Name: マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶマウス膵臓内分泌細胞の単一細胞RNAシーケンス法。膵島系譜分化と細胞異質性の解析により、糖尿病治療への応用可能性を明らかにする重要な技術です。

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ライフ サイエンス コンピューティング プラットフォームを北京清華センター北京 (北京大学) 蛋白質科学のための国民の中心を感謝いたします。この作品は、省科学と中国の技術 (2015CB942800)、国家自然科学基金、中国の (31521004、31471358、および 31522036) と c. 高橋にライフ サイエンス北京清華センターからの資金によって支えられました。

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">On the origin of the beta cell.</a> Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
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<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li>
<li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li>
<li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+in+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v025i01">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li>
<li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadley%2C+W+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer Science & Business Media. (2009).</li>
<li>Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from:
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<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li>
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このプロトコルでは、膵 β 細胞の単一細胞発現プロファイルを勉強するための効果的かつ簡単に使用できる方法を示した。このメソッドは、胎生期、新生児および生後の膵臓から内分泌細胞を分離し、単一細胞トランスクリプトーム解析が実行される可能性があります。
最も重要なステップは、良い状態の単一の β 細胞の分離です。完全に灌流膵臓より後続の消化に対応します。膵島の低収量で背側膵に発生します通常、不十分な循環になります。後、消化時間と揺れの強度には特に注意が必要です。過剰消化、積極的な長いインキュベーション時間から生じる揺れ、粉々 小島を破ることができます。不十分な消化完全に隣接する組織から小島を分離しません。膵臓の消化力の後、小島は密度勾配遠心法ではなく手摘みによって精製しました。密度勾配遠心法小島を豊かにすることができます、多くの小さな島または小島ゆかりの腺房組織が誤って破棄されます。腺房組織、非能率的なトリプシンの消化力を引き起こす可能性がありますと β 細胞の純度を減らすを選ぶようにしてください。
独立した生物の複製がある生物学的...

膵臓は、哺乳類の重要な新陳代謝器官です。膵臓は、内分泌と外分泌のコンパートメントで構成されます。インスリン産生 β 細胞と α 細胞のグルカゴン産生などを含む膵の内分泌細胞はランゲルハンス島で一緒にクラスターし、協調全身グルコース恒常性を調節します。内分泌細胞の機能不全は、世界中の主要な公衆衛生問題となっている糖尿病の結果します。
膵内分泌細胞由来 Ngn3+前駆細胞胚1中。その後、周産期、内分泌細胞はフォーム未熟な小島に増殖します。これらの未熟な細胞は、開発し、大人2血液グルコースの恒常性を調節する血管になる豊かな成熟した小島を徐々 にしていきます。
Β 細胞の分化を制御する転写因子群が確認されていますが、β 細胞の成熟の正確な経路はまだはっきりしません。また、β 細胞の成熟過程にはセル数拡張3,4の規制と細胞異質性5,6世代も行われます。しかし、これらのプロセスの制御機構がよく研究されていません。
単一細胞の RNA シーケンスは、細胞の亜集団をプロファイルおよびセル血統発達経路7をトレースできるようにする強力なアプローチです。この技術では、単一セルのレベル8で膵島の開発中に発生するイベントを解読するキーを利用してください。単一細胞の RNA シーケンス プロトコルの中では、スマート seq2 は、感度の向上と精度、低コスト9時標準試薬の使用と完全長 cDNA の生成を可能です。スマート seq2 はシーケンス10の cDNA ライブラリを組み立てるに約 2 日かかります。
ここでは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用してアダルト Ins1 RFP トランスジェニック マウス11、胎児の膵臓からの蛍光標識 β 細胞の分離法を提案し、トランスクリプトームのパフォーマンス解析で、スマート seq2 技術 (図 1) を使用して単一細胞レベル。このプロトコルは、通常、病理学的およびエージングの状態であらゆる膵内分泌細胞のトランスクリプトームを解析する拡張できます。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ P</td><td>ロシュ</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #4 鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ロボズ</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD 針 1/2インチ長さ</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ DV4</td><td></td></tr><tr><td>実体蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステレオ Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ セルストレーナーキャップ付き</td><td>BD-ファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルPCRマイクロプレート</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>シリコンシーリングマット</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>シンウェルPCRチューブ</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>セルソーター</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーピペット</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant RNase Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II reverse transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>First-strand buffer (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads XP</td><td>beads Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master</td><td>Mix Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>5x TTBL、5x TTE、5x TS、5x TAB、TAE</td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td>を含む <td>16 個の N6XX および 24 個の N8XX</td></tr><tr><td>高感度 NGS フラグメント解析キット</td>を含む <td>高度な分析技術</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS Ca2+ および Mg2+</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl;5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3;0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>1 &times;10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.4</td></tr><tr><td>FACS バッファー</td><td></td><td></td><td>1 &times を含む HBSS;15 mM HEPES、5.6 mM グルコース、1% FBS、pH 7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td> を含む <td>HBSS Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</サブ></td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ-dT<サブ>30</サブ>VNプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT<サブ>30</サブ>VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr><tr><td>プライマー5</td><td></td><td></td><td>'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdhフォワードプライマー5</td><td></td><td></td><td>'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh リバースプライマー5</td><td></td><td></td><td>'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 フォワードプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 リバースプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

ランゲルハンス島におけるクラスター化されて、膵臓の内分泌細胞は、血液グルコースの安定性とエネルギー代謝を調節します。Β 細胞のインスリン分泌を含む島の明瞭な細胞の種類は萌芽期の段階の間に一般的な内分泌前駆細胞と区別されます。未熟な内分泌細胞は細胞増殖を介して展開し、長い生後発達期間中に成熟します。しかし、これらのプロセスの基になるメカニズムは明確には定義されていません。単一細胞の RNA シーケンスは、異なる細胞集団およびトレース細胞系統分化経路の評価の有望なアプローチです。ここでは、胎生期、新生児および生後の膵臓から分離膵 β 細胞の単一細胞の RNA シーケンスの手法について述べる。

胎生期、新生児および生後のマウスから切除した膵臓 (図 2 a と2 b)。生後 18 日目より古いマウス消化効果は異なります; 灌流の程度したがって、注射は膵島の分離のための最も重要なステップ (図 2-2Eと表 6)。できるだけコラゲナーゼは、このステップの間に膵臓を埋めることができるほどに注入しました。完全に膨張した膵臓が図 2 Dで表示されます。灌流が成功した (図 2 e) ではないが貴重なサンプル、膵臓が十分な消化後の小さな断片に破れたことができます。
灌流後、膵組織は小...

単一細胞 RNA シーケンス続いて胎生期、新生児および生後の膵臓内分泌細胞の単離方法について述べる。この方法により、分析、膵内分泌系統の開発の細胞の不均一性とトランスクリプトームのダイナミクス。

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

この方法は膵島系統分化、成熟、および再生に関する膵島の分野での答えの主要な質問を持つことができます。この技術の主な利点は、高品質の単一細胞RNAシーケンシングデータの生成のための単一膵島細胞の収集を可能にすることです。この技術の応用は、病的状態における膵内分泌単細胞のトランスクリプト分析を通じて糖尿病および他の膵内分泌関連疾患の治療に向けて広がる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、灌流のために膵臓の狭い胆管に針を挿入するのが難しい可能性があるため、非常に重要です。胚の日17.5胚のために。腹腔を開いた後、肘ピンセットを使用して、冷たいPBSを含む6センチメートルの黒底皿に内臓組織を移します。鉗子を使用して内臓組織から膵臓を取り外します。そして、5ミリリットルの冷たいコラゲナーゼ溶液を含む20ミリリットルバイアルに膵臓組織を入れる。出生後ゼロから15匹のマウスの場合、組織をコラゲナーゼに入れる前に膵臓のすべてのローブを慎重に解剖する。出生後18日目から60日目のマウスの場合、まずxiphoidを取り除き、腹腔の右側に腸を抽出する。肝臓の左右の内側葉を両側に押し込み、胆嚢と共通の胆管を露出させる。そして、胆管が十二指腸に入る場所を横取りするために、上下の位置に小さな容器クランプのペアで十二指腸をクランプします。次に、冷えたコラゲナーゼ溶液を用いた30ゲージ針を装備した5ミリリットルのシリンジをロードする。そして、針の先端を胆嚢に挿入するために顕微鏡を使用してください。慎重かつスムーズに共通の胆管を通して針を操作します。そして、プランジャーを押し落とし、マウスの大きさに応じて1〜5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液で膵臓を浸透させる。すべての溶液が浸透したら、鉗子を使用して、新鮮な冷たいコラゲナーゼ溶液を5ミリリットル含む20ミリリットルバイアルに膵臓をすぐに移します。すべての膵臓組織が採取されたら、バイアルを摂氏37度の水浴に3分間置き、続いて3〜5分間穏やかな揺れを行います。その後、0.25ミリメートルのナイロンストレーナーを通して消化された製品を新しい50ミリリットル遠心管にフィルターします。そして、ストレーナーを徹底的に洗浄するために氷冷PBSを含む20ミリリットルの注射器を使用してください。出生後18日目から60日目の膵臓では、濾過サンプルを遠心分離し、30ミリリットルの冷たいPBSで組織を再中断する。その後、組織懸濁液を6センチメートルの黒底皿にデカントし、200マイクロリットルピペットと解剖顕微鏡を使用して、少量の冷たいPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移す小島を選びます。胚性17.5日目の出生後15日目膵臓の場合、濾過された膵臓組織を遠心分離し、トリプシン-EDTA溶液中のペレットを摂氏37度の水浴で4分間インキュベーションに再懸濁する。インキュベーションの最後に、ペレットを200マイクロリットルピペットで1分間穏やかに評価し、続いて冷たい牛血清の0.5倍の量を加えて穏やかな渦を加えて消化を止めます。次いで、遠心分離によって消化を収集し、フローサイトメトリーによる選別のための5ミリリットルFACSチューブ内のFACSバッファーの200マイクロリットルの細胞を再懸濁します。単一細胞の摘み取りおよびリシスの場合、アリコートで作りたての細胞ライシスバッファーを8つのストリップPCRチューブに、それぞれに単一の細胞を移す。RNAの放出のために細胞をライスするためにサンプルを渦、摂氏4度で30秒間遠心分離し、氷の上に即時貯蔵する。逆転写の場合は、ライセートを摂氏72度で3分間インキュベートし、氷の上で1分間インキュベートします。サンプルを摂氏4度で30秒間短遠分化し、各サンプルに5.7マイクロリットルの逆転写ミックスを加え、各サンプルの総体積を10マイクロリットルにします。穏やかな渦と遠心分離の後、サーモサイクラーにサンプルをロードし、逆転写プログラムを開始します。ポリメラーゼ連鎖反応のプリアンプ化、またはPCRの場合は、最初のストランド反応を含む各サンプルに15マイクロリットルのPCRミックスを加え、続いて穏やかな渦および遠心分離を行います。次に、サンプルをサーモサイクラーにロードし、PCR プログラムを開始します。PCR精製の場合、各サンプルに25マイクロリットルの再懸濁DNA精製ビーズを加え、ボルテックスで十分に混合します。その後、迅速にビーズの決済を避けながら、液体を収集するために室温でサンプルを回転させます。室温で5分後、サンプルを適切な磁気スタンドに置き、溶液が透明になったら上清を慎重に取り除いて捨てます。200マイクロリットルで2回の30秒の洗浄でビーズを洗浄し、1回の洗浄で80%エタノールを調製します。そして、2回目の洗浄後に残りのエタノールを捨てる。ビーズが空気乾燥したら、11マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えてビーズからDNA標的を溶出させ、続いて渦を起たします。次に、サンプルを素早く遠心分離し、溶液が透明になるまでサンプルを磁気スタンドに戻し、各サンプルの10マイクロリットルを新しいPCRチューブに移します。正常に増幅されたcDNAは、500塩基対を超える全長を有し、1.5から2キロの塩基対に濃縮される必要があります。また、通常、インスリン1個のRFPプラス細胞において観察されるcDNAの500〜600塩基対濃縮があり、これはインスリン転写産物を表わしてもよい。しかし、100塩基対付近のcDNA断片はプライマーダイマーであり、通常は過剰なプライマーによって引き起こされ、DNA精製ステップを繰り返すことによって除去されなければならない。100から500塩基対の間のcDNA断片は、通常、劣化したcDNAを表し、これは悪い細胞の状態または領域の問題(RNase汚染など)によって引き起こされ、除外する必要があります。シーケンシング用のcDNAライブラリの精製後、250~450塩基対のcDNAは、DNA精製ビーズを第1および第2の精製に添加することによって得ることができる。DNA Bead の精製後、シーケンシング品質スコアは、シーケンシング品質評価時に 30 を超える必要があります。下流分析のために高品質の細胞を得るために、マッピングされた読み取りが0.50万未満、または検出された遺伝子が4,000未満の細胞が除外され、異なるグループの細胞の特徴付けと、主成分分析および階層クラスタリングの後に異なるグループで異種化される遺伝子の同定が容易になる。この手順を試みる間、コラゲナーゼ消化の前に膵臓を素早く浸透させて消化の上の島を避け、単一細胞の処置中にRNaseの自由な環境を維持することを忘れておいてください。この手順に従って、アイレットイメージングや培養などの他の方法は、そのアイレット構造の可視化を容易にし、細胞応答および薬物刺激を調べるために行うことができる。開発後、膵臓研究の研究者が膵島の系統の発達と再生のメカニズム、ならびに哺乳類の糖尿病の進行を探求する道を開いた。

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

以下のプロトコールは、膵臓の仮想スライスイメージングのための解剖、および全体の膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞のその後の定量化のプロセスを概説します。...

マウスにおける膵β細胞の質量のその場定量に

ランゲルハンス単離したマウスの膵島を用いたin vitroβ細胞機能をアッセイすることは、糖尿病の病態と治療薬の研究に重要な要素である。多くの下流のアプリケーションが利用可能であるが、このプロトコルは、具体的にはβ細胞機能を決定する本質的なパラメータとして、細胞内サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の測定を記載する。...

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

本書では、マウスの膵臓からプライマリー膵臓腺房細胞を単離し、培養するための迅速かつ便利な手順を説明します。この方法では、新鮮な主要形質転換/ノーマル膵外分泌細胞の生理機能を研究するための貴重なアプローチを構成している。...

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

ここでは、間葉系細胞の単離に着目し、胚、新生児および成体マウス組織からの膵臓微小環境内の細胞を単離するための方法を記載します。この方法は、膵臓の発達、機能、及び腫瘍形成を調節する外因性シグナルを解明するために、細胞遺伝子発現およびタンパク質分泌のプロファイリングを可能にします。...

フローサイトメトリーによる膵臓間葉の細胞を単離と解析

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

ここでは、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、単体ヒト膵島から単一細胞の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するプロトコルを提示する。...

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

膵臓の転生細胞は、膵臓腫瘍を引き起こす悪性細胞の前駆体です。しかし、無傷の生膵細胞を単離することは困難です。ここでは、膵臓組織を解離するための効率的な方法を紹介します。その後、細胞はシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)または2次元または3次元の共培養に使用できます。...

生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

このプロトコルは、死亡した臓器提供者からヒトの膵臓スライスを生成して、生理学的に近い条件下で細胞機能を研究する方法を説明しています。この革新的なアプローチにより、正常および構造的に損傷した膵島と、内分泌コンパートメントと外分泌コンパートメント間の複雑な相互作用の調査が可能になります。...

内分泌および外分泌膵臓生理学を研究するためのヒト膵臓組織スライスの生成

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。...

マウス膵臓内皮細胞の単離

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶマウス膵臓内分泌細胞の単一細胞RNAシーケンス法。膵島系譜分化と細胞異質性の解析により、糖尿病治療への応用可能性を明らかにする重要な技術です。

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

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