くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

この手順の全体的な目標は、くも膜下出血の誘発後のマウスの脳血管痙攣を定量化することです。これは、放射線不透過性鋳造剤を使用して、動物を経心臓灌流および血管内鋳造に供することによって達成されます。次のステップは、脳をマイクロコンピュータ断層撮影にさらすことにより、断面画像データを取得することです。

その後、画像とデータが処理されます。Miro のソフトウェアは、頭蓋内血管ツリーを仮想的に再構築し、血管の痙攣を定量化するための客観的な尺度である定義された血管セグメントの体積を計算するために使用されます。くも膜下出血は、イソフルランによる麻酔下での血管内フィラメント穿孔によりマウスに誘発されます。

左外頸動脈は外科的に準備されます。次に、フィラメントを外頸動脈に挿入し、頸動脈tに穿孔された内頸動脈を通って頭蓋内に進行させ、くも膜下出血を誘発します。頭蓋内圧の上昇は、血管内穿孔が成功したことの指標と見なされます。

血管痙攣を分析するには、麻酔を誘発します。十分な麻酔レベルに達した後にのみ続行し、これは痛み刺激に対する反応がないことによって確認されます。以下の溶液を用いて経cardiac 灌流を行います。

ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの生理学的濃度をpH7ポイント4で含む生理的塩溶液。そしてその後、4%PFA溶液。溶液番号 1 で 2 分間増殖を開始し、溶液 2 で 4 分間続けます。

37°Cの温度で溶液を注入し、可変灌流速度の圧力制御ポンプを使用して、70ミリメートル水銀の一定圧力で灌流します。ソリューション 1 からソリューション 2 に切り替える際の圧力損失を回避します。両方の溶液による灌流後、放射線不透過性鋳造剤を用いて室温で20分間灌流を1分あたり2ミリリットルの一定速度で継続する。

放射線不透過性鋳造材料を硬化させるためのサンプルを摂氏4度で一晩保持します。そして、脳を取り出し、サンプルを摂氏4度で4%PFA溶液にマイクロセチシンするまで保存します。鈍い解剖学的鉗子を備えたプラスチックチューブの真ん中に脳を置きます。

サンプルよりもわずかに大きい直径のチューブを選択して、画像取得中に物体が動かないようにします。ガーゼを使用してチューブを閉じます。X線キャビン内のコンピュータナビゲート制御位置決めシステムのマイクロステッピングモーターを介してプラスチックチューブを取り付け、物体がその水平軸を中心に回転します。

X線X線撮影下の視野にサンプルを位置合わせします。最大倍率を達成するには、物体をX線源にできるだけ近づけて配置し、検出器までの距離をできるだけ最大にします。ステップを使用して、次のスキャンパラメータで画像取得プロトコルを撮影します。

投影ごとに露光時間を1秒に設定し、80キロボルトの真空管電圧を使用して信号対雑音比を最適化します。1 回転の投影数を 1, 000 に設定します。生データの再構築には、フィルタリングされた後方投影アルゴリズムを使用し、1, 024立方ボクセルの行列を持つShepp-Loganフィルターを意味します。

dicom データを Miro のソフトウェアにインポートするには、import 関数を使用します。関数 vol-run を使用して容器ツリーを可視化します。視覚化のしきい値を選択して、大きな大脳動脈がシャープな輪郭で描かれ

実験系列に属するすべてのデータセットに対して同じ可視化しきい値を使用することが重要です。Circle of Willisの基底大脳動脈を仮想的に解剖し、血管をカーゾンで囲むことにより機能ボリュームを追加します。次に、分析する血管セグメントを仮想的に分析します。

したがって、血管樹の3次元モデルを回転させて、すべての小さな枝を主動脈から正確に分離します。さらなる解析では、解析対象の容器セグメントを除くすべての容器を削除することが不可欠です。関数 auto skeleton with threshold を可視化しきい値に適用すると、中心線に基づく空間グラフが生成されます。

次に、関数 spatial graph を線セットに適用して、線セットを作成します。カーソルで単一のサブセグメントを手動で選択し、分割をクリックして、ラインセットを単一のサブセグメントに分割します。この手順は、単一のサブセグメントの体積を計算するために重要です。

空間グラフに設定された関数線を使用して、空間グラフを再度作成します。関数空間グラフ統計を使用して、各サブセグメントの長さ、体積、および直径を決定します。船舶の直径の経過を表す色分けされた視覚化には、機能空間グラフ ビューを使用します。

セグメントの色分けを、容器の直径と相関する厚さに設定します。実験系列に属するすべてのデータセットに対して同じカラーマップを選択することが重要です。サブセグメントの長さを追加して、どのサブセグメントを詳細な分析に含めるかを決定します。

本研究では、頸動脈tの近位にある内頸動脈の1mmと、頸動脈tの遠位にある大脳動脈の5mmの2点からなる血管セグメントを評価した。次に、ボリュームを追加して、定義された容器セグメントの容器体積を決定します。血管樹の仮想再構成の精度を評価するために、顕微鏡で決定された血管直径と、10個の脳サンプルの解剖学的に定義された2つの点での3D仮想再構成から決定された血管直径との間の直径ベースの比較を実行しました。

容器の直径の顕微鏡測定には、高解像度カメラ、ソフトウェアキャリブレーションツール、マイクロメートルスケールを使用しましたが、顕微鏡で決定された直径と仮想的に決定された直径の間に大きな違いはありませんでした。頭蓋内血管の解剖学的構造の正確な仮想再構成を示しています。脳基底痙攣を定量化するために、左側の 1 mm IC8 と 2 点 5 mm MCA で構成される、事前定義された代表的な 3 点 5 mm 血管セグメントの体積を決定しました。

SAHおよび偽手術動物からの脳サンプル。SAHでは、偽血管と比較して血管容積が有意に少なく、脳血管痙攣を示しています。血管の直径も、偽と比較してSAHで有意に低かった。

ここで紹介した方法で達成された仮想再構成は、血管の解剖学的構造を正確に反映しています。血管セグメント全体を調べることができ、おそらく、血管痙攣を定量化するための客観的なパラメータを、一点での血管径の決定よりも提示します。容積評価は、血管の直径のみの評価と比較して、血管痙攣性血管と非血管痙攣性血管の間に大きな差をもたらします。