前立腺癌におけるリン酸化プロテオームを調べる定量的ラベル無料質量と相まってリン酸化ペプチド濃縮

この方法は、がん分野など、リン酸化シグナルが関心のあるあらゆる研究分野で重要な質問に答えるのに役立ち、治療耐性後のシグナル伝達ネットワークの変化を評価することができます。この手法の主な利点は、数千ものリン酸化ペプチドを比較的簡単かつ安価に同定し、ホスホプロテオームを全球的に評価できることです。腫瘍組織を採取するには、腫瘍の重量を量り、培養試験管で、組織100ミリグラムごとに2ミリリットルの氷冷溶解バッファーを追加します。

次に、ハンドヘルドまたはベンチトップホモジナイザーを使用して、ライセートをホモジナイズします。サンプルを減らしてアルコール化するには、チューブを摂氏95度で5分間加熱し、次にサンプルを氷上で15分間冷却します。氷上に置いたまま、ライセートを3回超音波処理し、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。

超音波処理チューブをスイングバケツローターに入れ、ライセートを3,500gおよび15°Cで15分間遠心分離し、次いで上清を収集してペレットを廃棄する。ライセートを消化するには、100ミリモルトリスを使用してサンプルを12倍に希釈し、グアニジンの量を減らします。5ミリグラムのタンパク質に対して、10マイクログラムのリシルエンドペプチダーゼまたはlys-Cを加え、サンプルを室温で5〜6時間インキュベー

TPCK処理トリプシンの1ミリリットルあたり1ミリグラムを1ミリモルHCLに調製し、20ミリモルの塩化カルシウムとトリプシンをタンパク質比100トリプシンに添加します。サンプルを摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、トリプシンのアリコートをチューブに追加し、サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートします。

サンプルを15ミリリットルの10キロダルトンカットオフフィルターに加えます。スイングバケットまたは固定角ローターで、3、500g、摂氏15度でサンプルを遠心分離し、保持液の量が250マイクロリットル未満になるまで遠心分離します。次に、流れを回収し、保持物を廃棄します。

サンプルを酸性化するには、ライセート1ミリリットルあたり約20マイクロリットルの5%トリフルオロ酢酸またはTFAを加えます。チューブをよく混合し、pHストリップを使用してpHを測定します。必要に応じて、5%TFAを追加してpHを2.5に調整します。

次に、C18カラムの短い方の端を真空マニホールドに接続します。真空度を17〜34キロパスカルに設定した後、3ミリリットルの100%アセトニトリルとガラスピペットを使用してカラムを濡らします。ガラスピペットを使用し、0.1%TFAの3ミリリットルアリコートを2つ適用して、カラムを平衡化します。

次に、酸性化したサンプルをカラムにロードします。3ミリリットルの容量の0.1 TFAを3回使用してカラムを洗浄します。次に、2ミリリットルの40%ACN 0.1%TFAを適用してサンプルを溶出し、2ミリリットルの画分を2つガラス培養チューブに回収します。

パラフィルムを使用して、溶離液チューブを覆い、20ゲージの針を使用してカバーに3〜5個の穴を開けてから、サンプルを一晩凍結乾燥します。凍結乾燥粉末を、各画分中の0.5ミリリットルの氷冷免疫沈降またはIP結合緩衝液で再懸濁します。0.5ミリリットルの再懸濁液量を2番目のフラクションから最初のフラクションでチューブに移し、ピペットチップを保存します。

さらに0.5ミリリットルのIPバッファーを使用して各凍結乾燥チューブをすすぎ、内容物をクライオチューブに移す前に、2ミリリットルのIPバッファーを使用してすすぎを繰り返します。先端がカットされたP200を使用して0.5ミリグラム/ミリリットルの抗体ビーズスラリーのストックをマイクロフュージチューブに移した後、450マイクロリットルの氷冷IP結合バッファーを添加して、50マイクロリットルの4G10抗体ビーズスラリーと25マイクロリットルの27個のB10.4抗体ビーズスラリーをマイクロフュージチューブで洗浄します。チューブを100 g、摂氏4度で1分間遠心分離します。

上清を吸引した後、IP結合バッファーの元のスラリーと同量を添加してビーズを再懸濁します。スクリューキャップクライオチューブに再懸濁したサンプル溶液に予処理したpYビーズを加え、エンドオーバーエンドローテーターで摂氏4度で一晩インキュベートします。ビーズをスピンダウンした後、pSTペプチドの濃縮に使用される上清を保存します。

次に、300マイクロリットルのIP結合バッファーを使用してビーズを再懸濁し、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。サンプルを100 g、摂氏4度で1分間スピンダウンします。次に、500マイクロリットルのIP結合バッファーで、ビーズを3回洗浄します。

ビーズを450マイクロリットルの25ミリモル重炭酸アンモニウムpH7.5で4回洗浄します。ゲルローディングチップをビーズ表面の少し下に沈め、上清を完全に吸引します。ビーズにビーズ体積0.1%TFAの4倍を加えます。

次に、それらをよく混合し、チューブをサーモミキサーで1, 000 rpm、摂氏37度で15分間インキュベートします。再懸濁液を0.2μmスピンフィルターに移し、フィルターを850gで1分間遠心分離します。溶出液を低タンパク結合性微量遠心チューブに移した後、溶離液を40°Cで真空濃縮し、一晩中300分間の加熱時間で乾燥させます。

チップに含まれる酸化チタンビーズを調製するには、100%ACNを200マイクロリットル加えます。次に、それを反転させ、狭い方の端をフリックして、液体をキャップに向かって動かします。カミソリの刃を使用して、先端を切断し、低タンパク質結合チューブの上に置きます。

次に、キャップを取り外し、マイクロピペットを挿入して残りのACNを突っ込んでから、洗浄を繰り返します。酸化チタンを500マイクロリットルの100%ACNで2回プレコンディショニングします。次に、500マイクロリットルの0.2モルリン酸ナトリウム緩衝液pH 7で二酸化チタンを2回コンディショニングします。

最後に、300マイクロリットルの平衡緩衝液を使用してビーズを3回洗浄します。400マイクロリットルの50%ACN 0.1%TFAを低タンパク質結合チューブに加えます。次に、84マイクロリットルの乳酸を追加します。

再懸濁したリン酸化ペプチドを低タンパク質結合チューブに移し、エンドオーバーエンドローテーターを使用して室温で1時間インキュベートします。ビーズをペレット化した後、300マイクロリットルの平衡緩衝液を使用して2回洗浄し、スピンダウンします。300マイクロリットルのすすぎ緩衝液で、ビーズを2回すすぎます。

次に、それらを0.2マイクロメートルのスピンフィルターに移します。紡糸後、フィルターユニットを清潔な1.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブに移し、200マイクロリットルの0.9%アンモニウム水で内容物を2回溶出させます。pHを確認した後、溶離液を一晩真空濃縮して乾燥させ、アンモニアを蒸発させます。

MS分析のためにペプチドを脱塩するには、リン酸化ペプチドを15マイクロリットルの0.1%TFAで再構成します。結合容量が5マイクログラムのC18チップを使用してサンプルを洗浄し、製造元のプロトコルに従ってください。最後に、溶出量を真空濃縮で完全に乾燥させた後、乾燥させたリン酸化ペプチドを12.5マイクロリットルの質量分析溶液に再懸濁します。

このクマシー染色された消化済みライセートのゲルはタンパク質の存在を確認し、ポスト消化ライセートの染色は完全な消化を確認します。完全な消化のためには、lys-Cとトリプシンのそれぞれ30キロダルトンと23.3キロダルトンのバンドを除いて、15キロダルトンを超えるバンドは現れません。lys-Cを追加することで、切断の欠落の数も減少します。

pY免疫沈降は、pYをpSTペプチドから効果的に分離し、pY調製物から同定されたリン酸化ペプチドの平均85%がpYであり、pST調製物から同定されたリン酸化ペプチドの99%以上がpSTであった。二酸化チタンは、両方の調製物中のリン酸化ペプチドを濃縮するために使用されます。MS ready調製物中のリン酸化されるペプチドの予想される割合は30〜50%であり、検出されるリン酸化ペプチドの大部分は単一または二重のホスホリル基を持っています。

質量分析を行った後、MS の生ファイルを MS 分析ソフトウェアにロードします。ここに示すように、局在化確率のカットオフを 0.75 より大きく設定すると、pY ペプチドの約 5%、pS ペプチドと pT ペプチドの約 15% と 34% がフィルターで除外されます。これらのフィルターを適用した後、MS分析終了時のリン酸化ペプチドの同定の予想数は、開始タンパク質の5ミリグラムに対して約300pYペプチド、開始ペプチド量の2.5ミリグラムに対して約7,500pSペプチドおよび640pTペプチドである。

この手法を習得すると、pYステップとpSTステップを並行して実行すれば、6日で完了します。ただし、サンプルが 8 個を超える場合は、手順を順番に実行して、さらに 4 日間にわたって技術的なエラーを減らします。これらの手順を試みるときは、詳細に焦点を当てることを忘れないでください。

すべてのステップが重要であり、必要な品質管理を含む最終製剤の品質に影響を与える可能性があります。このビデオを見れば、タンパク質の抽出と消化の方法、その後のホスホペプチド濃縮の方法、質量分析によるホスホプロテオームの全体的変化の調査方法について十分に理解できるはずです。