くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積
2018年7月28日
この記事の目標は、マイクロ コンピューター断層撮影で脳血管攣縮を定量化する使用ことができますすべての船セグメントのボリュームの決定後、マウスの脳血管の木の 3 次元再構成を可能にする方法を提示するにはくも膜下出血のマウスモデル。
この手順の全体的な目標は、くも膜下出血の誘発後のマウスの脳血管痙攣を定量化することです。これは、放射線不透過性鋳造剤を使用して、動物を経心臓灌流および血管内鋳造に供することによって達成されます。次のステップは、脳をマイクロコンピュータ断層撮影にさらすことにより、断面画像データを取得することです。
その後、画像とデータが処理されます。Miro のソフトウェアは、頭蓋内血管ツリーを仮想的に再構築し、血管の痙攣を定量化するための客観的な尺度である定義された血管セグメントの体積を計算するために使用されます。くも膜下出血は、イソフルランによる麻酔下での血管内フィラメント穿孔によりマウスに誘発されます。
左外頸動脈は外科的に準備されます。次に、フィラメントを外頸動脈に挿入し、頸動脈tに穿孔された内頸動脈を通って頭蓋内に進行させ、くも膜下出血を誘発します。頭蓋内圧の上昇は、血管内穿孔が成功したことの指標と見なされます。
血管痙攣を分析するには、麻酔を誘発します。十分な麻酔レベルに達した後にのみ続行し、これは痛み刺激に対する反応がないことによって確認されます。以下の溶液を用いて経cardiac 灌流を行います。
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの生理学的濃度をpH7ポイント4で含む生理的塩溶液。そしてその後、4%PFA溶液。溶液番号 1 で 2 分間増殖を開始し、溶液 2 で 4 分間続けます。
37°Cの温度で溶液を注入し、可変灌流速度の圧力制御ポンプを使用して、70ミリメートル水銀の一定圧力で灌流します。ソリューション 1 からソリューション 2 に切り替える際の圧力損失を回避します。両方の溶液による灌流後、放射線不透過性鋳造剤を用いて室温で20分間灌流を1分あたり2ミリリットルの一定速度で継続する。
放射線不透過性鋳造材料を硬化させるためのサンプルを摂氏4度で一晩保持します。そして、脳を取り出し、サンプルを摂氏4度で4%PFA溶液にマイクロセチシンするまで保存します。鈍い解剖学的鉗子を備えたプラスチックチューブの真ん中に脳を置きます。
サンプルよりもわずかに大きい直径のチューブを選択して、画像取得中に物体が動かないようにします。ガーゼを使用してチューブを閉じます。X線キャビン内のコンピュータナビゲート制御位置決めシステムのマイクロステッピングモーターを介してプラスチックチューブを取り付け、物体がその水平軸を中心に回転します。
X線X線撮影下の視野にサンプルを位置合わせします。最大倍率を達成するには、物体をX線源にできるだけ近づけて配置し、検出器までの距離をできるだけ最大にします。ステップを使用して、次のスキャンパラメータで画像取得プロトコルを撮影します。
投影ごとに露光時間を1秒に設定し、80キロボルトの真空管電圧を使用して信号対雑音比を最適化します。1 回転の投影数を 1, 000 に設定します。生データの再構築には、フィルタリングされた後方投影アルゴリズムを使用し、1, 024立方ボクセルの行列を持つShepp-Loganフィルターを意味します。
dicom データを Miro のソフトウェアにインポートするには、import 関数を使用します。関数 vol-run を使用して容器ツリーを可視化します。視覚化のしきい値を選択して、大きな大脳動脈がシャープな輪郭で描かれ
るようにします。実験系列に属するすべてのデータセットに対して同じ可視化しきい値を使用することが重要です。Circle of Willisの基底大脳動脈を仮想的に解剖し、血管をカーゾンで囲むことにより機能ボリュームを追加します。次に、分析する血管セグメントを仮想的に分析します。
したがって、血管樹の3次元モデルを回転させて、すべての小さな枝を主動脈から正確に分離します。さらなる解析では、解析対象の容器セグメントを除くすべての容器を削除することが不可欠です。関数 auto skeleton with threshold を可視化しきい値に適用すると、中心線に基づく空間グラフが生成されます。
次に、関数 spatial graph を線セットに適用して、線セットを作成します。カーソルで単一のサブセグメントを手動で選択し、分割をクリックして、ラインセットを単一のサブセグメントに分割します。この手順は、単一のサブセグメントの体積を計算するために重要です。
空間グラフに設定された関数線を使用して、空間グラフを再度作成します。関数空間グラフ統計を使用して、各サブセグメントの長さ、体積、および直径を決定します。船舶の直径の経過を表す色分けされた視覚化には、機能空間グラフ ビューを使用します。
セグメントの色分けを、容器の直径と相関する厚さに設定します。実験系列に属するすべてのデータセットに対して同じカラーマップを選択することが重要です。サブセグメントの長さを追加して、どのサブセグメントを詳細な分析に含めるかを決定します。
本研究では、頸動脈tの近位にある内頸動脈の1mmと、頸動脈tの遠位にある大脳動脈の5mmの2点からなる血管セグメントを評価した。次に、ボリュームを追加して、定義された容器セグメントの容器体積を決定します。血管樹の仮想再構成の精度を評価するために、顕微鏡で決定された血管直径と、10個の脳サンプルの解剖学的に定義された2つの点での3D仮想再構成から決定された血管直径との間の直径ベースの比較を実行しました。
容器の直径の顕微鏡測定には、高解像度カメラ、ソフトウェアキャリブレーションツール、マイクロメートルスケールを使用しましたが、顕微鏡で決定された直径と仮想的に決定された直径の間に大きな違いはありませんでした。頭蓋内血管の解剖学的構造の正確な仮想再構成を示しています。脳基底痙攣を定量化するために、左側の 1 mm IC8 と 2 点 5 mm MCA で構成される、事前定義された代表的な 3 点 5 mm 血管セグメントの体積を決定しました。
SAHおよび偽手術動物からの脳サンプル。SAHでは、偽血管と比較して血管容積が有意に少なく、脳血管痙攣を示しています。血管の直径も、偽と比較してSAHで有意に低かった。
ここで紹介した方法で達成された仮想再構成は、血管の解剖学的構造を正確に反映しています。血管セグメント全体を調べることができ、おそらく、血管痙攣を定量化するための客観的なパラメータを、一点での血管径の決定よりも提示します。容積評価は、血管の直径のみの評価と比較して、血管痙攣性血管と非血管痙攣性血管の間に大きな差をもたらします。
概要
この研究は、クモ膜下出血後の脳血管痙攣を定量化するために、マウスの脳血管木の3D再構成方法を提示しています。この技術は、経心臓灌流、血管内キャスティング、および高度な画像処理を組み合わせて血管体積を測定します。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 脳血管研究
- イメージング技術
背景
- クモ膜下出血後の脳血管痙攣は重要な合併症です。
- 血管反応を理解することは治療戦略を開発するために不可欠です。
- 3D再構成は血管の変化についての洞察を提供し、血管痙攣の重症度を定量化できます。
- 現在の方法は、傷害後の血管の変化を測定する精度が不足している可能性があります。
研究の目的
- マウスにおける脳血管痙攣を定量化する信頼できる技術を確立すること。
- クモ膜下出血後の脳血管の変化についての理解を深めること。
- 血管形態と機能の客観的な評価を促進すること。
使用された方法
- 研究では、脳血管系のイメージングにマイクロCTを使用しました。
- マウスはクモ膜下出血の誘発後に血管内キャスティングを受けました。
- 主要なステップには、生理的溶液と造影剤を使用した経心臓灌流が含まれました。
- イメージングとデータはMiroソフトウェアを使用して処理され、血管構造を視覚化および分析しました。
- 血管径の正確な測定は、顕微鏡的再構成と仮想再構成間で比較されました。
主な結果
- この方法により、頭蓋内血管木の精密な3D再構成が可能でした。
- 顕微鏡的方法と仮想的方法の間で血管径の測定に有意な差がなく、高い精度を示しました。
- 血管セグメント分析は、血管痙攣の重症度を評価するための客観的な指標を提供しました。
- この研究は、データセット全体の一貫性のための標準化されたイメージング閾値の重要性を強調しました。
結論
- この研究は、マウスモデルにおける脳血管痙攣を評価する新しく正確な方法を示しています。
- それは出血性傷害後の血管変化を定量化する能力を向上させます。
- この結果は、脳血管力学を理解し、新しい治療アプローチを開発するための重要な意味を持っています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying cerebral vasospasm in preclinical models remains a critical challenge in stroke drug development, where objective vascular metrics are needed to de-risk mechanistic hypotheses and support go/no-go decisions. This volumetric method provides a reproducible, imaging-based readout that enhances predictive confidence in target validation by moving beyond single-point diameter measurements to integrated vessel segment analysis. Its application in murine SAH models enables standardized assessment of vascular pathology, supporting translational continuity from discovery through preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing objective volumetric metrics of cerebral vasospasm as a pathophysiological endpoint.
- Operational Value: Supports biological de-risking through accurate 3D reconstruction of the cerebrovascular tree, reducing reliance on indirect or single-point measurements.
- Predictive Value: Enhances target confidence by quantifying vascular changes across entire vessel segments, improving correlation with functional outcomes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative vessel volume outputs that enable reliable comparison between experimental conditions in vasospasm models.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow combining transcardiac perfusion, endovascular casting, and micro-CT imaging for consistent vascular phenotyping.
- Scalability: Facilitates platform reuse across studies by maintaining fixed visualization thresholds and segmentation protocols for longitudinal or comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase vascular quantification to preclinical validation by providing a disease-relevant system that mirrors clinical vasospasm pathology.
- Mechanistic De-risking: Enables objective assessment of vasospasm severity, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Predictive Confidence: Volumetric evaluation demonstrates greater sensitivity to vasospastic changes than diameter-only metrics, improving the predictive value of preclinical findings.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and vascular phenotype validation in translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying vasospasm as a measurable biological response to subarachnoid hemorrhage.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative vascular outputs with high reproducibility, enabling reliable compound or genotype comparisons.
- Analytics: Provides volumetric, length, and diameter measurements from spatial graph statistics, offering multidimensional readouts for condition comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by delivering disease-relevant vascular metrics that can inform biomarker-aligned efficacy assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized vascular quantification platform applicable across multiple cerebrovascular injury models beyond SAH.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through objective, volumetric quantification of cerebral vasospasm.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fixed imaging thresholds, perfusion protocols, and semi-automated 3D reconstruction workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in vasospasm modeling, lowering late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on robust preclinical vascular phenotype data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, perfusion techniques, and micro-CT operation for successful vascular casting and imaging.
- Depends on access to microcomputed tomography systems and 3D visualization software (e.g., Miro) for image acquisition and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of visualization thresholds and segmentation protocols to ensure consistency across experimental groups.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different vessel segments or model systems, validated through diameter-based accuracy checks.
- Limited by the ex vivo nature of the assay, which captures endpoint vascular morphology but not real-time dynamic vasospasm progression.
