Name: くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶ くも膜下出血後の脳血管攣縮をマウスモデルで定量化する方法。マイクロCTと血管内キャスティングを用いて3D再構成し、血管体積を測定することで客観的な評価を可能にする。

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本研究の一部は、T. Pantel、マインツのヨハネス ・ グーテンベルク大学の医学部に提示の学位論文の一部です。研究は、Friedhelm 解放財団、財団 Neurochirurgische 上海虹橋 (a ・ n ・助成金) に支えられました。

動物実験は動物レスポンシブル ・ ケア委員会 (Landesuntersuchungsamt ラインラント = プファルツ) によって承認され、ドイツの動物保護の行為 (TierSchG) を実施します。すべての該当する国際、国家、そして制度ガイドライン ケアとの動物の使用のために続いていた。
本研究では、男性 C57BL6 マウス (年齢 10-12 週) が使用されました。簡単に言えば、くも膜下出血だったとイソフルレン麻酔下で脳血管内フィラメント穿孔によって誘導されます。左外頚動脈は外科的に準備されました。その後、フィラメントは外頚動脈に挿入され頭蓋内頸動脈 T、くも膜下出血を誘発する、穿孔内頸動脈を介して高度な。頭蓋内圧の上昇が血管内治療成功の指標として撮影された 穿孔。マウスにおける出血の血管内フィラメント穿孔モデルの詳細なプロトコルとなっています8,14他人によって公開されました。
1. 血流と血管内の鋳造
<ol><li>本研究では血流は SAH の誘導後 72 時間に行った。5 μ g/g 本体重量 (bw) ミダゾラム、30 ng/g bw フェンタニル 0.5 μ g/g bw medetomidin 腹腔内注入して麻酔を誘導します。十分な麻酔レベルに達すると、痛み刺激に対する反応の有無により確認された後にのみ続行します。</li>
	<li>胸郭を開く、穿刺 21 G カニューレと左心室、右心房を開き、15他の場所で記述として下行大動脈をクランプします。</li>
	<li>次の解決策を使用して transcardiac の灌流を実行: (i) ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 MgCl2と 1 G/L グルコースと (ii) 4% パラホルムアルデヒド溶液 ph 7.4 CaCl2を含みます。<ol>
<li>(I) 2 分間ソリューションと灌流を起動し、(ii) 4 分のためのソリューションを継続します。</li>
		<li>37 ° C、可変灌流率と圧力制御のポンプを使用してあったマウス16で血管攣縮を分析する最適な灌流圧 70 mmHg の定圧灌流温度でソリューションを吹き込みます。ソリューション (ii) (i) のソリューションからの切り替え時の圧力損失を避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソリューション (i) と (ii) による血液灌流後の放射線不透過性のキャスティング エージェントと室温で 20 分間灌流を継続 (材料表参照) 0.2 ml/min の一定のレートで。</li>
	<li>一晩 4 ° C で放射線不透過性鋳造材の硬化を可能にします。前述の17として頭蓋骨から脳を取り除く 4 %pfa ソリューションにサンプルを転送およびマイクロ CT スキャンまで 4 ° C でサンプルを保存します。</li>
</ol>2. マイクロ コンピューター断層撮影
<ol><li>プラスチック製のチューブの中心に鈍的解剖学的鉗子で脳を配置します。画像の取得中に、オブジェクトが動かないようにサンプルより若干大きい直径のチューブを選択します。ガーゼを使用して、チューブを閉じます。</li>
	<li>オブジェクトを水平軸を回転させて x 線小屋のコンピューター移動制御 (CNC) の測位システムのマイクロ ステップ モーターにプラスチック製のチューブを取り付けます。</li>
	<li>ビューのフィールド x 線ラジオグラフィーの下にサンプルを配置します。最大の倍率を達成するために x 線源にできるだけ近くにオブジェクトを配置し、可能な限り検出器までの距離を最大化します。</li>
	<li>次のスキャン パラメーターでステップの撮影画像取得プロトコルを使用: 1 に露光時間を設定各投影信号対雑音比 (SNR) を最適化し、管電圧 80 の kV (現在 38 μ A)、1,000 の予測結果 360 ° 回転。</li>
	<li>RAW データの再構築再構築ソフトウェアを使用して 1024 x 1024 x 1024 画素行列・ シェップ ローガン フィルターを適用するフィルター処理逆投影アルゴリズムを使って (材料の表を参照してください)。詳細な分析結果の DICOM データを 3次元可視化ソフトウェア インポートします。 (材料の表を参照してください)。</li>
</ol>3 頭蓋内血管の木および血管ボリュームの決定 3次元再構築
注:可視化ソフトウェアの機能に関する背景情報については、ヘルプ機能を使用して見つけることが。
<ol><li>Dicom データをインポート機能を使って可視化ソフトウェアにインポートできます。</li>
	<li>関数Volrenで船木を視覚化します。太い脳動脈がシャープな輪郭で描かれているので可視化のしきい値を選択します。実験シリーズに属するすべてのデータのセットに同じ可視化しきい値を使用することが重要です。</li>
	<li>事実上関数VolumeEditをカーソルで血管を囲むことによって基底脳動脈 (ウィリス動脈輪) を解剖します。その後、事実上分析する血管を解剖します。したがって、正確に主要な動脈からのすべての小さな枝を分離するために血管の木の 3 次元モデルを回転します。分析する血管を除くすべての血管を削除するのにはさらなる分析のために不可欠です。</li>
	<li>生成する可視化のしきい値に設定されているしきい値をAutoskeleton関数を適用するセンター-ライン - SpatialGraphをベースします。</li>
	<li>次に、関数を作成するSpatialGraphToLineSetを適用、行セット。手動でカーソルを 1 つの区分を選択し、「分割」をクリックすると、その単一の区分に設定行を分割します。この手順は、単一の区分のボリュームを計算するために重要です。</li>
	<li>空間グラフをもう一度作成するのにLineSetToSpatialGraph関数を使用します。</li>
	<li>長さ、ボリューム、および各小区分の直径を決定するのにSpatialGraphStatistics関数を使用します。色分けされた可視化のために関数を使用して血管径のコースを表すSpatialGraphView.「太さ」は、血管径と相関する着色セグメントを設定します。実験シリーズに属するすべてのデータセットの同じ色のマップを選択することが重要です。</li>
	<li>それ以上の分析に含まれるどの区分を決定する区分の長さを追加します。本研究では内頸動脈は、内頸動脈 T の近位の 1 mm と中大脳動脈頸動脈 t. の遠位の 2.5 mm から成る容器セグメントを評価しました。定義された血管の血管ボリュームを決定するために、ボリュームを加えます。</li>
</ol>

<ol><li>Macdonald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+neurological+deterioration+after+subarachnoid+haemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage.</a> Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).</li>
<li>Dorsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+review+of+cerebral+vasospasm+and+delayed+ischaemia+following+aneurysm+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplement%22%5BJournal%5D)">A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).</li>
<li>Vergouwen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+delayed+cerebral+ischemia+after+aneurysmal+subarachnoid+hemorrhage+as+an+outcome+event+in+clinical+trials+and+observational+studies%3A+Proposal+of+a+multidisciplinary+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group.</a> Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).</li>
<li>Friedrich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+has+no+therapeutic+effect+on+early+microvasospasm+after+experimental+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).</li>
<li>Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+subarachnoid+hemorrhage+causes+early+and+long-lasting+microarterial+constriction+and+microthrombosis%3A+An+in+vivo+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).</li>
<li>Terpolilli, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+inhalation+reduces+brain+damage%2C+prevents+mortality%2C+and+improves+neurological+outcome+after+subarachnoid+hemorrhage+by+resolving+early+pial+microvasospasms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).</li>
<li>Neulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+segmentation-based+volumetric+approach+to+localize+and+quantify+cerebral+vasospasm+based+on+tomographic+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data.</a> PLoS One. 12 (2), e0172010(2017).</li>
<li>Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A murine model of subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50845(2013).</li>
<li>Altay, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+subarachnoid+hemorrhage+to+induce+vasospasm+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).</li>
<li>Momin, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+delivery+of+nitric+oxide+inhibits+leukocyte+migration+and+prevents+vasospasm+in+haptoglobin+2-2+mice+after+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage.</a> Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).</li>
<li>Froehler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasospasm+after+subarachnoid+hemorrhage+in+haptoglobin+2-2+mice+can+be+prevented+with+a+glutathione+peroxidase+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurocience%22%5BJournal%5D)">Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic.</a> Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).</li>
<li>Lin, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm.</a> Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).</li>
<li>Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+intracranial+in+vivo+animal+models+of+delayed+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm.</a> British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).</li>
<li>Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+induction+of+subarachnoid+hemorrhage+in+mice+by+intracranial+pressure+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring.</a> Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Parra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+subarachnoid+hemorrhage+associated+cerebral+vasospasm%3A+methodological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis.</a> Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. 105 (e53208), (2015).</li>
<li>Marjamaa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+a+deletion+in+the+first+intron+of+the+Col1a1+gene+develop+dissection+and+rupture+of+aorta+in+the+absence+of+aneurysms%3A+High-resolution+magnetic+resonance+imaging%2C+at+4.7+T%2C+of+the+aorta+and+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).</li>
<li>Schambach, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+high-resolution+in+vivo+volume-CTA+of+mice+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels.</a> Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).</li>
<li>Figueiredo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+digital+subtraction+angiography%2C+micro-computed+tomography+angiography+and+magnetic+resonance+angiography+in+the+assessment+of+the+cerebrovascular+system+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice.</a> Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

SAH マウスモデルは、SAH の基礎研究の重要なツールです。脳血管攣縮はくも膜9,11後 DCI につながるメカニズムを調査研究のエンドポイントとしてよく使用されます。しかし、マウスの脳血管攣縮の定量化や出血の他の小さい動物モデルは挑戦にあります。血管内血流と鋳造7,9,12後定義された解剖学的ポイントで血管径の決定前のヴィヴォ、まわりの定量に血管攣縮を定量化する一般的には、組織学的に定義された船の10、11 をセクションします。ただし、これらのメソッドは、いくつかの欠点を持つ: 脳血管攣縮は定義された解剖学的ポイントにのみ評価隣接する船のセグメントの血管攣縮は評価されない可能性があります。組織の成果物は、エラーの別の原因を紹介します。さらに、血管径が測定した正確な位置は調査官によって決まるので、評価がかなり主観的でことができます。
目標は、容器全体の脳血管セグメント断面イメージング データ7から量を計算することによって脳血管攣縮を定量化する方法を確立するためでした。ここに示す体積法の最も重要な利点は、セグメントを調べることができますそのすべての船です。これは血管径は測定点の定義の必要があります。全体の容器のセグメントの評価のそれ以上の利点はそれがおそらくより近位または遠位血管の攣縮が免れることが定義されたポイントで血管径の決定よりも脳血管攣縮を定量化するより客観的パラメーターを提示評価。カラー コードを使用して血管のデジタル表現では、脳血管攣縮の程度の直感的な推定をことができます。さらに、体積の評価は、代表の結果に示すように、血管の評価と比較して冠攣縮性の船の大きな違いにつながります。ここで紹介した方法で達成仮想の復興血管の解剖学が正確に反映されます。した血管の直径測定顕微鏡とデジタル再構成からと同様に、以前の研究7の観測結果を再現した、代表的なシリーズの評価が表示されます。ただし、その利点にもかかわらずさらに研究が必要でここで紹介した方法は脳血管攣縮の分析の従来の方法よりも優れているかどうか評価します。
ここで紹介した方法の制限は、それは鋳造された脳試料の顕微解析または組織学的解析 (マイクロ CT スキャン時間脳サンプルでは、データ処理の脳サンプルあたり 45 分あたり 90 分) と比較してより多くの時間を与えることです。さらに、マイクロ CT スキャナーの可用性は、そのアプリケーションを制限があります。ここで検討した動物の数はこの原稿で説明されたプロトコルの実現可能性を実証するのに十分だったただし、治療研究では、プロトコルを使用する必要があります、動物の数字を計算するだろうは容器・ ボリュームと直径の期待される効果に基づいています。これと SAH モデルマウスを用いた他の研究のもう一つの制限は、決定前のヴィヴォ、血管攣縮があるとです。これにより縦断研究不可能 SAH 誘導と異なる時点で脳血管攣縮の前に基準値を検討します。調査はそれを示したマウス生体内の磁気共鳴断層撮影法18、腹部血管造影19、またはデジタル減算を使用しての大規模な頭蓋内血管の解剖学を描写することはマウス出血モデルにおける生体内で脳血管攣縮を分析するための造影20、これらのメソッドは、我々 の知識にはまだ使用されていません。注記のうち、ここに示す脳血管攣縮の後続の体積評価と脳の血管系のデジタル復興は前のヴィヴォマイクロ CT データの利用制限ではありません。マウスにおける高分解能血管クロス断面脳イメージングする必要があります、将来的に利用可能になる、体内の血管攣縮の容積測定分析を行うに使えるかもしれない。

Aneurysmatic くも膜下出血 (SAH)、出血性脳卒中のサブタイプは、neurointensive ケア単位で一般的な病気です。出血イベント自体によって引き起こされる脳の損傷を含む、初期の脳損傷 (海老) のほか患者のアウトカムを決定するもう一つの重要な要因は臨床によって定義された遅延虚 (DCI) 劣化障害脳血流や脳梗塞の血管内治療や外科的処置1,2,3に関連付けられていません。DCI に貢献する重要なメカニズムが、一方で; 大規模な脳血管攣です。一方、皮質拡散くぼみに関連する虚血と microthrombosis、微小血管の血管攣縮と微小循環不全 (Madonald 20141文献) 役割を果たします。したがって、大規模な脳血管攣縮の診断は臨床実習が重要、多くの臨床的および実験的研究で重要なエンドポイントが表示されます。
SAH マウスモデルで脳血管攣縮の機能が直接ではないという事実にもかかわらず SAH の患者、マウスの人物に譲渡すること関連血管攣縮されている意義を最後の年に成長しています。出血、血管内フィラメント穿孔4,5,6,7、8、9大槽内血管の断裂または CSF10 に血の注入に起因するこれらのモデルで ,11,12。大動物モデル SAH の伝統的血管攣縮13を勉強するように設計されたと対照をなしてマウスモデル トランスジェニック マウスを多数の菌株があります偉大な利点があります。これはそれらを血管攣縮と DCI に結びつく分子メカニズムを研究するための優れたツールとなります。ただし、マウスにおける脳血管攣縮の決定は難しいです。これと対照をなして大動物モデルの血管攣縮は臨床のイメージング技術を使用して検査すること生体内でマウスにおける脳血管攣縮を分析するイメージングはまだ利用できないためにです。したがって、脳血管攣縮は、いずれかの組織学的セクション10,11を使用してまたは顕微鏡的に後脳血管7,9,12鋳造決定されます。しかし、これらの技術はその容器の直径を定義されている地点でのみ検討が欠点を持っています。
以前研究7に基づいて、この原稿は SAH マウスモデルにおける目的と脳血管攣縮の再現性の解析手法を示す.メソッドは血流と脳血管、 ex vivoマイクロ CT スキャン、船の木のデジタル復興の鋳造に基づいて、後続ボリューム全体の脳血管の評価。

<table><tbody><tr><td>メデトミジン&nbsp;</td><td>ファイザー、カールスルーエ、ドイツ</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ミダゾラム</td><td>レシオファーム、ウルム、ドイツ</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>フェンタニル&nbsp;</td><td>Curamed, Karlsruhe, Germany</td><td>n.a.Venofix</td><td></td></tr> <tr><td>21G</td><td>B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td> <td>n.a.21G cannula&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコMgCl2およびCaCl2を含むリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany</td><td>D8662&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4%パラホルムアルデヒド溶液&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, ハンブルク, ドイツ</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>Microfil MV-122&nbsp;</td><td>Flowtech Inc., Carver, MA, USA</td> <td>n.a.Radiopaque</td><td></td></tr> <tr><td>Micro-CT system Y.Fox</td><td>Yxlon, Garbsen, Germany</td><td>n.a.Reconstruction</td><td></td></tr> <tr><td>Studio software version 1.2.8.1</td><td>TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany</td><td>n.a.Reconstruction</td> <td>software</td></tr><tr><td>Amira software version 5.4.2&nbsp;</td><td>FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA</td><td>n.a.Visualization</td> <td>software</td></tr><tr><td>PHD ultra syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3</td><td>Pressure controlled pump</td></tr><tr><td>anaatomical psps (blunt)</td><td>B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>160323_v&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Infinity X-21</td><td>Deltapix, Maalov, Denmark</td><td>n.a.</td><td>高解像度カメラ</td></tr><tr><td>DeltaPix Insightソフトウェアバージョン2.0.1</td><td>Deltapix, Maalov, Denmark</td><td>n.a.C57BL6</td><td></td></tr> <tr><td>mice</td><td>Charles River, Cologne, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

クモ膜下出血 (SAH) 出血性脳卒中のサブタイプであります。出血の余波で発生する脳血管攣縮患者のアウトカムを決定する重要なファクターで、研究のエンドポイントとしてよくしました。しかし、SAH の小動物研究、脳血管攣縮の定量化は大きな課題です。ここでは、脳血管攣縮を定量化する客観的評価尺度として使用することができますすべての船セグメントのボリュームの定量化をことができますex vivo法を示した。最初のステップで放射線不透過性のキャスティング エージェントを使って血管内脳血管系の鋳造を行います。その後、マイクロ コンピューター断層撮影による断面画像データが取得されます。最後の手順では、中心線と血管セグメントのボリュームを計算するアルゴリズムが続く仮想血管の木の 3次元再構築をします。メソッドは、自分の仮想復元と解剖学的試料の直径ベースの比較で示されている脳血管障害木の高精度な仮想再構成で起因しました。単独で血管と比較して、血管ボリュームは、SAH と sham 群のシリーズで示されている冠攣縮性と非冠攣縮性の船の相違点を強調表示します。

3 次元の頭蓋内血管ツリーの仮想再建
三次元再構成の頭蓋内血管の木には、非常に正確な血管解剖 (図 1) が用意されています。精度を評価するために行った血管顕微鏡的決定と 2 の解剖学的定義されたポイントで 3 次元仮想復元から直径ベース比較 (1: 左中大脳動脈 (MCA) を 1 mm の遠位、頸動脈 T;2: 右 MCA 1 mm T 頸動脈遠位)。血管の顕微鏡測定は、高解像度カメラ (無限 X-21, Deltapix) DeltaPix 洞察力ソフトウェア バージョン 2.0.1 とマイクロメータ スケールに調整されて使用しています。この評価のため 10 脳サンプル (5 出血、5 偽) を行った。これらは 7 間 5 偽手術 (術後日 1 と 2、それぞれ死亡した SAH グループの 2 動物) うち、SAH が誘導された 12 のマウスのシリーズからだった。(顕微鏡測定対仮想再建、頭蓋内血管解剖の正確なバーチャル再生を示す顕微鏡と事実上、径間に有意差はありませんでした。平均 ± 標準誤差: 左 MCA 150 ± 9 μ m対左 MCA 150 ± 8 μ m;MCA 153 ± 8 μ m対154 ± 9 μ m を右、図 2を参照)。
SAH とマウスにおける脳血管攣縮の定量化
(I) 2 解剖学的定義されたポイント (左と右 MCA) で直径 1 mm 内頸動脈 (ICA) と (ii) 船舶が、左側に 2.5 mm MCA で構成される、定義済みの代表的な 3.5 mm の血管のボリュームがあった脳血管攣縮を定量化するには、SAH および sham 動物から脳のサンプルで決定 (n = 5)。容器容積はシャムと比較して出血でかなり低かった (36 ± 4 nL対71 ± 9 p &lt; 0.05 nL)。血管が低かったシャムと比較して出血 (左 MCA: 140 ± 11 μ m対160 ± 10 μ m, p = 0.11; 右 MCA: 130 ± 13 μ m対158 ± 16 μ m, p &lt; 0.05;図 3を参照)、アナリストの重大さのレベルに達しただけ右 MCA のです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig1.jpg"> 図 1。頭蓋内血管ツリーの仮想再建。(A) 脳の代表的なサンプルを示しています。(B)は、対応する事実上再建血管のツリーを示しています。(C)は色分け左 MCA の直径の可視化です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig2.jpg"> 図 2.血管系のデジタル復元精度。平均直径は、病理組織学的に決定されたものと比較して 3 D 再構成脳サンプルから測定されます。データは、平均の平均 ± 標準誤差として表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig3.jpg"> 図 3.くも膜下出血後の血管径と血管ボリューム。SAH の 3 D 再構築した血管から(A) MCA 比較径測定と偽がマウス。SAH で(B)船舶ボリュームと偽がマウス。データは、平均の平均 ± 標準誤差として表示されます。p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

この記事の目標は、マイクロ コンピューター断層撮影で脳血管攣縮を定量化する使用ことができますすべての船セグメントのボリュームの決定後、マウスの脳血管の木の 3 次元再構成を可能にする方法を提示するにはくも膜下出血のマウスモデル。

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

この手順の全体的な目標は、くも膜下出血の誘発後のマウスの脳血管痙攣を定量化することです。これは、放射線不透過性鋳造剤を使用して、動物を経心臓灌流および血管内鋳造に供することによって達成されます。次のステップは、脳をマイクロコンピュータ断層撮影にさらすことにより、断面画像データを取得することです。その後、画像とデータが処理されます。Miro のソフトウェアは、頭蓋内血管ツリーを仮想的に再構築し、血管の痙攣を定量化するための客観的な尺度である定義された血管セグメントの体積を計算するために使用されます。くも膜下出血は、イソフルランによる麻酔下での血管内フィラメント穿孔によりマウスに誘発されます。左外頸動脈は外科的に準備されます。次に、フィラメントを外頸動脈に挿入し、頸動脈tに穿孔された内頸動脈を通って頭蓋内に進行させ、くも膜下出血を誘発します。頭蓋内圧の上昇は、血管内穿孔が成功したことの指標と見なされます。血管痙攣を分析するには、麻酔を誘発します。十分な麻酔レベルに達した後にのみ続行し、これは痛み刺激に対する反応がないことによって確認されます。以下の溶液を用いて経cardiac 灌流を行います。ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの生理学的濃度をpH7ポイント4で含む生理的塩溶液。そしてその後、4%PFA溶液。溶液番号 1 で 2 分間増殖を開始し、溶液 2 で 4 分間続けます。37°Cの温度で溶液を注入し、可変灌流速度の圧力制御ポンプを使用して、70ミリメートル水銀の一定圧力で灌流します。ソリューション 1 からソリューション 2 に切り替える際の圧力損失を回避します。両方の溶液による灌流後、放射線不透過性鋳造剤を用いて室温で20分間灌流を1分あたり2ミリリットルの一定速度で継続する。放射線不透過性鋳造材料を硬化させるためのサンプルを摂氏4度で一晩保持します。そして、脳を取り出し、サンプルを摂氏4度で4%PFA溶液にマイクロセチシンするまで保存します。鈍い解剖学的鉗子を備えたプラスチックチューブの真ん中に脳を置きます。サンプルよりもわずかに大きい直径のチューブを選択して、画像取得中に物体が動かないようにします。ガーゼを使用してチューブを閉じます。X線キャビン内のコンピュータナビゲート制御位置決めシステムのマイクロステッピングモーターを介してプラスチックチューブを取り付け、物体がその水平軸を中心に回転します。X線X線撮影下の視野にサンプルを位置合わせします。最大倍率を達成するには、物体をX線源にできるだけ近づけて配置し、検出器までの距離をできるだけ最大にします。ステップを使用して、次のスキャンパラメータで画像取得プロトコルを撮影します。投影ごとに露光時間を1秒に設定し、80キロボルトの真空管電圧を使用して信号対雑音比を最適化します。1 回転の投影数を 1, 000 に設定します。生データの再構築には、フィルタリングされた後方投影アルゴリズムを使用し、1, 024立方ボクセルの行列を持つShepp-Loganフィルターを意味します。dicom データを Miro のソフトウェアにインポートするには、import 関数を使用します。関数 vol-run を使用して容器ツリーを可視化します。視覚化のしきい値を選択して、大きな大脳動脈がシャープな輪郭で描かれるようにします。実験系列に属するすべてのデータセットに対して同じ可視化しきい値を使用することが重要です。Circle of Willisの基底大脳動脈を仮想的に解剖し、血管をカーゾンで囲むことにより機能ボリュームを追加します。次に、分析する血管セグメントを仮想的に分析します。したがって、血管樹の3次元モデルを回転させて、すべての小さな枝を主動脈から正確に分離します。さらなる解析では、解析対象の容器セグメントを除くすべての容器を削除することが不可欠です。関数 auto skeleton with threshold を可視化しきい値に適用すると、中心線に基づく空間グラフが生成されます。次に、関数 spatial graph を線セットに適用して、線セットを作成します。カーソルで単一のサブセグメントを手動で選択し、分割をクリックして、ラインセットを単一のサブセグメントに分割します。この手順は、単一のサブセグメントの体積を計算するために重要です。空間グラフに設定された関数線を使用して、空間グラフを再度作成します。関数空間グラフ統計を使用して、各サブセグメントの長さ、体積、および直径を決定します。船舶の直径の経過を表す色分けされた視覚化には、機能空間グラフ ビューを使用します。セグメントの色分けを、容器の直径と相関する厚さに設定します。実験系列に属するすべてのデータセットに対して同じカラーマップを選択することが重要です。サブセグメントの長さを追加して、どのサブセグメントを詳細な分析に含めるかを決定します。本研究では、頸動脈tの近位にある内頸動脈の1mmと、頸動脈tの遠位にある大脳動脈の5mmの2点からなる血管セグメントを評価した。次に、ボリュームを追加して、定義された容器セグメントの容器体積を決定します。血管樹の仮想再構成の精度を評価するために、顕微鏡で決定された血管直径と、10個の脳サンプルの解剖学的に定義された2つの点での3D仮想再構成から決定された血管直径との間の直径ベースの比較を実行しました。容器の直径の顕微鏡測定には、高解像度カメラ、ソフトウェアキャリブレーションツール、マイクロメートルスケールを使用しましたが、顕微鏡で決定された直径と仮想的に決定された直径の間に大きな違いはありませんでした。頭蓋内血管の解剖学的構造の正確な仮想再構成を示しています。脳基底痙攣を定量化するために、左側の 1 mm IC8 と 2 点 5 mm MCA で構成される、事前定義された代表的な 3 点 5 mm 血管セグメントの体積を決定しました。SAHおよび偽手術動物からの脳サンプル。SAHでは、偽血管と比較して血管容積が有意に少なく、脳血管痙攣を示しています。血管の直径も、偽と比較してSAHで有意に低かった。ここで紹介した方法で達成された仮想再構成は、血管の解剖学的構造を正確に反映しています。血管セグメント全体を調べることができ、おそらく、血管痙攣を定量化するための客観的なパラメータを、一点での血管径の決定よりも提示します。容積評価は、血管の直径のみの評価と比較して、血管痙攣性血管と非血管痙攣性血管の間に大きな差をもたらします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

動脈瘤性くも膜下出血（SAH）は時動脈瘤破裂くも膜下腔に発生する出血です。このイベントの罹患率と死亡率が改善された治療アプローチのために減少傾向にあったが、くも膜下出血後の脳血管攣縮のリスクは、それが数年前と同じであり続けている。脳血管攣縮の開始事象を識別するために、包括的かつ再現可能な動物モデルを確立することの重要性は、バリーが1979年に実験的脳血管攣縮モデルにおけるラットの最初の使用以来、研究の焦点となっている...

実験的くも膜下出血後の脳血管攣縮遅延を評価するための低死亡率のラットモデル

このビデオでは、くも膜下出血ラットモデルを確立する手順を示しています。麻酔をかけたラットにプローブを埋め込み、頭蓋内圧と脳血流を測定します。標的部位が特定され、針が視交叉前位置に挿入されます。その後、くも膜下腔に自家血液を注入し、頭蓋内圧を上昇させ、脳血流を減少させ、モデルを確立します。...

自家血液注射によるくも膜下出血ラットモデルの確立

ウィリス穿孔の管腔内サークルによるくも膜下出血の標準化されたマウスモデルが記載されている。血管穿孔やくも膜下出血は頭蓋内圧監視によって監視されています。さらに、種々の重要なパラメータが記録され、生理学的条件を維持するように制御される。...

くも膜下出血のマウスモデル

このプロトコルは、マウスにおける一過性中大脳動脈閉塞後の梗塞容積と血液脳関門の破壊を減少させる反復的な低酸素プレコンディショニング、または全身性低酸素症への短時間の曝露について説明しています。また、脳卒中後の梗塞容積と血液脳関門の破壊の二重定量化についても詳しく説明し、神経血管保護の有効性を評価します。...

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

我々は、このプロトコルにおいて、システルナマグナへの自家全血の二重注入による標準化されたくも膜下出血(SAH)マウスモデルを説明した。二重注入手順の高度な標準化は、死亡率に関する相対的な安全性を有するSAHの中急性モデルを表す。...

くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

本稿の目的は、マウスにおける大脳動脈の血流の インビボ イメージングを可能にするソノグラフィーベースの方法を提示することである。我々は、くも膜下出血(SAH)のマウスモデルにおける血管れん縮に伴う血流速度の変化を決定するための応用を実証する。...

高周波経頭蓋二重超音波を用いたくも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管れん縮の解析

くも膜下出血は、ヒトにおける死亡率および罹患率の高い負担を負い続けている。状態とその病態生理学のさらなる研究を容易にするために、交叉前の単回注射モデルが提示されます。...

ラットモデルにおける実験的くも膜下出血を誘発するための自己血の交叉前単回注射

ここでは、血管内フィラメント穿孔によって誘導された標準化されたSAHマウスモデルを、手術後24時間で磁気共鳴画像法(MRI)と組み合わせて、正しい出血部位を確保し、他の関連する頭蓋内病変を排除する。...

くも膜下出血の血管内穿孔モデルと磁気共鳴画像法(MRI)の組み合わせ

このプロトコルで説明されているマウスの脳内出血の自家血注入モデルでは、針のトラックまでの血液逆流、ポンプシステムにおける無抗凝固剤のリスクを最小限に抑えるために二重注入の技術を使用し、システム内のすべてのデッドスペースと拡張可能なチューブを排除。...

マウスにおける自発脳内出血をモデル化する自家血注入

シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する...

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

学ぶ くも膜下出血後の脳血管攣縮をマウスモデルで定量化する方法。マイクロCTと血管内キャスティングを用いて3D再構成し、血管体積を測定することで客観的な評価を可能にする。

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

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