ベンチトップ固定金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、再構成し、Polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き

この方法により、学部生は鉄結合性金属酵素を迅速に精製し、そのタンパク質を使用して構造と機能に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、非ヘム鉄結合酵素に適用できることです。学部生が利用でき、教育研究室ですぐに実装できます。

この手順を開始するには、ルアーロックアウトレット、ルアーロックフィッティングも含まれる上部キャップ、および樹脂粒子を保持するための下部ベッドサポートを備えた1.5 x 20 cmのカラムを用意します。下部のルアーロックフィッティングにストップコックを取り付けて、流れを制御します。次に、以前に摂氏4度で保存したニッケル結合ニトリロ酢酸樹脂を20%エタノールに50%スラリーしたボトルを入手します。

ボトルを静かに回して、レジンを均一に再懸濁します。室温で作業し、目盛り付きピペットを使用してスラリーを2mm取り出し、カラムに移します。余分な保存液がレジンから排出されたら、パスツールピペットを使用して、レジン表面を乱さないように、少なくとも30ミリリットルの冷却溶解結合バッファーを慎重に追加します。

水しぶきを防ぐために、バッファーを柱の壁に通します。緩衝液が重力によってカラムからゆっくりと収集ビーカーに排出されるようにすることで、樹脂を平衡化します。まず、ストップコックを開き、残りの溶解結合バッファーをニッケルNTA樹脂を介して重力で排出させることにより、無細胞原油抽出物を添加するためのnickel-NTAカラムを準備します。

バッファーが完全に排出され、樹脂表面が露出したら、活栓を閉じます。次に、パスツールピペットを使用して、表面を乱さないように注意しながら、無細胞の粗抽出物を慎重に樹脂にピペットで移します。原油抽出物をカラムの壁に流して、飛散を防ぎます。

すべての粗抽出物がカラムに移されたら、ストップコックを開いて、カラムが重力によって排出できるようにします。後で分析するために、フロースルーの100マイクロリットルを収集します。短い長さのプラスチックチューブを使用して、10 ミリリットルのルアーロックシリンジをカラムのキャップに接続します。

シリンジプランジャーを引き出し、カラムキャップをカラムの上部にしっかりと充填します。溶離液をメスシリンダーに集めながらプランジャーを静かに圧縮し、手動で流量を評価します。1分あたり1〜2ミリリットルの速度は、樹脂および実験装置に適合します。

流量が遅くなるにつれて、シリンジプランジャーの圧縮をゆっくりと増加させます。塗布した液体のメニスカスが樹脂ベッドより5〜10ミリリットル上に達したら、カラムキャップと付属のハンドポンプを取り外して、樹脂への空気の混入を防ぎます。残りのボリュームを重力で排出させます。

粗抽出物の水気を切らし、再び樹脂表面を露出させた後、パスツールピペットを使用して、樹脂表面を乱さないように注意しながら、約30ミリリットルの冷やした洗浄バッファーをカラムに慎重に追加します。ストップコックを開き、ウォッシュバッファーをカラムから排出します。カラムが排出されている間に、フラクション回収のために16本の微量遠心チューブを標識します。

バッファーが完全に排出され、樹脂表面が再び露出したら、活栓を閉じます。パスツールピペットを使用して、レジンの表面を乱さないように注意しながら、冷却した溶出バッファーをカラムに約30ミリリットル慎重に追加します。次に、ストップコックをゆっくりと開き、溶出バッファーがカラムからポリヒスチジンタグ付きタンパク質を溶出させます。

マークを付けた各微量遠心チューブに1ミリリットルの溶離液を回収します。タンパク質を試験した後、タンパク質含有画分をきれいな円錐形のチューブに結合します。金属イオン補因子の再構成を進めるか、タンパク質をマイナス80°Cで3ミリリットルのアリコートで凍結します。

金属の再構成を開始するには、溶出緩衝液に懸濁した精製酵素の3ミリリットルのアリコートを氷の上に置きます。チューブ内のタンパク質の量を使用して、サンプル中のそれぞれの最終濃度が12.5ミリモルになるように、必要なアスコルビン酸ナトリウムとジチオスレイトールの量を計算します。固体のアスコルビン酸ナトリウムとジチオスレイトールを加え、穏やかに、しかし完全に混ぜ合わせます。

固形の硫酸鉄七水和物の1ミリリットルの顆粒を数個、計量紙に軽くたたいます。紙を顆粒の上に折り、金属ヘラの平らな面で押しつぶします。得られた粉末の粒をタンパク質溶液を含むチューブに加えます。

渦を巻いて混ぜると、バラ色がかったピンク色になります。チューブにキャップをし、ピンク色の溶液を氷の上で10〜30分間インキュベートします。ピンク色は時間が経つと色あせていきます。

ゲルろ過には、1.5 x 12 cmのカラムに10 mLの球状ポリアクリルアミドゲルを充填したゲルろ過カラムを使用します。このカラムには10 mmリットルのリザーバーも装備されています。次に、テキストプロトコルで概説されているように列を平衡化します。バッファーがカラムから排出され、上部ベッドサポートが露出したら、ストップコックを閉じます。

鉄2再構成金属酵素の3ミリリットル溶液を露出した上部ベッドサポートにピペットで移します。ストップコックを開き、3ミリリットルのサンプル全体を重力によってカラムに入れます。最初の3ミリリットルの溶離液を廃棄します。

溶液の取り扱い中に形成されるピンク色は、カラムの上部に閉じ込められます。カラムの滴下が止まり、上部ベッドのサポートが露出したら、4 ミリリットルのゲルろ過バッファーを追加し、8.5 ミリリットルの画分に対して 4 ミリリットルの溶離液を収集します。タンパク質含有画分を組み合わせた後、テキストプロトコルに概説されているように、サンプルのアッセイまたは保存を進めます。

この研究では、学生はポリヒスチジンタグ付き非ヘム鉄結合ジオキシゲナーゼを精製し、その後再構成しました。SDS-PAGE解析により、タグ付きタンパク質が効果的に精製されていることが分かります。ここには、精製されたL-ドーパジオキシゲナーゼを鉄2で再構成し、その後のゲルろ過後の酵素作用に関する学生が収集した活性データが示されています。

データ収集が始まるまでに5秒の遅れが生じるのは、この手法を初めて実行する学生に典型的なものです。定常状態アッセイは、進行曲線を適合させることによって決定される速度論的パラメータが、公表された結果と一致していることを示しています。この手順を試みる際には、鉄分が多すぎるとタンパク質の沈殿を引き起こすため、鉄分が多いほど良いわけではないことを覚えておくことが重要です。

タンパク質の3〜5モル過剰の鉄濃度で十分です。この手順に従って、学生は溶液の構造を測定したり、酵素や基質依存性の化学を調べたり、反応メカニズムに関する追加の質問に答えるための追加の実験を行うことができます。