Name: 注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶメッシュ電子工学を用いたマウス脳への長期的な単一ニューロン記録法。シームレスな神経組織との統合を実現し、脳の老化や発育、疾患の研究に有用な神経科学的手法です。

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C.M.L. による空軍科学研究局 (FA9550-14-1-0136)、ハーバード大学物理科学と加速器工学賞、国立機関の健康ディレクターのパイオニア賞を受賞 (この作品のサポートを認めています。1DP1EB025835-01) です。 T.G.S. は、国防科学及び工学研究科フェローシップ (NDSEG) プログラムを通じて国防総省 (DoD) によってサポートを認めています。G. h. は、国立健康の国民の協会の老化研究所から独立賞 (親 K99/R00) アメリカ心臓協会 (16POST27250219) と、経路から奨学金サポートを認めています。本研究は、ナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF ECCS 賞号の下でサポートされているのハーバード大学センターで行われました。1541959。

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<li>Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanowire+bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in nanowire bioelectronics.</a> Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701(2017).</li>
<li>Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+and+regulation+of+action+potential+propagation+in+nanoelectronics-innervated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues.</a> Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).</li>
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製作とメッシュの電子工学の使用のすべてのステップはいくつかは特に重要であるが、重要。彼らのウェハからメッシュ電子を解放する前に、(ステップ 1.6.1) 水溶液中で容易に中断メッシュ表面を酸化する不可欠です。この手順はスキップされます、メッシュは通常困難に、針に読み込む、水の表面に浮く場合は読み込むことができる、彼らはしばしばガラス針の側面に固執場合、大容量を必要とする (> 100 μ L) 注入のため。リリースでは、したがって、通常意味するメッシュを使用できないようにする前に、表面を酸化する障害と製作は最初から再実行必要があります。もう一つの重要なステップは、「幹」〜 90 ° (ステップ 4.3) のインタ フェース I/O 中にメッシュ電子を曲げは。角度が 90 ° 未満の場合、すべて 32 I/O パッドに収まらない ZIF コネクタ;いくつかは挿入、接続されている電極の数を減らすことを許可するように端をカットする必要があります。プロセスは、破壊から幹細胞を防ぐためにゆっくり行う必要があります。
メッシュ エレクトロニクスの設計は、フォトマスクを変更し、図 2で説明した同じ作製手順を使用して様々 な用途にカスタマイズできます。たとえば、図 9にデータを記録するために使用するメッシュ電子プローブはマウス海馬と大脳皮質一次体性感覚野にまたがる 32 の記録電極を持つように設計された、ウルトラフレキシブル メッシュ内電極配置することができます。事実上すべての脳の領域をターゲットに選択または刺激の大きい電極が組み込まれた27をすることができます。同じ基本的なメッシュ構造と作製手順は保持されるが、電極の配置とデザイン研究のニーズを満たすために調整されます。捜査官は、注意を使用する必要があります、し、常にテスト目的の針を修正後の設計を簡単に注入することができます。メッシュ エレクトロニクスの曲げ力学への小変更は、injectability に対する相当な効果を持つことができます。その一例は、横と縦の SU 8 リボンと 45 ° の角度が得られます facilely に注入することができますメッシュ電子プローブが、しわになり、針21を下駄で結果を 90 ° の角度です。
記録電極のインピー ダンス測定のトラブルシューティングに便利です。20 μ m の直径の円形白金電極 1 MΩ PBS29x 1、生体内で1 kHz の周波数で測定した際の近く、インピー ダンスの大きさが必要です。これより大きなインピー ダンス電極がない公開、それがフォトレジスト残渣で汚染されている場合に起こる可能性がありますか、ない電気的に接続を意味します。後者があります、たとえば、ほこり写真マスクの中にある場合 Au で切断で結果の相互接続、PL、またはメッシュの I/O パッドの 1 つに I/O インタ フェースの中に ZIF コネクタのピンが接触しない場合に発生します。インピー ダンスの大きさ約半分の期待値では、チャネルが隣接する 1 つは、互いに平行に 2 つの電極のインピー ダンスの回路を作成するのに短絡する場合があることを示唆しています。トラブルシューティングの中にガイドをとして計測されたインピー ダンス値メッシュ電子プローブ顕微鏡と組み合わせると、問題の原因を通常識別してそれに応じて修正を実行次の製作又は I/O インタ フェースの試み。
急性研究シリンジ注射メッシュの電子機器の使用が限られた単体スパイキング アクティビティが通常 1 週間ポスト注入27日まで見られないという点で (未発表) の最近の作品は、この問題は容易に克服することを示しています。メッシュは、アクティビティのスパイクを参照してくださいに必要な時間の主要決定要因デザイン、組織の損傷の程度に影響を与えるこれらメッシュ電子と一緒に脳と注入用針の直径に注入液量、噴射し治癒率。メッシュ電子ニッケル エッチング液; のリリース前に酸素プラズマで処理されていない場合、大規模な注入量が必要つまり、メッシュが親水性でない場合それはガラス針に付着することができます。時折、メッシュは、それらを注入する困難にする力学を曲げにつながる欠陥を持っています。メッシュの電子工学の読み込み中に、メッシュとして動いている簡単かつスムーズに針内 (補足のビデオ 1で示されている) をチェックすることが重要です。そうでない場合、異なるメッシュ電子プローブを使用する必要があります。注入されたメッシュの長さの 4 mm あたり 10-50 μ L の理想的な注入量にシームレスな神経インタ フェースに対して最適な結果が得られます。最近細かいメッシュ電子プローブにより注入および/またはより小さい直径キャピラリー針 (150 μ m の内径、外径 250 μ m のような小さな) 表示 (急性測定) 注入直後後からスパイクを 1 つの単位を観察できます。長い時代。これらの細かいメッシュ構造のマスク デザイン ファイルが要求やリソースの web サイトから利用可能な meshelectronics.org。当社生体内でメッシュの注入手順の収穫が 150 μ m の内部の直径 (250 μ m 外径と私たちの最近の仕事の 80-90% に近い方が約 70%、400 μ m の内径 (外径 650 μ m) の針を使用して全体的な収量を推定します。) 針。失敗の最も一般的な理由は、I/O プロシージャと (3) との打合せ (1) メッシュの注入がスムーズに脳に必要な手動操作中に (2) メッシュ破損に意外に大きい注入量から脳浮腫の結果注入中に血管を損傷からの出血。注入中に血管を損傷することは稀である (障害の 10% 未満の原因) 減らすことができる、画像誘導手術を使用してさらに。血管の損傷が transfection のためウイルス粒子の噴射、剛体脳プローブの注入とメッシュ電子の注入を含む脳組織の浸透を含むすべてのプロシージャの一般的な制限であることをも注意してください。
メッシュ電子プローブは、それぞれ図 9と図 10に示すように安定してから録音し同じ個々 のニューロンのトラック、少なくとも数ヶ月年のタイム スケールのほとんどない慢性の免疫反応を呼び起こすことが。これはよく実験14,の記録を長期にわたってスパイク振幅、不安定なシグナルと慢性的な炎症の減少に苦しむコンベンション深さ電極と比較して重要な利点を表します15しますまた、メッシュ電子が残ってしまう可能性が組織の組織学的断面中に汚損、イメージング、従来のプローブとは対照的であまりにも硬直あるという利点を持ち、したがって組織の前に削除する必要があります。解析。したがって、メッシュ エレクトロニクス各記録サイトを取り巻く細胞環境を正確に勉強する免疫組織化学的解析を使用するユニークな能力を可能にします。
提示プロトコルここ開くまで神経科学における新たな機会をエキサイティングな。低侵襲の配信方法とメッシュ エレクトロニクス脳組織とのシームレスな統合の神経回路への影響を最小限に抑えられます慢性の免疫応答を慢性神経細胞記録実験のほとんどの種類の恩恵を受ける可能性を回避できます。記録し、高齢化など月-年長いプロセスとミリ秒スケール スパイク活性の相関を求めて捜査官に興味の時間の長い期間になります特に同じニューロンを追跡するメッシュ電子機器の能力、脳疾患または脳開発16,18の病因。さらに、そこに存在する実質的な機会を拡張し、デジタル8,35, 多重化のような機能を実装する基板頭段にアクティブな電子機器を追加するなど、このプロトコルをカスタマイズする無線通信35,36,37, と情報処理35、共同組織再生18,38を支援するための電子機器でメッシュ幹細胞またはポリマーを注入 39, と組み込むナノワイヤ電界効果トランジスタ (Fet-北西) にメッシュ電子高度局所と多機能脳プローブ24,29,40,41 ,42。

単一ニューロン分解能で脳をマッピングできるツールの開発は、脳と神経に重要です。脳波、脳磁図 (MEG)、機能的磁気共鳴画像 (fMRI) などの神経の研究のための非侵襲的技術が人間1で動作と脳の活動を関連付けるための貴重な証明されています。3,4それぞれ、スケール構造と基本的なマイクロメータでミリ秒ニューラル ネットワークのダイナミクスを勉強のため2、しかし、彼らは必要な時空間解像度を欠いています。特定の下角 (ECoG) プローブ、膜電位感受性色素を用いた光学的イメージング手法は単体スパイキング活動生体内で5,6, を記録に成功しているが、近くのみ一般的に効果的な脳の表面、浅い脳の研究への適用を制限します。対照的に、埋込型電気プローブの蛍光標識を必要とせずあらゆる脳の領域からの動物を自由に移動の単一ニューロンの電気生理を測定できる、特にそれらがシステム レベルの神経科学に不可欠半導体の微細加工技術をプッシュするいるとチャンネル数は何百、何千人も3,7,8,9に。これらの機能のおかげで埋込型電気プローブが神経科学、神経、視覚系10、神経の治療の情報処理の基礎的研究を含む多くの重要な貢献を作られました。パーキンソン病の11、および脳-機械インタ フェース (BMIs) 補綴12,13のためのデモンストレーションなどの疾患。
それにもかかわらず、明らかにスパイク振幅とヶ月14,15週間の時間スケールの不安定な信号が小さくなるよう長期的な不安定性が限られた比較的短期の研究に埋込型プローブの適用現象は、脳の老化と開発主として未解決の質問を残してします。長期的な不安定性の制限は、従来のプローブとサイズ、力学、およびトポロジ14,15,16,17,18脳組織間の不一致の結果です。サイズの面で一方神経シナプスと突起は、およそ数十ナノメートルから数十 μ m 径19、それぞれ伝統的なプローブが多いシリコン微小電極アレイの場合、大きく > 4 回単一ニューロン細胞体7,8のサイズ。これらのプローブのサイズが比較的大きい破壊自然構造と密な神経組織、したがって慢性の免疫応答への貢献と、検討している神経回路の摂動の接続するかもしれない。機械的性質の面で伝統的なプローブは、彼らが注入される; 非常に柔らかい神経組織よりも大幅に剛性の高い10-20 μ m ポリイミドの厚いシートから作られても「柔軟な」プローブが脳組織20,21よりも硬め、少なくとも 10万回です。この曲げ剛性の不一致には、プローブと脳の組織は、信頼性の低い単一ユニット拡張記録中に追跡し、移植部位で慢性的な神経膠症を誘発するのに至る間の相対的なずれ運動もします。最後に、従来の脳プローブの位相構造は必ずしも組織の固体ボリュームを除外します。トポロジのような不一致神経回路の接続を妨害、ニューロン、グリア細胞、血管脳組織22、内の自然な三次元 (3 D) 貫入分布を排除、3 D 輸送を妨げるシグナリング分子23。一緒に、従来のプローブのこれらの欠点を臨床応用し、単一ニューロン レベルでの縦の神経科学研究を求めて長期的な互換性を下回るそれらしました。
これらの欠点を克服するために我々 はメッシュ エレクトロニクス16,21,24と呼ばれる"組織のような「神経プローブの新しいパラダイムを開発することによって神経系と電子系の間の線をあいまいに求めた。メッシュ電子 (2) 機械的性質脳組織と (3) 3 D のそれらに類似の神経組織のマイクロ サイズ スケールを同じナノメートル (1) 構造機能を組み込むことでサイズ、力学、およびトポロジで上記一致する問題に対処します。マクロポーラス トポロジ > 90% の空間を開き、こうして神経細胞と細胞外の環境による分子の拡散の相互浸透を収容します。メッシュ電子プローブは、注射器と針、脳深部領域21,25にも注入しながら最小限の急性損傷を引き起こす特定の脳領域を正確に配信できます。神経細胞体と軸索が相互に浸透する週間投与後、電子記録とその周辺の脳組織21間のシームレスな神経膠症無料インタ フェースを作成内の 3 D メッシュ電子プローブ構造に示されています。,26,27. これらのユニークな機能は、安定して同じ個々 のニューロンから少なくとも年タイム スケール27上スパイク アクティビティを追跡するメッシュ電子プローブを有効にしています。また、写真平版 (PL) に基づくメッシュ エレクトロニクスの作製は組み込むことが、示されたチャネルでカウント単純接触露光を用いたプローブにつき最大 128 電極電極の数の高いスケーラビリティを提供します28と専門機器29なし周辺電子急速な電気的接続では、プラグ アンド プレイ入出力 (I/O) デザイン。
幅広い研究測定のプロトコルにメッシュの電子機器を組み込むことから寄与するかもしれない。皮質内の記録のほとんどの実験は注射器注入、次の注入、大幅に減らされた免疫反応を介してメッシュ エレクトロニクスの低侵襲の注入手順恩恵し、能力を残してメッシュでエレクトロニクス、後続の組織と各記録サイトを取り巻く生物学的環境の正確な分析のための免疫組織。特に慢性記録実験メッシュ電子の月への年の多数の個々 のニューロンを追跡するためのユニークな能力から値を取得します。この機能が以前、神経回路の縦断的加齢研究、発展途上の脳との病因に問い合わせの調査など実用的な単一ニューロン分解能で研究のための機会を作成します。脳症16。
このプロトコルですべてシリンジ注射メッシュ エレクトロニクス (図 1を参照) を使用して典型的なマウス神経細胞記録実験の重要なステップについて述べる。手順にはメッシュ エレクトロニクスを読み込んで標準的なキャピラリー針、定位注射メッシュ エレクトロニクス生体内で接続の多くの大学で PL ベースの標準的なプロセスを可能な限りメッシュ エレクトロニクスの製造が含まれます、標準計測器インタ フェース、抑制または自由行動録音セッション、およびメッシュ エレクトロニクスを含む脳組織の組織学的区分に I/O をメッシュします。電気インタ フェースや録音である場合は、この手順を省略可能性があります彼らは、組織学研究のみメッシュ エレクトロニクスを使用していくつかの研究者は必要ありません。このプロトコルに慣れ後、捜査官メッシュ エレクトロニクスは、独自の実験に必要なすべての知識が必要です。

<table><tbody><tr><td>電動定位固定装置フレーム</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>MTM-3</td><td>マウス脳定位固定装置用</td></tr><tr><td>512チャンネル録音コントローラー</td><td>インタン・テクノロジー</td>ズ <td>C3004</td><td>神経記録システムRHD2132アンプ</td></tr><tr><td>ボード</td>の部品 <td>インタン・テクノロジー</td>ズ <td>C3314</td><td>神経記録システムの部品</td></tr><tr><td>RHD2000 3フィート超薄型SPIインターフェースケーブル</td><td>Intan Technologies</td><td>C3213</td><td>神経記録システムマウス</td></tr>拘束装置のコンポーネント <tr><td></td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-150&nbsp;STD</td><td>Standard 内径 1.25 インチ。録画セッションを制限しているときにマウスを拘束するために使用されます。</td></tr><tr><td>Siウェーハ</td><td>ノヴァ電子材料</td><td></td><td>3インチ P <100>.001-.005オーム-cm 356-406 &MU;m Thick Prime Grade SSP Si ウェーハ w/2 Semi-Std.フラット& 6,000 A&deg;&plusmn;両面に5%の湿った熱酸化物。</td></tr><tr><td>フォトマスク(ソーダライムガラスにクローム)</td><td>Advance Reproductions</td><td></td><td>Advance Reproductionsと他のベンダーは、提供されたデザインファイルからフォトマスクを製造しています。当社のフォトマスクデザインファイルは、リクエストに応じて、またはリソースWebサイト、meshelectronics.org から入手できます。また、大学のクリーンルームの中には、現場でフォトマスクを作るためのマスクライターを設置しているところもあります。</td></tr><tr><td>AutoCADソフトウェア</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>フォトマスクを描くためのデザインソフトです。無料の代替手段はLayoutEditorです。当社のフォトマスクデザインファイルは、リクエストに応じて、またはリソースWebサイト meshelectronics.org から入手できます。</td></tr><tr><td>熱蒸発器</td><td>シャロンバキューム</td><td></td><td>製造中にNi、Cr、Auをメッシュエレクトロニクスに蒸発させるために使用されます。多くの大学のクリーンルームには、このツールまたは同様のツールがあります。</td></tr><tr><td>SU-8 2000.5 ネガ型フォトレジスト</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>ネガ型フォトレジストは、メッシュエレクトロニクスの底面と上面の不動態化層を定義するために使用されます。</td></tr><tr><td>MA6マスクアライナー</td><td>Karl Suss Microtec AG</td><td></td><td>各フォトマスクをウェーハ上のパターンに位置合わせし、ウェーハをUV光にさらすために使用されます。ほとんどの大学のクリーンルームには、このツールまたは同様のツールがあります。</td></tr><tr><td>SU-8開発会社</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>紫外線を照射した後のSU-8ネガ型フォトレジストの現像に使用します。</td></tr><tr><td>LOR3A リフトオフレジスト</td><td>マイクロケム社</td><td></td><td>Shipley 1805フォトレジストと併用して、金属リフトオフプロセス中のアンダーカットを促進</td></tr><tr><td>Shipley 1805ポジフォトレジスト</td><td>Microposit、The Dow Chemical Company</td><td></td><td>メッシュエレクトロニクスの金属相互接続とPt電極を定義するために使用されるポジフォトレジ</td></tr>スト <tr><td>MF-CD-26ポジティブフォトレジスト開発者</td><td>Microposit、The Dow Chemical Company</td><td></td><td>マスクアライナーでの露光後にS1805ポジ型フォトレジストを現像する。多くの大学のクリーンルームでは、この化学物質を在庫しています。</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>レイノルズテック</td><td></td><td>ポジレジストとネガティブレジストでウェーハをコーティングします。ほとんどの大学のクリーンルームにはスピンコーターがあります。</td></tr><tr><td>PJプラズマ表面処理装置</td><td>ASTプロダクツ(株)</td><td></td><td>水溶液に放出する前にメッシュエレクトロニクスの表面を酸化するために使用されます。ほとんどの大学のクリーンルームには、このツールまたは同様のツールがあります。</td></tr><tr><td>電子ビーム蒸発器</td><td>デントン真空</td><td></td><td>メッシュエレクトロニクスの製造中にCrとPtを蒸発させます。多くの大学のクリーンルームには、このツールまたは同様のツールがあります。</td></tr><tr><td>リムーバーPG</td><td>マイクロケム株式会社</td><td></td><td>金属リフトオフ時にLOR3AとシプリーS1805レジストを溶解するために使用</td></tr><tr>塩化<td>第二鉄溶液</td><td>MGケミカル</td>ズ <td>415-1L</td><td>Niエッチング液の成分</td></tr><tr><td>36%塩酸溶液</td><td>関東</td><td></td><td>Niエッチング液</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリーニードル</td>の成分 <td>Drummond Scientific Co.</td><td></td><td>内径0.40mm、外径0.65mm。他の直径も利用可能です。</td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー U型</td><td>分子デバイス、LLC</td><td>1-HL-U</td><td>脳定位固定剤注射時にガラス毛細血管針を保持するために使用</td></tr><tr><td>1mLシリンジ</td><td>NORM-JECT&reg;, Henke Sass Wolf</td><td></td><td>メッシュ電子機器の毛細血管針への手動装填に使用</td></tr><tr><td>ポリエチレンイントラデミックカテーテルチューブ</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>内径1.19mm、外径1.70mm</td></tr><tr><td>5mLシリンジ</td><td>ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー</td><td></td><td>メッシュエレクトロニクスの注射用シリンジポンプに使用 in vivo</td></tr><tr><td>接眼レンズカメラ</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>DCC1240C</td><td>注射中に毛細血管針内のメッシュ電子機器を表示するために使用されます</td></tr><tr><td>ThorCam uc480 USBカメラ用画像取得ソフトウェア</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>注射中に毛細管針内のメッシュ電子機器を表示するために使用されます</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>PHD 2000</td><td>メッシュ電子機器の注射中に毛細管針を通して溶液の正確な量を流すために使用されます</td></tr><tr><td>EXL-M40歯科用ドリル</td><td>長田</td><td>3144-830</td><td>開頭術の穴あけ用</td></tr><tr><td>0.9 mm ドリルバリ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-09</td><td>開頭術の穴あけ用</td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器 14cm</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-50</td><td>手術器具の滅菌に使用</td></tr><tr><td>CM1950 凍結切片化装置</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td>凍結組織を切片にスライスするために使用されます。多くの大学では、共有施設でこのツールまたは同様のツールを利用できます。</td></tr><tr><td>0.3% Triton x-100</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td>組織学に使用</td></tr><tr><td>5% ヤギ血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td>組織学に使用</td></tr><tr><td>3% ヤギ血清</td> 組織<td>学に使用</td>ライフ<td>テクノロジー</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗NeuN</td><td></td><td>Abcam ab177487</td><td>組織学に使用</td></tr><tr><td>マウス抗ニューロフィラメント</td><td>Abcam</td><td>ab8135</td><td>組織学に使用</td></tr><tr><td>ラット抗GFAP</td>法 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社</td><td>PA516291</td><td>組織学に使用</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社</td><td>P36930</td><td>組織学に使用</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>P6407-5MG</td><td>分子量=70-150kDA</td></tr><tr><td>ライトアングルエンドクランプ</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RA180/M</td><td>ピペットホルダーを脳定位固定装置フレームに取り付けるために使用されます</td></tr><tr><td>プリント回路基板(PCB)</td><td>アドバンストサーキット</td><td></td><td>メッシュエレクトロニクスとIntanレコーディングシステムなどの周辺測定エレクトロニクスとの間のインターフェースに使用されます。Advanced Circuitsおよびその他のベンダーは、提供された設計ファイルに基づいてPCBを製造および組み立てます。当社のPCB設計ファイルは、ご要望に応じて、またはリソースサイト meshelectronics.org</td></tr><tr><td>32チャネル標準アンプコネクタ</td><td>Omnetics Connector Corp.で入手できます。</td><td>A79024-001</td><td>基板上に実装された部品</td></tr><tr><td>32チャンネルフラットフレキシブルケーブル(FFC)</td><td>Molex, LLC</td><td>152660339</td><td>基板実装されたZIFコネクタとメッシュ電子機器のI/Oパッドと接続する際のクランプ基板として使用</td></tr><tr><td>32チャネルゼロ挿入力(ZIF)コネクタ</td><td>広瀬電機株式会社</td><td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td><td>基板に実装された部品</td></tr></tbody></table>

注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

埋込型脳生理プローブは、浅部と深部脳領域から高時空間解像度の神経活動を記録する神経科学の能力のための貴重なツールが。その使用が妨げられている、しかし、プローブと脳の機械的、構造的不一致によって組織は一般的に微動につながる、生じる神経膠症信号慢性記録実験で不安定。対照的に、シリンジ注入ウルトラフレキシブル メッシュ電子の注入の後にメッシュ プローブ フォーム少なくとも 1 年間に個々 のニューロンの安定したトラッキングを可能にする周囲の脳組織をシームレスに、神経膠症無料インターフェイスタイム スケール。このプロトコルの詳細シリンジ注射を使用して典型的なマウス神経細胞記録実験で重要なステップ メッシュ標準写真平版ベース プロセスで可能な読み込み、多くの大学でメッシュ エレクトロニクスの作製を含む電子機器標準的なキャピラリー針、定位注射の体内入力/出力標準計測器インタ フェース、拘束または自由にレコーディング セッションを移動して脳の断面組織学的メッシュの接続にエレクトロニクスをメッシュします。エレクトロニクスをメッシュ組織を含みます。代表的な記録および組織データが掲載されています。このプロトコルに精通している調査官でお越しの独自の実験にメッシュの電子機器を組み込むし、高齢化の研究など、長期的な安定した神経インタ フェースによって与えられるユニークな機会の活用に必要な知識プロセス、脳の発達、脳の疾患の病因。

結果は、研究対象となる脳の領域、注入からの経過時間、注入、およびプロシージャ、その他の要因の間でのインタ フェース I/O の成功時に急性被害量の動物種によって異なります。単体スパイキング アクティビティが 1 週間後まで 4-6 週間ごと注入とスパイク振幅が異なる場合 (150 μ m の内径針) の場合 1 日まで表示されません。図 9は、海馬と大人の男性 c57bl/6 j マウスの大脳皮質一次体性感覚野に注入 32 ch メッシュ電子プローブから代表的な電気生理学的データを示しています。全 32 チャンネルの約 300 μ V 振幅局所電界電位 (LFPs) を記録し、単体スパイキング活動は 26 チャンネルに記録されました。LFPs と孤立したスパイクは、2 と 4 ヶ月、この期間に長時間記録電子とニューロン間の安定性の高いインターフェイスを示唆している間同じような残った。図 10は、組織切片の代表の結果とメッシュの電子注入後 1 年を含む脳組織の免疫染色を示します。NeuN、神経突起とニューロ フィラメント、神経軸索のマーカーのマーカーの染色メッシュ エレクトロニクスと脳組織の間のシームレスなインタ フェースの意味、注射部位の組織密度ののほとんどの損失を明らかに します。さらに GFAP (アストロ サイトのマーカー) の染色メッシュ電子、その存在が少し慢性的な免疫応答を誘発することを示すの周りのアストロ サイトのバック グラウンドに近いレベルを明らかにします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> 図 1: 注射器注射の手順メッシュ エレクトロニクス実験。このプロトコルは、メッシュ エレクトロニクスを用いた典型的な齧歯動物の神経細胞記録実験ですべてのキーの手順を説明します。実験通常伴う、実装、メッシュ エレクトロニクスの作製 (1)、(2) キャピラリー針へメッシュ エレクトロニクスの読み込みの順序でメッシュ電子の脳、メッシュへのインタ フェース (4) 電気 I/O 注入 (3) 脳定位固定装置エレクトロニクス、(5) の抑制または自由に移動録音、(6) メッシュ/組織区分および組織学のための汚損します。いくつかの研究で、手順 (4) と (5) をスキップできます、その場合、組織データのみを必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> 図 2: ウルトラフレキシブル デバイス領域 (上段) でプラグ アンド プレイ メッシュ エレクトロニクス製作過程を描いた模式図、幹配線領域 (中段) と I/O 領域 (下の行).(A) SU 8 ネガ型フォトレジスト (赤)、PL マスク - 1 各プラグ アンド プレイ メッシュ電子プローブの層を不動態化下部を定義するパターンします。PL マスク 2、熱蒸発金属リフトオフと (B) のパターン定義 Au 配線や I/O パッド (ゴールド)。PL マスク 3、電子ビーム蒸着、金属リフトオフと (C) パターンは、白金電極 (青) を定義します。(D) SU 8 ネガ型フォトレジスト (赤)、PL マスク - 4 トップのパッシベーション層を定義するパターンします。SU 8 の開口部は、各 pt と I/O パッドで残っています。(E) A の完成品は、上部、中部、下部の行に拡大位置を示す点線のボックスと電子プローブをメッシュします。フォトマスク設計ファイルは著者またはリソース サイトから要求で使用可能な meshelectronics.org。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> 図 3: 写真やプラグ アンド プレイの光学顕微鏡画像メッシュ エレクトロニクス。(A) プラグ アンド プレイ I/O 付きシリンジ注射メッシュ電子プローブの光学顕微鏡画像を並べて表示します。製造の完了手順を図 2に、Ni 被覆基板からリリースする前にした後、プローブをイメージしました。破線のボックスは左から右ウルトラフレキシブル デバイス領域、幹、および I/O 領域拡大 C、D、および E は、それぞれのセクションに対応しています。スケール バー = 1 ミリメートル。 (B) 完成品 20 を含む 3 インチ Si ウェハの写真メッシュ電子プローブ。スケール バー = 20 mm (C) 光顕微鏡画像ウルトラフレキシブル デバイス領域で 20 μ m 径 Pt 記録電極の。スケールバー = 100 μ m (D) 光顕微鏡画像高密度 Au の配線領域を幹に。各 Au 配線は電気的に絶縁し、単一 Pt 電極を単一の I/O パッドに接続します。スケールバー = 100 μ m (E) 光学顕微鏡画像の I/O パッド。各パッドは、折りたたみ可能なメッシュ領域と茎に位置する連続薄膜領域で構成されています。非伝導性 SU 8 リボンの配置を維持するために一緒にパッドのメッシュ部分に接続します。スケール バー = 200 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> 図 4: 注入時に血管針を保持するための装置の組立。(A) 装置の部品の写真。コンポーネントは、ピペット ホルダーとピペット ホルダー (4) 円錐形洗濯機 (1) ガラス キャピラリー針、ピペット ホルダーの (2)、(3) の円形のねじを。項目 (2) から (4) は、ピペット ホルダーの購入に含まれています。矢印は、エポキシ樹脂で接着する必要があるピペット ホルダーのアウトレットをマークします。(B) アセンブリとガラス キャピラリー針の挿入後ピペット ホルダーの写真。エポキシ添加はピペット ホルダーの (矢印で示されます) の上のコンセントで表示され、キャピラリー チューブは注射器 (表示されていません) にピペット ホルダーを接続します。(C) 写真ピペット ホルダーと直角終了クランプ固定フレームに付着後キャピラリーの針。スケール バーは、1 cm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> 図 5: ガラス針を読み込んでメッシュ エレクトロニクス。(A) プラグ アンド プレイ メッシュ エレクトロニクスのローディングのプロシージャの模式図。ガラス針メッシュ電子プローブの入出力端の近くに配置するとソリューションで中断中。シリンジのプランジャーがメッシュ電子プローブを描画する手動で取り消されたし。針の端のちょうど内側ウルトラフレキシブル デバイス領域は、理想的な位置です。(B) 写真 (A) に対応するガラス針に読み込まれているメッシュ電子プローブの。スケール バー = 2 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> 図 6: 定位手術駅のスケマティック。添付ピペット ホルダー付き電動固定装置用フレーム (A) を使用して、必要な脳の領域に針を配置します。読み込まれたメッシュ電子・針の位置が対物レンズで監視カメラ (B) を添付し、コンピューター (C) に表示されます。シリンジ ポンプ (D) は、必要な脳の領域にメッシュ エレクトロニクスの制御、正確な注入を可能にする針を生理食塩水の正確なボリュームを流れています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> 図 7: プラグ アンド プレイ I/O プロシージャをインタ フェースします。(A)「FFC 基板をクランプ直上に隣接する歯科用セメントで固定されています。(B) プラグ アンド プレイ メッシュ電子てんかん FoV メソッドを使用して必要な脳の領域に注入されます。(C) メッシュの I/O パッド付きの針電子プローブの中でも、基板をクランプ FFC の位置が変更されました。(D) 流れが基板をクランプ FFC に I/O パッドを取り出し針を再開します。(E) I/O パッドは導電面を上に向けて展開し、場所で乾燥させた茎を基準にして曲がって 90 ° です。(F) FFC 基板は、I/O パッドの端から直線 ca。 0.5 mm にハサミでトリミングされます。余分な基板をカット離れて 32 ch ZIF コネクタに挿入できるようにします。(G) I/O パッドは、カスタム プリント基板にマウントされている 32 ch ZIF コネクタに挿入されます。ZIF コネクタ ラッチを閉じた I/O パッドとの接触。(H) ラッチを固めた閉鎖、PCB が頭蓋骨の上に反転され、PCB は歯科用セメントで固定します。(私) の基板は録音セッション時に簡単なインタ フェースの標準アンプ コネクタ付きコンパクト パッチアンプ用アダプターを形成します。スケール バー = 1 cm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> 図 8: 拘束と自由に移動録音します。記録セッション中に落で男性 c57bl/6 j マウスの (A) の写真。32 チャンネルのプリアンプ基板は、標準的なアンプのコネクタに挿入されています。(B) 自由に移動記録実験中に 32 ch プリアンプ基板と同じマウスの写真。スケール バー = 1 cm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> 図 9: 代表的な神経細胞記録結果。(A) 代表 LFP 32 チャンネルからヒート マップ メッシュ マウス海馬と体性感覚野に注入される電子プローブ。マウスは、2 ヶ月 (上) と (下) の 4 ヶ月投与後にそのケージを自由に探索しながらデータを記録しました。LFP 振幅は右にあるカラー バーによると色分けされています。高域通過フィルター処理されたトレース (ブラック) スパイク活性を示すスペクトロ グラム上の 32 のチャネルごとに重ね。(B) スパイク (A) でプロットされたデータの並べ替え後に分離されました。32 チャンネル両方投与 2 ヶ月後 (上) と 4 ヶ月投与後 (下) の 26 単体スパイキング アクティビティが検出されました。スパイクの各クラスター上の数字は、(A) のチャネル番号に対応しています。この図は、フー、らから変更されています。28.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> 図 10: 代表的な組織の結果。メッシュ電子水平 (中央のパネル) 内での方向を示す (A) の回路図および矢状面 (底板) 脳スライス。(B) 10 μ m 厚い皮質脳スライス 16 チャネル メッシュ電子プローブの注入後 1 年間の蛍光顕微鏡像。スライスは、NeuN (緑) の immunostained をされています。ニューロ フィラメント (赤) の同じ脳スライス (C) immunostained。(D) GFAP (シアン) の同じ脳スライス immunostained。(E) A の複合画像 (B) (D) をメッシュのエレクトロニクス/組織を示すラベルの付いた NeuN (緑)、ニューロ フィラメント (赤)、GFAP (シアン) とエレクトロニクス (青) をメッシュします。スケール バー = 100 μ m。この図は、Fuらから変更されています。27.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補助ビデオ 1: 読み込みとソリューションにメッシュ電子の注入を繰り返される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

メッシュ電子プローブとシームレスに統合脳内記録安定した、長期的な単一ニューロンのレベルを提供します。このプロトコルは、生体内で実験、メッシュを含む組織の組織学、結果、記録、入力/出力インターフェイス定位注射針を読み込んでメッシュ製品の作製を含むメッシュ エレクトロニクスプローブ。

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

この方法は、老化プロセスが脳にどのように現れるか、脳がどのように発達するか、脳疾患がどのように発生および進行するかなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、メッシュエレクトロニクスが脳に埋め込まれると神経膠症の慢性免疫応答を引き起こさず、周囲の神経組織とのシームレスな統合を可能にすることです。この手順を実演するのは、Lieber Groupの大学院生であるTao Zhou氏と、Lieber GroupのポスドクであるJung Min Lee氏です。手順を開始するには、クリーンなシリコンウェーハを熱蒸発器にロードし、100ナノメートルのニッケルを蒸発させます。次に、SU-8 2000.5ネガ型フォトレジストをウェーハ上に毎分400回転でスピンコートし、SU-8の厚さを約400〜500ナノメートルにします。ウェーハをマスクアライナーにセットし、SU-8をボトムメッシュSU-8層に対応するフォトリソグラフィーマスクで露光します。1平方センチメートルあたり100ミリジュールのIライン線量で露光します。それら、SU-8現像液のウェーハinaトレイを浸します。SU-8のメッシュパターンが完全に発達するまで、溶液を2分間静かに攪拌します。次に、イソプロピルアルコールのトレイでウェーハを1分間すすぎ、ブロードライします。ウエハースをホットプレートで摂氏180度で1時間ハードベークします。その後、LOR 3Aをウェーハに4, 000回転/分でスピンコートし、約300ナノメートルの厚さにします。スピンコートS1805ポジティブフォトレジストを毎分4、000回転で約500ナノメートルの厚さでコーティングします。続いて、ウェーハをマスクアライナーにロードして、金属相互接続に対応するフォトリソグラフィーマスク2と入力、出力パッドでS1805を露光します。40ミリジュール/平方センチメートルのHライン線量で露光し、ウェーハをCD-26フォトレジスト現像液のトレイに浸します。金属相互接続パターンが完全に発達するまで、溶液を1分間静かに攪拌します。脱イオン水のトレイでウェーハを1分間すすぎ、吹き飛ばして乾かします。次に、3ナノメートルのクロムを熱蒸発させ、続いて80ナノメートルの金を蒸発させます。ウェーハをリムーバーPGの平らなビーカーに約3時間浸し、金属が完全にアンダーカットされるまで、金属をメッシュエレクトロニクスの望みの相互接続と入力、出力パッド領域にのみ残します。スピンコーティング、リソグラフィー、蒸着、リフトオフを繰り返して、電極領域に3ナノメートルのクロムと50ナノメートルの白金を残します。その後、SU-8のスピンコーティングとフォトリソグラフィーを繰り返して、SU-8メッシュの最上層を定義します。ウェーハを50ワットの酸素プラズマで1分間処理します。その後、メッシュエレクトロニクスがシリコンウェーハから完全に解放されるまで、ウェーハを溶液中のニッケルエッチングに約3時間浸します。パスツールピペットを使用して、放出されたメッシュ電子プローブをニッケルエッチングから100ミリリットルの脱イオン水ビーカーに移します。次に、メッシュ電子機器を脱イオン水の新鮮なビーカーに少なくとも3回移して、すすぎを確保します。メッシュエレクトロニクスを針にロードするには、メッシュエレクトロニクスを含むPBSの100ミリリットルビーカーにガラスキャピラリーニードルを挿入します。針の端をメッシュ電子プローブの入力パッド、出力パッドの近くに置き、シリンジを手動で引っ込めてメッシュ電子プローブを針に引き込みます。シリンジプランジャーを生理食塩水に浸したまま押したり引いたりして、針内のメッシュ電子機器の位置を調整します。メッシュエレクトロニクスをマウスの脳に注入するには、歯科用ドリルと脳定位固定装置フレームを使用して、頭蓋骨の目的の座標で開頭術を開きます。注射部位から離れた場所で2回目の開頭術を開き、ステンレス製のグラフネジまたはワイヤーを挿入します。次に、クランプ基材をデンタルセメントで頭蓋骨に固定します。基材に約1mm幅の切り込みを入れると、手順の後半の折り畳みステップの信頼性が向上します。その後、メッシュ電子機器が入った針付きのピペットホルダーを、直角エンドクランプを使用して脳定位固定装置フレームに取り付けます。ピペットホルダーのサイドアウトレットを、長さ0.5〜1メートルのキャピラリーチューブを備えたシリンジポンプに固定された5ミリリットルのシリンジに取り付けます。次に、脳定位固定装置フレームを使用して、針の先端を脳内の目的の開始位置に配置します。ガラス針内のメッシュエレクトロニクスプローブの上部が表示されるようにカメラを配置します。シリンジポンプを低速に設定し、スタートを押してフローを開始します。メッシュエレクトロニクスプローブが針内で動かない場合は、流量をゆっくりと増やします。メッシュエレクトロニクスプローブが針内を動き始めたら、脳定位固定装置フレームを使用して、メッシュエレクトロニクスプローブが注入されるのと同じ速度で針を引っ込めます。生理食塩水を流し続け、針が頭蓋骨から出るまで針を引っ込めます。次に、シリンジポンプからの流れを止めます。この手順では、定位固定装置フレームを使用して、隙間を横切る平らで柔軟なケーブルクランプ基板に針を慎重にガイドし、シリンジポンプで溶液を流してメッシュ電子機器の相互接続にたるみを発生させます。針がクランプ基板の上に来てギャップを横切ったら、流れを速い速度で再開して、メッシュ電子機器の入力、出力パッドをクランプ基板に注入します。ピンセットと脱イオン水のピペットを使用して、入力パッド、出力パッドを最初の入力パッドにできるだけ近い90度の角度に曲げます。入力後、出力パッドは整列して折り畳まれ、メッシュステムに対して90度の角度で、穏やかに流れる圧縮空気で所定の位置に乾燥します。入力、出力パッドの端から約0.5〜1ミリメートルの狭い端でクランプ基板を切断します。また、PCBに取り付けられた32チャネルzifコネクタへの挿入を妨げるクランプ基板の無関係な部分を切り取ります。次に、入力、出力パッドをPCBのzifコネクタに挿入し、ラッチを閉じます。測定用電子機器を使用して、チャンネルとアースネジ間のインピーダンスを測定し、インターフェースが成功したことを確認します。インピーダンス値が高すぎる場合は、zif コネクタのラッチを外し、挿入を調整し、接続が成功したことを確認するまで再テストします。次に、zifコネクタと露出したメッシュ電子機器の相互接続を歯科用セメントで覆って保護します。基板の隙間でPCBを裏返し、PCBをセメントでマウスの頭蓋骨に固定します。自由に動き回る録音の場合は、プリを挿入した後、マウスを拘束装置から離します amplifier PCBと基準ネジを接地します。データ収集システムを使用して、マウスが自由に動作している間、必要な時間だけ記録します。ここに示されているのは、マウスの海馬と体性感覚皮質に注入された32チャネルメッシュエレクトロニクスプローブからの代表的な局所フィールドヒートマップです。データは、マウスが注入後2か月と4か月でケージを自由に探索している間に記録されました。局所電界電位振幅は、右側のカラーバーに従って色分けされています。スパイク活性を示すハイパスフィルタートレース(黒)が、32チャンネルのそれぞれのスペクトログラムにオーバーレイされています。プロットされたデータを並べ替えた後に分離されたスパイクを次に示します。シングルユニットのスパイク活性は、32チャンネルのうち26チャンネルで、注射後2か月と注射後4か月の両方で検出されました。この手順を試行する際は、I/Oインターフェースをテストして、メッシュエレクトロニクスプローブへの電気的接続が成功したことを確認することを忘れないでください。インピーダンスの測定は、問題の原因をトラブルシューティングするのに役立ち、インターフェースや製造の問題を特定するために重要です。この手順に続いて、記録された各電極の周囲の細胞環境を研究するために組織学を行うことができます。従来の硬性脳プローブとは異なり、メッシュエレクトロニクスは組織学中に組織内に残すことができるため、電気生理学データと免疫組織化学分析とを正確に相関させることができます。

syringe-injectable-mesh-electronics-for-stable-chronic-rodent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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マウス脳における安定した単一ニューロン記録のための注射可能なメッシュエレクトロニクス

出典: Lai, J., et al. げっ歯類脳における電気生理学的記録と抑制剤のマイクロインジェクションの同時投与J. Vis.

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複数のフレキシブルポリマー電極アレイの慢性移植

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複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

ここでは、使いやすさ、プローブの回収率、実験の汎用性、および行動との適合性が最適化された、げっ歯類の慢性電気生理学用の軽量で費用対効果の高いプローブインプラントシステムを紹介します。...

DREAMインプラント:頭部固定マウスと自由行動マウスの慢性電気生理学のための軽量でモジュール式で費用対効果の高いインプラントシステム

このプロトコルは、自由に動くげっ歯類の脳波を記録するための信頼性が高く、簡単にアクセスできるシステムを作成するために開発されました。...

自由に動くマウスにおける慢性マルチサイト脳波記録のための費用対効果が高く低侵襲なプロトコル

学ぶメッシュ電子工学を用いたマウス脳への長期的な単一ニューロン記録法。シームレスな神経組織との統合を実現し、脳の老化や発育、疾患の研究に有用な神経科学的手法です。

注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理

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