迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

この方法は、ウイルス感染の兆候がある患者のポイントオブケア診断を行う際に役立ちます。この手法の主な利点は、実験装置や電気を使わずに実行できるため、病棟で実行できることです。採血手順のデモンストレーションは、私の研究室の医師Anders Fomsgaardと科学者のMorten Rasmussenです。

採血管の準備から始めます。3MLシリンジに取り付けられた25ゲージの1インチ針を使用して、市販の溶解バッファー1.6MLを4ML EDTA真空管に注入します。採血のためには、採血チューブ内の真空を維持することが重要です。

したがって、常に針を使用して、溶解バッファーを採血管に注入します。次に、960 マイクロリットルの容量の磁性ガラス粒子(MGP)を完全に再懸濁し、標識された 1.8 ML チューブに移します。次に、4MLの洗浄バッファー1をWB-1.1.5MLとラベル付けされた4.5MLチューブに、2つの洗浄バッファーをWB-2とラベル付けされた3.6MLチューブに、3MLの洗浄バッファー3をWB-3とラベル付けされた4.5MLチューブにピペットで移します。

最後に、EBとラベル付けした1.8 MLのチューブに100 μLの溶出バッファーを加え、使用するまでチューブを室温で放置します。患者から全血を静脈内採取するには、小口径延長チューブを備えたバタフライニードルと、溶解バッファーを含む事前に調製された採血真空チューブの1つを使用します。患者の腕を下向きの位置に置きます。

蝶針を患者の静脈に挿入し、採血真空管を小口径延長部に取り付けます。採血後、チューブの内容物を5〜10回ひっくり返して混合します。チューブの外側を70%エタノールで消毒します。

次に、チューブを室温で20分間インキュベートし、ウイルスを不活化します。採取した血液から核酸を精製するには、再び手で真空管を5〜10回ひっくり返してチューブの内容物を混ぜます。準備したMGPのアリコートを直接採血管に注ぎます。

未使用の採血チューブから新しい蓋をサンプルの入ったチューブの上に置きます。蓋に指を置いてチューブがしっかりと閉じていることを確認し、チューブの内容物を5〜10回ひっくり返して混ぜます。チューブをマグネットホルダーに入れ、蓋に指を置いて、チューブがしっかりと閉じていることを確認します。

次に、マグネットホルダーをチューブで数回ひっくり返して、MGPが磁石でチューブの側面に集まる前にMGPを分散させます。チューブの蓋を取り外し、使い捨てピペットを使用して、チューブの内容物を50MLのコレクションチューブに廃棄します。準備したWB-1のアリコートを直接採血管に注ぎ、チューブの蓋を閉めます。

内容物を手で5〜10回混ぜます。次に、磁石を使用してチューブの側面にビーズを集め、以前と同様に液体を取り除きます。調製したWB-2の分注液にビーズを再懸濁し、溶液を廃棄し、調製したWB-3の分注で手順を繰り返します。

最後に、磁気ホルダーからチューブを取り外し、準備したEBのアリコートを直接採血管に注ぎます。チューブに蓋をし、指で5〜10回軽くたたいてMGPを再び吊り下げます。最後に、1.5 mLのディスポーザブルピペットを使用して、再懸濁したMGPの1滴を下流の核酸増幅反応ミックスに移します。

PCR反応液に1つの液滴のみを移す前に、MGPを完全に再懸濁してください。概念実証を実証するために、陰性の全血に、最近ギニア南部で発生したエボラウイルスの基準の10倍希釈、または3つの異なる濃度のエプスタインバーウイルスをスパイクしました。抽出した核酸は、社内のウイルス特異的R2 qPCRまたはqPCRによって分析されました。

交差閾値(CT)が低いほど、ウイルスゲノムのコピー数が多くなります。ここでは、エボラウイルス特異的ランプによって、異なる濃度のエボラウイルスがスパイクされた全血が検出されました。スパイクされた全血サンプル中のウイルスの最終濃度は X 軸で表示され、陽性になるまでの分数は Y 軸で示されます。

ここでは、C型肝炎WHO標準化血清サンプルの10倍希釈液を全血にスパイクし、HCV特異的RT qPCRによる検出を行いました。最後に、この画像は、エプスタイン・バーウイルス陽性の全血に対するエプスタイン・バーウイルス特異的ランプ反応の結果を示しています。この手順を試行するときは、指定された溶解結合バッファーを使用することが重要です。

これは重要なステップであり、この分析法にとって重要な試薬です。この溶解結合バッファーは、サンプル中のウイルスを不活化します。この手法に従って、ランプやPCRなどのさまざまな分子検出方法を実行できるため、鑑別診断を実行できます。