Name: 哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぶCRISPR実験用sgRNA発現プラスミドのワンステップクローニング法。Golden Gate法によるペアガイドRNA作成と大腸菌変換を含む効率的な遺伝子工学手法を解説する。

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Sathiji Nageshwaran は、フリードライヒ失調症研究アライアンスによってサポートされている (07340305-01) および国民運動失調財団フェローシップ (7355538-01)。アレハンドロ チャベスは、医療科学者の国立癌研究所助成金 5T32CA009216-34 とバローズ Wellcome 基金キャリア賞によって賄われていた。ジョージ ・ m ・教会によって、米国国立衛生研究の健康 (NIH) はサポートされて国立ヒトゲノム研究所助成金 RM1 HG008525 と生物学的影響を与えた工学研究所ウィース。ジェームズ ・ j ・ コリンズは、防衛脅威の減少代理店グラント HDTRA1-14-1-0006 とポール g. アレン フロンティア グループの支援を認めています。アレハンドロ チャベスは、デュアル ガイド クローニング法を開発しました。ナン シェール ヨ、アレハンドロのチャベス大統領は、Sathiji Nageshwaran は、すべての著者から入力の原稿を書いた。

<ol><li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li>
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<li>Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), e147(2014).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4 (1), (2014).</li>
<li>Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sgRNA+Scorer+2.0%3A+A+Species-Independent+Model+To+Predict+CRISPR%2FCas9+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).</li>
<li>Doench, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).</li>
<li>The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs">http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs</a> (2015).</li>
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<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+Is+a+Single+RNA-Guided+Endonuclease+of+a+Class+2+CRISPR-Cas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
</ol>

ジョージ ・ m ・教会が Editas とカリブー生命機能研究科 CRISPR Cas9 ゲノム編集技術を商業化する目的で資本 (完全な情報開示一覧については、http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html を参照してください)。

GRNA 発現ベクター構築が数時間とコストを節約変更されました。対 gRNA 発現用ベクター構築の方法だけでなく、シングル ステップ制限およびライゲーション プロトコルを説明します。対 gRNA 式は前方 gRNA ターゲット シーケンス (n20) と別のターゲット (n20) 逆の補数の両方を含むオリゴヌクレオチドを使用して pcr によって実現されます。これはそこで従来単一 gRNA 発現プラスミドを表現 sgRNA 尾だけでなく、セカンダリ RNA Pol III プロモーター (7SK) を紹介します。
注意オリゴヌクレオチド設計対 gRNA 建設だけでなく、粘着性がある端結紮のため正常な PCR が保証されます。次のシングル ステップの制限および ligation の反作用、さらに BsmBI の付加反応ですべて変更されていない表現のベクトルをカットになります。これは、変換時に背景を削減します。30 ° C で NEB 安定した有能なエシェリヒア属大腸菌と成長を使用して、成功した変換の増収します。
この手法は、一般的なベスト プラクティス メリット オリゴヌクレオチド gRNA 発現ベクターのシングル ステップの制限と、オリゴヌクレオチドおよび従来を活用する能力の結紮、熱処理の工程の簡略化単一 gRNA 対ガイドの表現のための表現のベクトル。プロトコルはここで哺乳類のベクトルのセットに焦点を当てて説明、一般的な戦略はプラスチック、すべての生物に適用できる適切な gRNA ベクトルが利用できます。全体的にみて、説明されたプロトコルは、時間とコストを保存します。
ただし、個々 のオリゴヌクレオチドを購入の輪郭を描かれたプロシージャが gRNAs の数千を含むライブラリの生成にも対応していません。それらの目的オリゴヌクレオチド合成オリゴ チップ合成などの代替エネルギー源をお勧めします。
GRNAs を複製する際の挿入コントロールを含めることが有益です。この反応は興味の反応と並行を簡単に設定することができます、開始のベクトルの不完全な消化力がプロシージャの最後で観測された植民地に貢献しているかどうかを決定するため使用することができます。さらに、不完全消化ベクター バックボーンまたは貧しいライゲーション効率のため上記のクローニング プロトコルの 1 つが故障した場合、クローニング法概説した代替をしようとしているをお勧めします。
クローニング ベクトルをダイジェストと単一の反作用の内で小さいオリゴヌクレオチドで縛ると同時にゴールデン ゲートを使用する場合それは t につながるベクターにクローンを作成する gRNA に、BsmBI サイトが設定されていないことを確認することが重要カットされて彼 gRNA と変換時にコロニーの不在。
記載されている戦略をクローン作成 gRNA は、オリゴヌクレオチドの合成とシーケンスの検証から来るコストの大部分をガイド、1 〜 10 ドルで gRNAs の迅速かつコスト効果の高い生成を有効。 にします。プロトコルは Cas9 第オーソロガスまたはベクター バックボーンにわずかな変更で Cpf1 や C2C2 などその他の RNA 誘導酵素で使用する合わせることが簡単にできるアウトライン メソッドは SpCas9 で使用するための gRNAs を生成するユーザーを許可するように設計されていますが、オリゴヌクレオチドのオーバー ハングは、16,17 をシーケンスします。
上記で説明したプロトコルは、シーケンス確認 gRNA 発現プラスミド (適切に設計されたオリゴヌクレオチドで始まる)、3 d 現在の方法よりも大幅に高速であります。これは含まれています 1 h (ステップ 1 2.3) と希釈 10 分 (ステップ 3 5.1)、消化 2 h (ステップ 6 6.4)、predi への gRNA オリゴヌクレオチドのクローニングの pSB700 gRNA 発現ベクターの浄化のオリゴヌクレオチドの因数の gRNA デザインgested pSB700 gRNA 発現ベクターは宿泊部屋の温度 (ステップ 7 7.3)、3 時間 40 分 (ステップ 8-8.4) のシングル ステップ BsmBI 制限結紮、16 h (手順 9 9.6) の変換、gRNA 発現プラスミドのシーケンスの検証24 h の (サンガー シーケンス可用性と次の細菌のコロニーの送信速度に応じて期間 10 のステップ)。対 gRNA 設計やシーケンス変更 1 h (手順 11-13) がかかります。対 gRNA PCR 3.5 h (手順 14 14.4) がかかります。3 時間 40 分 (ステップ 15-16) は、pSB700 ベクトルに PCR のフラグメントのクローニングします。
このプロトコルに直面する可能性が高い問題は、ゴールデン ゲート アセンブリの変換効率に関連します。アセンブリの効率を視覚化するゴールデン ゲート組み立て中の挿入コントロールを含めます。変換、puc19 の肯定的な制御は変換効率制御を提供します。NEB 安定大腸菌はレンチ ウイルスの互換性のあるプラスミッドのため使用する必要があり、目に見えるコロニーに屈する 30 ° c まで > 16 h を頻繁に必要があります。

CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) は、適切に設計された小さなガイド RNA (gRNA)1,2と複合体を形成するとき必要なゲノム目標に向かって指示される RNA 誘導エンドヌクレアーゼです。gRNAs は、ゲノムのターゲット シーケンスに相補的な 20 塩基配列シーケンス (protospacer) を構成します。ゲノムのターゲットの横にあるシーケンスは、3' protospacer 関連付けられたモチーフ (PAM)、Cas9 バインディングに必要であります。連鎖球菌感染症の Cas9 の場合 (SpCas9)、これは NGG のシーケンス。DNA ターゲットを結合、時に、Cas9 は、DNA、それにより関心の軌跡を変更するのには悪用することができます修復機構を刺激することの両方の鎖を裂きます。エラーが発生しやすい非相同末端結合 (NHEJ) 経路の活性化は、ターゲット遺伝子の混乱を可能性があります。また、修理で相同組換え刺激することが目的の DNA シーケンスの対象となる統合6ドナー テンプレートを指定した場合。ヌクレアーゼ死者 Cas9 (dCas9) のバリエーションも endonucleolytic 活動に欠かせない Cas9 内残基の変異によって生成された3をすることができます。dCas9 は、DNA 結合の能力のまま、そのバインドされているターゲットを切らないように。様々 なエフェクター ドメイン dCas9 を融合、遺伝子の転写開始部位に近い演出による選択的遺伝子発現誘導の部分のジーンサイレンシングの4,5dCas9 を使用できます。
信じられないほど強力なユーザーがまずターゲット サイトにユニークな gRNA を生成する Cas9 を使用して興味のゲノム シーケンスをターゲットにする能力が必要です。GRNA の発現ベクターを構築するための方法の様々 な以前、さまざまな効率の多くを説明して6,7,8のコストします。スタンドアロンの PCR 産物は、数時間内トランスフェクションするオリゴヌクレオチド配信からの急速なスクリーニングのため gRNAs として使用することがあります。ただし、Ultramer が必要です (以上 100 bp) オリゴ合成、高価な9であります。また、Ultramers よりも費用が gBlocks を購入することが可能です。Cas9 急速に現代分子生物学ツールキットの不可欠なコンポーネントとなっている、gRNA のクローニングのためのシンプル、安価で、非常に効率的な方法は、フィールドに恩恵をもたらすでしょう。ここで説明する方法は、2,000 以上のユニークな gRNAs4を生成する私たちのグループと過去数年間の共同研究所で採用されています。
アウトライン メソッドは、単一の gRNA またはせいぜい 2 つ gRNAs を含む互換性レンチウイルスベクターのクローニングのためのテクニックについて説明します。世代は、2 つ以上の gRNAs を含んでいるプラスミッドのまたは gRNAs のライブラリを複製する、代替的なアプローチは9、10、11,12が推奨されます。

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>酵素/ニューイングランド バイオラボ</td><td>L6030-LC-L/M0202S</td><td></td></tr><tr><td>バッファー 3.1</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 (ATP)</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップ キット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Chemically Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019l, C2987l, or C3040H</td><td></td></tr><tr><td>標準微量遠心チューブ, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 8-Strip PCR tubes</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-222-250</td><td></td></tr><tr><td>プログラム可能な温度ステッピング制御付きサーモサイクラー</td><td>BioRad,1851148</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UV分光光度計 (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSB700 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>#64046</td><td></td></tr><tr><td>NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)</td><td>New England Biolabs</td><td>c3040</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny broth (LB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSN007プラスミド</td><td>Addgene</td><td><a href="https://www.addgene.org/102440/">102440</a></td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類システムのクローン作成 crispr ガイド rna

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

輪郭を描かれたプロトコルは、効率的かつコスト効果の高い世代 Cas9 関連ガイド Rna の合理化された方法を説明します。互換性のあるベクトルのセットとの組み合わせで IIS 型制限酵素 BsmBI の使用率に基づくガイド RNA (gRNA) のクローニングのための 2 つの代替戦略のとおりです。生成されたベクトルを検証するサンガー シーケンス サービスへのアクセス、外特別な装置や試薬必要はありません以外現代分子生物学研究所に標準となっています。アウトライン メソッドは一度に 1 つの単一の gRNA または 1 つのペアの gRNA 表現のベクトルのクローニングのためのものでは主に。この手順は、gRNAs の数千を含むライブラリの生成は、スケーリングしません。それらの目的オリゴヌクレオチド合成オリゴ チップ合成などの代替エネルギー源をお勧めします。最後に、このプロトコルは哺乳類のベクトルのセットに焦点を当てて、一般的な戦略はプラスチック、すべての生物に適用できる適切な gRNA ベクトルが使用可能な場合。

このプロトコルで説明する方法は、どちらかのシングルまたはペアの gRNA 発現ベクターの作成です。ベクトルを表現する 1 つの gRNA を作成するいずれかの後に短いオリゴヌクレオチドのシリーズで縛ることまたはクローニング ベクター バックボーンを同時に消化し、それを縛るゴールデン ゲートを使用してベクター バックボーン (図 1) を用いなければな単一の反作用で短いオリゴヌクレオチドのシリーズ。カスタムの PCR のフラグメント (図 2) を複製することによって、独自の独立したプロモーターの駆動 2 gRNAs を含まれているベクトルを作り出す方法もまた提供されます。
アウトライン化されたプロトコルのいずれかの巧妙なクローニングは、なし挿入コントロール プレート (図 3) により適切な挿入 DNA を使用した変換のはるかに大きなコロニーの外観になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig1.jpg"> 図 1: pSB700 gRNA 発現ベクターの消化します。1% アガロースゲルを使用します。レーン 1: ノーカット pSB700。レーン 2: pSB700 は BsmBI でカット。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig2.jpg"> 図 2: gRNA PCR をペアします。1% アガロースゲルを使用します。レーン 1: ~ 490 のペア ガイド PCR フラグメント bp。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig3.jpg"> 図 3: 成功のクローニングと gRNA プラスミドの変換。左側のパネルは LB を示しアンピシリン プレートは正常にコロニーを変換します。右側のパネルでは、植民地を示さないなし挿入コントロール プレートを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57998/57998fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>pSB700 ガイド発現ベクター</td>
			<td>1-5 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEB バッファー 3.1</td>
			<td>4 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>蒸留水</td>
			<td>40 μ L まで</td>
		</tr>
<tr>
<td>総容積</td>
			<td>40 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: BsmBI と pSB700 gRNA 発現ベクターの制限消化。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>軟 gRNA oligos (単一引用符またはプールされた反応)</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI 消化 pSB700 ガイド発現ベクター</td>
			<td>1 μ L (100 ~ 250 ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 DNA リガーゼ反応バッファー x 10</td>
			<td>2 μ L (終濃度 x 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 DNA リガーゼ</td>
			<td>1 μ L (120 台)</td>
		</tr>
<tr>
<td>蒸留水</td>
			<td>15 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>総容積</td>
			<td>20 μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 結紮の反応 gRNA オリゴヌクレオチド損なった pSB700 gRNA 発現ベクターに。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>ボリューム (1 x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>T4 リガーゼ</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>BsmBI</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEB バッファー 3.1</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ベクトル (例えばpSB700) (40 fmol)</td>
			<td>1 μlL</td>
		</tr>
<tr>
<td>-前方の挿入し、逆 oligos またはデュアル ガイド (40fmol) のための PCR のフラグメント</td>
			<td>1 μ L (0.5 μ L 前方と逆 0.5 μ L)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: シングル ステップ BsmBI 制限と gRNA の ligation の反作用をミックスします。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 ガイド</td>
			<td>シーケンス 3 コロニー</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ガイド</td>
			<td>5-10 コロニーをシーケンスします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 ガイド</td>
			<td>10-15 コロニーをシーケンスします。</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ガイド</td>
			<td>15-20 コロニーをシーケンスします。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: 反応のクローン作成プール gRNA のシーケンスにコロニーの推奨される数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PCR コンポーネント</td>
			<td>50 μ L 反応</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μ M 前方プライマー</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 μ M 逆プライマー</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x Phusion HF または GC バッファー</td>
			<td>10 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>テンプレート DNA</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phusion DNA ポリメラーゼ</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヌクレアーゼ フリー水</td>
			<td>50 μ L まで</td>
		</tr>
</tbody></table>表 5: 対 gRNA PCR の混合。

ここでは、シンプルで効率的と sgRNA のクローニングのコスト効果の高い方法の通りです。

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

この方法は、CRISPRを促進する実験のためのガイドRNA発現プラスミドの作成を容易にすることを可能にする。この技術の主な利点は、クローニングを単一ステップで行うことができることと、シングルガイドRNA発現プラスミドを使用してペアガイドRNAを作成できることです。このプロトコルを開始するには、凍結乾燥したプライマーを1X TEバッファーで希釈し、最終濃度の100マイクロモルにします。アリコートは、PCRストリップキャップチューブにフォワードとリバースプライマーの同量。混ぜる渦。次に、ガイドRNAオリゴヌクレオチド混合物をGの100倍で15秒間スピンダウンします。ライゲーションを設定する前に、室温で5分間反応をインキュベートします。選択したPSB700ガイド発現ベクターの1~5マイクログラムを、ベクトル1マイクログラムあたり0.5マイクロリットルのBSNB1を使用してBSNB1に追加します。総容量が40マイクロリットルになるまで蒸留水を加え、摂氏55度で1時間消化を行います。1.5%低融解アガロースゲルで消化製品を実行します。約9キロベースのフラグメントに対応する消化されたベクターバックボーンバンドを切り取ります。このゲルスライスを1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。市販のゲル精製キットを使用して、メーカーの指示に従ってアガロースゲルからDNAを抽出します。その後、DNAを10〜15マイクロリットルのTEバッファーに希釈し、濃縮されたエルテを得る。ライゲーションを行う準備ができたら、バイアルに15マイクロリットルの蒸留水を加えます。以前にアニールされたガイドRNAオリゴヌクレオチドの1マイクロリットル、BSNB1消化PSB700ガイド発現ベクターの1マイクロリットル、10XT4 DNAリガーゼ反応バッファーの2マイクロリットルを加える。次に、ボルテックスで溶液を混合します。DNAリガーゼと渦の1マイクロリットルを再び追加します。100倍Gで溶液を15秒間スピンダウンします。夜間に室温で反応をインキュベートし、アニールガイドRNAオリゴテ挿入物なしでBSNB1消化ベクター単独で無挿入陰性対照反応を含めないようにします。まず、マイナス80度の貯蔵から大腸菌を取り除き、氷の上で5〜10分間解凍します。有能な大腸菌の8マイクロリットルに調製された反応混合物の0.5マイクロリットルを追加します。氷の上に30分間保持します。42°Cで45秒間加熱衝撃を与えます。その後、混合物を2分間氷の上に置きます。ロータリーシェーカーを使用して、NEB DH5aまたはNEB厩舎に記載されている条件を使用して、SOC培地の250マイクロリットルの培養を回収してください。この後、適切な抗生物質耐性リソジニーブロスプレート上の培養物のプレート80マイクロリットル。NEB DH5aの場合は摂氏37度、NEB厩舎では摂氏30度で一晩インキュベートします。まず、Phusion GC 特殊 PCR プロトコルを使用して、テキスト プロトコルで概説されている必要なフラグメントを作成します。このPCR製品を1%アガロースゲルで実行し、1つのバンドが約490塩基対で見られることを確認します。このPCR産物をカットして抽出するゲル抽出キットを使用してください。次に、調製した1XマスターミックスをPCRチューブにアリコートする。マルチチャネルピペットを使用して、1マイクロリットル当たり40フェムトモレの濃度でPCR産物の1マイクロリットルを添加する。PSB700ベクターの1マイクロリットルでは、マイクロリットル当たり40フェムトモレの濃度を追加します。ガイドRNAオリゴヌクレオチドの代わりに1マイクロリットルの水を用いることで無挿入制御を含む。テキストプロトコルで概説されているゴールデンゲートプロトコルを使用して、ベクトルを消化し、1つの反応で挿入物をリゲートします。最初の黄金のゲート反応の後、各反応にBSNB1酵素の追加0.5マイクロリットルを加える。55°Cで1時間続けます。ゴールデンゲート反応が完了すると、前述の大腸菌変換プロセスに進みます。本研究では、2つの方法を用いて、単一ガイドRNA発現ベクターが正常に作成されました。第1の方法では、ベクター骨格は、一連の短いオリゴヌクレオチドで予め消化され、結紮される。2番目の方法では、ゴールデンゲートクローニングを使用して、同時に単一の反応で消化し、リゲートしました。ペアドガイドRNA発現ベクターは、それぞれ独自の独立プロモーターによって駆動され、カスタムPCRフラグメントをクローニングすることによって正常に作成される。これらの方法のいずれかでクローニングが成功すると、インサートコントロールプレートと比較して、適切な挿入DNAを用いた変換のための有意に多くのコロニーが出現する。この手順を試みる際は、複製手順に挿入コントロールを含めずに注意してください。この手順に従って、エピゲノム工学のような他の方法は、クロマチンシグネチャが遺伝子発現にどのような影響を与えるかなどの質問に答えるために行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

学ぶCRISPR実験用sgRNA発現プラスミドのワンステップクローニング法。Golden Gate法によるペアガイドRNA作成と大腸菌変換を含む効率的な遺伝子工学手法を解説する。

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

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