目に、DAPI染色後にウェル間のばらつきと細胞数を調べました。ウェルごとに7つの視野を捕捉し、核の数を定量化した後、統計的な違いは特定されませんでした。18日目にヒト肝細胞様細胞またはHLCを染色すると、肝細胞マーカーであるHNF4α、アルブミン、およびAFPの発現が示されました。HLCはまた、CYP P450タンパク質を発現し、CYP2D6、およびCYP3A4はCYP P450代謝活性を示しました。HLCはまた、E-カドヘリンで示される明確な多角形の外観を示しました。このプロトコルは標準化されていますが、分化前の細胞の密度はHRCの分化にとって重要です。細胞は独立していることがわかります。そのため、細胞株ごとに販売播種と密度最適化が必要です。この方法論を習得すると、疾患モデリング、薬物スクリーニング、または薬物提案研究のために、ヒト肝細胞の複数のプレートを迅速に生成することができます。このシステムにより、肝細胞生物学のメカニズム解析のためのマルチパラメトリックデータセットの生成が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips...

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ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。...

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

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多能性幹細胞の分化を監視するための生細胞画像ベース機械学習戦略

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多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

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