Name: 迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶ、ベッドサイドでの迅速なウイルス核酸抽出法。全血試料から電気や特殊機器を使わずに核酸を抽出し、現場病院など資源制限環境での即時診断を可能にする臨床検査技術です。

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その技術支援と臨床サンプルの処理のスザンヌは軽やかに駆けるラスムッセンと Solvej Kolbjørn ジェンセンに感謝しますこのプロジェクトは、革新的な医学イニシアティブ 2 共同事業助成契約 N ° 115843 下から資金を受けている EbolaMoDRAD コンソーシアムの一部です。この共同事業は、欧州連合のホライゾン 2020年研究とイノベーション プログラムおよび舵からサポートを受け取ります。

生物医学研究倫理委員会、首都圏は、インフォームド コンセントを与えているし、ここで説明したすべてのメソッドは、アッセイ開発プロジェクトに関するデンマークの法律に従って、倫理委員会システムによってレビューから除外されています。
1. ウイルス不活化と急速な NA 抽出真空採血管の準備
注意: このプロトコルに使用されるバッファーには、刺激であるためチオシアン酸 (GITC) および非イオン性界面活性剤が含まれています。適切な研究室安全対策流フードを使用し、それを処理するときは、手袋を着用します。皮膚と眼との接触を避けます。バッファーがこぼれたら、この混合物は有毒なシアン化物の形成につながる可能性がありますので汚染された表面が消毒クロラミンや次亜塩素酸ナトリウム (「漂白剤」の成分) を直接決してする必要があります。最初、吸収性組織とこぼれたバッファーを拭いてください。次に、70% のエタノールと水の表面をきれいにし最後に、クロラミンまたはナトリウム次亜塩素酸を使用します。
<ol><li>血液コレクション真空管を準備するには、25 x 1 針と 3 mL シリンジを使用してチューブの蓋を貫通して 4 mL EDTA 真空管に特定商業換散バッファーの 1.6 mL を注入します。 注: は、真空管式のふたを削除しないでください。真空を維持する必要があります。</li>
	<li>真空管を使用するまで室温でバッファーを含むを保存します。 注: 少なくとも 1 年間の準備の後のチューブは安定しています。</li>
</ol>2. NA 抽出バッファーの準備
<ol><li>NA 抽出バッファーを準備するには、ラックに 2 つ 1.8 mL、2 4.5 mL および 1 つの 3.6 mL チューブを配置します。</li>
	<li>磁性ガラス粒子 (MGPs) きれいな 1.8 mL チューブ、MGPs。 それと再懸濁します MGP サスペンション完全にそれをピペッティングする前にラベルの 960 μ L をピペットで追加します。 注: MGPs は、管の下部を迅速に収集する傾向があります。</li>
	<li>追加、ピペッティング、4 mL の洗浄バッファー私きれいな 4.5 mL 管によっておよび WB 1 としてラベルを付けます。 注意: 洗浄バッファー私は刺激性であるため塩化物を含んでいます。適切な研究室安全対策流フードを使用し、それを処理するときは、手袋を着用します。皮膚と眼との接触を避けます。</li>
	<li>洗浄バッファー II きれいな 3.6 mL チューブ 1.5 mL をピペットで追加し、WB 2 としてラベルを付けます。</li>
	<li>きれいな 4.5 mL の管に洗浄バッファー III の 3 mL をピペットで追加し、WB 3 としてラベルを付けます。</li>
	<li>きれいな 1.8 mL チューブに溶出バッファーの 100 μ L をピペットで追加し、EB としてラベルを付けます。</li>
	<li>使用するまで室温で検体のバッファーを格納します。 注: チューブは、最低 1 ヶ月の準備期間を経て安定しました。</li>
</ol>3. ウイルス感染の徴候と症状を持つ患者からの採血
注意: は、患者から全血を収集するときに適切な研究室安全措置を講じます。手袋、眼鏡を着用します。患者は単独では、バイオ セーフティ レベル 4 の手順に従ってください。
<ol><li>患者から静脈全血を収集するには、小口径の延長チューブと蝶針と換/結合バッファーを含む血液コレクション真空管を使用します。下方の位置に患者の腕を置き、コレクション チューブ蝶針よりも下の位置します。蝶針を患者の静脈に挿入し、血液コレクション真空管を小口径拡張に添付します。 注: これは逆流を防ぐ。</li>
	<li>血液採取後 5-10 回チューブを反転して管の内容をミックスします。 注: 1.6 mL の溶解/結合バッファーを含む血のコレクションの管に残りの掃除により採取された試料の量自動的に 1.6 mL。</li>
	<li>70% のエタノールを使用してチューブの外側を消毒します。</li>
	<li>室温で 20 分間チューブを孵化させなさい。 注: プロトコルをここで一時停止することができます、完全な血のコレクションの管は-20 ° C、5 ° C、25 ° C または少なくとも 1 月7の 37 ° C で保存できます。</li>
	<li>簡体字の NA 抽出方法に直接進みます。</li>
</ol>4. 全血中の NA 抽出の簡略化
<ol><li>換/結合バッファー不活化収集した血液、ミックスから NA を浄化するために真空を反転による管の内容管手で 5-10 倍です。</li>
	<li>慎重にチューブの蓋を取り外し、蓋を放電します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 MGPs (1 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>サンプルを格納筒、未使用採血管から新しいふたを配置します。</li>
	<li>チューブがしっかり閉じていることを確認し、採血管をひっくり返すこと手で 5-10 倍管の内容をミックスする蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>マグネット ホルダーにチューブを置き、指を離さないように、管を密閉蓋。</li>
	<li>マグネット チューブの側ですべての MGPs を収集できるように手で数回チューブ マグネット ホルダーを反転します。 注: マグネット ホルダーは細長い磁石とゴムバンドで置き換えることができます。</li>
	<li>チューブの蓋を取り外し、使い捨てのピペットを使用するか、コレクション、50 mL のチューブに内容を注ぐことによって単に管の内容を破棄します。 注: は、ふた付き管を閉じることにより 50 mL コレクションの管からのエアロゾルを回避します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 WB 1 (4 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>チューブのふたを閉めてチューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>指でしっかり蓋をしながら、マグネット ホルダーからチューブを削除します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>手で 5 ~ 10 回の血のコレクションの管をひっくり返すこと、MGPs を再懸濁します。</li>
	<li>4.6 4.8 の手順を繰り返します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 WB 2 (1.5 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>チューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>数秒間血のコレクションの管を手で弾くことによって、MGPs を再懸濁します。</li>
	<li>4.6 4.8 のステップを繰り返します。</li>
	<li>血のコレクションの管に直接 WB 3 (3 mL) の準備の因数を注ぐ。</li>
	<li>チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>チューブをしっかり閉じていることを確認するための蓋の上に指を置きます。</li>
	<li>手で 5 ~ 10 回の血のコレクションの管をひっくり返すこと、MGPs を再懸濁します。</li>
	<li>4.6 4.8 の手順を繰り返します。</li>
	<li>理事会の準備の因数を注ぐ (100 μ L) 血のコレクションの管に直接。</li>
	<li>チューブの蓋を置き、マグネット ホルダーからチューブを取り外します。 注: 場合磁石、ラバー バンドを使用して、単に削除ゴムバンドとマグネット チューブから。</li>
	<li>5-10 回指で採血管を叩くことによって理事会で、MGPs を再懸濁します。 注: プロトコルがここでは、一時停止にできるし、チューブが-20 ° C で保存できます。</li>
	<li>再懸濁 mgps 1.5 mL 使い捨てピペット (任意の下位診断 NA 増幅分析などランプ/RT-ランプまたは qPCR/Rt-qpcr アッセイを使用できます) を使用して、ダウン ストリーム NA 増幅反応混合物に 1 つの液滴 (5-8 μ L) を転送します。 注: NAs が、MGPs に固執するので、必ず下流 NA 増幅反応で、MGPs を使用します。使用する前に MGP サスペンションをミックスします。混合した後、管の下部に、MGPs を収集します。</li>
</ol>

<ol><li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li>
<li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li>
<li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li>
<li>Yang, M., Ke, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+a+Rapid+and+Sensitive+EBOV-RPA+Test+for+Rapid+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li>
<li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Pressure+Driven%2C+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li>
<li>Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+bedside+inactivation+of+Ebola+virus+for+safe+nucleic+acid+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).</li>
<li>Vinner, L., Fomsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+orthopoxvirus+for+diagnostic+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis.</a> Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).</li>
<li>Schmitz, H., Köhler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li>
<li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li>
<li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li>
<li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li>
<li>Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+microfluidic%2C+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li>
<li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+%28v2.5%29+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li>
<li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone%3A+A+Field+Evaluation+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980(2016).</li>
<li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Instructions+for+Use%3A+Idylla+TM+Ebola+Virus+Triage+Test%22">Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf">https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf</a> (2016).</li>
<li>MPLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+Nucleic+Acid+Isolation+Kit.+Safety+data+sheet+version+1.7%22">Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001">https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001</a> (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本報告で述べる安全、迅速かつ簡単なマニュアル ベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの下流分子検出のため。換/結合バッファー (材料表)7を含む真空採血管で収集された全血サンプルで直接実行するのに記載されている NA 抽出法が開発されました。この特定のバッファー EBOV7を不活性化し、メソッドの重要なコンポーネントです。血液採取後、サンプルの完全な不活化を確保するために、少なくとも 20 分7管の培養をお勧めします。ベッドサイドの EBOV 不活化 BSL 4 条件などの厳密な包含条件の下で任意の EBOV 陽性検体を処理する必要があるができ通常の BSL 2 条件下で処理されるサンプル。その他リスク グループ 4 つの病原体など、ラッサ ウイルス、マールブルグ ウイルス、クリミア ・ コンゴ出血熱ウイルスはまたにこのバッファーによる不活化は、この遺骨が表示されることです。
説明...

ウイルスの発生状況は、患者が隔離病棟または迅速な診断が必要な場合に限られているとき、安全で簡単、かつ正確なポイント ・ オブ ・ ケアの分子診断は患者のケアとリスクの封じ込めのため不可欠です。2 つウイルスの最近の発生、エボラ出血熱ウイルス (EBOV) 西アフリカ (2013)、南アメリカ (2015)、ジカの改善ポイント ・ オブ ・ ケアの診断テスト分子、逆のトランスクリプションのループを介した等温などに対する関心が高まってください。増幅 (RT ランプ)1,2編シュプリンガー ・ ポリメラーゼ増幅 (RPA)3,4。RT ランプ、RPA は、簡単なサンプル準備を行うことが急速な敏感な特定の分子テストです。ジカ ウイルスの RT ランプは 30 分1; 内非精製の全血試料中ジカ ウイルスを検出することができます側方流動試金 (LFA) と結合されていますただし、リスク グループ 4 病原体として分類される、非常に伝染性、EBOV のサンプルは、バイオ セーフティの下で処理する必要がある 4 (BSL-4) 条件、任意の安全な診断手順を実行前に不活化します。
EBOV、3,2,54,サンプル、換散バッファーの追加など簡略化された不活化方法が発生; 中に使用されました。ただし、これらのメソッドには、BSL 3 バイオ セーフティ キャビネット、遠心分離機、加熱ブロック、最低、ピペットなどの実験装置と BSL 4 条件下で処理が不要です。病棟別や野戦病院でこの装置は通常ありません。このような課題を克服するために、スーツケース3診断を実行する試みがなされ、いくつかのポータブル デバイスとマシンを開発 [例えば核酸 (NA) 抽出のためのポータブル デバイス] されている6。ただし、この EBOV 肯定的なサンプルは、これらのデバイスを使用することができます前に不活化する必要があります。
について報告した急速なベッドサイド ウイルス不活化法による EBOV7、ワクシニア ウイルス、牛痘ウイルス8商業換/結合バッファーの添加による普通の真空採血管に直接を可能にします。患者から不活化バッファー7へ血液の転送。クローズド システムのこの直接および即時の不活化 BSL 4 条件7など、厳密な包含を使用してサンプルを処理する必要がある、通常の BSL 2 条件下でサンプルを処理できます。この不活化方法はロボットや手浄化キット7など、いくつかの NA 抽出システムとの互換性ただし、これらのメソッドには、実験装置、ロボット、遠心分離機、や電気のフィールドの設定または隔離病棟内存在とは限らないなどが必要があります。
本報告で述べる安全・迅速かつ簡易マニュアル NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスのそれに続く分子検出のため。NA の抽出法では、マグネット ・ マグネット ホルダー以外の装備は必要ありません。NA を抽出するための遠心分離機、ブロック、または電気暖房は不要です。したがって、このメソッドは実験施設に依存しないとすることができます簡単に任意の場所 (例えば、野戦病院、病棟の分離または低リソースの設定で) 使用します。NA 抽出法は、迅速かつ簡単な qPCR、RT qPCR、ランプ、または RT ランプなどのすべてのダウン ストリーム NA テストで直接使用することができます。この NA 抽出法をランプとポータブル バッテリー駆動の恒温器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分内ベッドサイド診断を取得できます。

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTAチューブ(4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1</td>針 <td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOKシリンジ(3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubs</td><td>J&oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S 3038505001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade;バイオバンキングおよび細胞培養極低温チューブ(1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Scientific 375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade;バイオバンキングおよび細胞培養極低温チューブ(3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Scientific 379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade;バイオバンキングおよび細胞培養極低温チューブ (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-5 マグネット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;Samco&trade;ファインチップトランスファーピペット(1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;Nunc&trade;50 mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

アウトブレイク管理、リスクの抑制、および患者のケアのための感染症の迅速診断が欠かせません。以前、真空採血管に直接商業換/結合バッファーを追加することによって安全な核酸 (NA) テストのための血液採取中にエボラ ウイルスの急速なベッドサイド不活性化する方法を示しました。このベッドサイド不活化アプローチを使用して、我々 手法を開発した安全、迅速かつ簡単なベッドサイド NA 抽出換/結合バッファー不活化全血中のウイルスの後続の検出。NA の抽出は、採血管で直接実行され、機器や電気を必要としません。
換/結合バッファーには採血後チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在し、混合物は室温で 20 分間インキュベートします。チューブに磁性ガラス粒子 (MGPs) が追加され、コレクション チューブを手で弾くことによってのコンテンツが混在します。ゴムや磁石マグネット ホルダーを使用して、採血管の側面に、MGPs を収集します。MGPs 3 回洗浄し、コレクションの管に直接溶出バッファーの追加により、NAs NA 試験、qPCR 反応から MGPs を取り外すことがなく等温ループ増幅 (ランプ) などの準備が整います。NA の抽出法があらゆる所に依存しないと簡単にすることができます (例えば、野戦病院の隔離病棟) どこでも使用されます。この NA 抽出法をランプとポータブル機器と組み合わせれば、血液のコレクション 40 分以内で診断が可能です。

ここで提示されたプロトコルは単純で効率的と換/結合バッファーで不活化感染全血サンプルで実行される任意の分子アッセイに広く適用できます。血の不活性化および NA 抽出のワークフローはに示す図 1血コレクション真空管7 (図 1 a)、血液コレクション7 (図 1 b)、NA 抽出 (の準備を含む図 1 - 1 H)、および下流の NA 分析 (図 1I)。
簡体字の NA の抽出のプロトコルにより、MGPs は溶出のステップから削除されず、したがって、NAs...

ここでは、ウイルス不活化全血から急速なウイルス核酸抽出のためのプロトコルを提案する.抽出は、採血管に直接行い機器や電気を必要としません。メソッドは実験施設に依存しないとすることができます (例えば、野戦病院で) どこでも使用されます。

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

この方法は、ウイルス感染の兆候がある患者のポイントオブケア診断を行う際に役立ちます。この手法の主な利点は、実験装置や電気を使わずに実行できるため、病棟で実行できることです。採血手順のデモンストレーションは、私の研究室の医師Anders Fomsgaardと科学者のMorten Rasmussenです。採血管の準備から始めます。3MLシリンジに取り付けられた25ゲージの1インチ針を使用して、市販の溶解バッファー1.6MLを4ML EDTA真空管に注入します。採血のためには、採血チューブ内の真空を維持することが重要です。したがって、常に針を使用して、溶解バッファーを採血管に注入します。次に、960 マイクロリットルの容量の磁性ガラス粒子(MGP)を完全に再懸濁し、標識された 1.8 ML チューブに移します。次に、4MLの洗浄バッファー1をWB-1.1.5MLとラベル付けされた4.5MLチューブに、2つの洗浄バッファーをWB-2とラベル付けされた3.6MLチューブに、3MLの洗浄バッファー3をWB-3とラベル付けされた4.5MLチューブにピペットで移します。最後に、EBとラベル付けした1.8 MLのチューブに100 μLの溶出バッファーを加え、使用するまでチューブを室温で放置します。患者から全血を静脈内採取するには、小口径延長チューブを備えたバタフライニードルと、溶解バッファーを含む事前に調製された採血真空チューブの1つを使用します。患者の腕を下向きの位置に置きます。蝶針を患者の静脈に挿入し、採血真空管を小口径延長部に取り付けます。採血後、チューブの内容物を5〜10回ひっくり返して混合します。チューブの外側を70%エタノールで消毒します。次に、チューブを室温で20分間インキュベートし、ウイルスを不活化します。採取した血液から核酸を精製するには、再び手で真空管を5〜10回ひっくり返してチューブの内容物を混ぜます。準備したMGPのアリコートを直接採血管に注ぎます。未使用の採血チューブから新しい蓋をサンプルの入ったチューブの上に置きます。蓋に指を置いてチューブがしっかりと閉じていることを確認し、チューブの内容物を5〜10回ひっくり返して混ぜます。チューブをマグネットホルダーに入れ、蓋に指を置いて、チューブがしっかりと閉じていることを確認します。次に、マグネットホルダーをチューブで数回ひっくり返して、MGPが磁石でチューブの側面に集まる前にMGPを分散させます。チューブの蓋を取り外し、使い捨てピペットを使用して、チューブの内容物を50MLのコレクションチューブに廃棄します。準備したWB-1のアリコートを直接採血管に注ぎ、チューブの蓋を閉めます。内容物を手で5〜10回混ぜます。次に、磁石を使用してチューブの側面にビーズを集め、以前と同様に液体を取り除きます。調製したWB-2の分注液にビーズを再懸濁し、溶液を廃棄し、調製したWB-3の分注で手順を繰り返します。最後に、磁気ホルダーからチューブを取り外し、準備したEBのアリコートを直接採血管に注ぎます。チューブに蓋をし、指で5〜10回軽くたたいてMGPを再び吊り下げます。最後に、1.5 mLのディスポーザブルピペットを使用して、再懸濁したMGPの1滴を下流の核酸増幅反応ミックスに移します。PCR反応液に1つの液滴のみを移す前に、MGPを完全に再懸濁してください。概念実証を実証するために、陰性の全血に、最近ギニア南部で発生したエボラウイルスの基準の10倍希釈、または3つの異なる濃度のエプスタインバーウイルスをスパイクしました。抽出した核酸は、社内のウイルス特異的R2 qPCRまたはqPCRによって分析されました。交差閾値(CT)が低いほど、ウイルスゲノムのコピー数が多くなります。ここでは、エボラウイルス特異的ランプによって、異なる濃度のエボラウイルスがスパイクされた全血が検出されました。スパイクされた全血サンプル中のウイルスの最終濃度は X 軸で表示され、陽性になるまでの分数は Y 軸で示されます。ここでは、C型肝炎WHO標準化血清サンプルの10倍希釈液を全血にスパイクし、HCV特異的RT qPCRによる検出を行いました。最後に、この画像は、エプスタイン・バーウイルス陽性の全血に対するエプスタイン・バーウイルス特異的ランプ反応の結果を示しています。この手順を試行するときは、指定された溶解結合バッファーを使用することが重要です。これは重要なステップであり、この分析法にとって重要な試薬です。この溶解結合バッファーは、サンプル中のウイルスを不活化します。この手法に従って、ランプやPCRなどのさまざまな分子検出方法を実行できるため、鑑別診断を実行できます。

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Research

JoVE Journal

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迅速・安全・簡易マニュアルベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

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