Name: ベンチトップ固定金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、再構成し、Polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによるポリヒスチジン標識非ヘム鉄結合ジオキシゲナーゼの精製と再構成法。学部生が酵素構造と機能を実験で探究できる教育用プロトコルです。

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この文書はグラント号下の国立科学財団によってサポートされる作業に基づいてください。 チェ 1708237。

1. 浄化のための準備
<ol><li>細胞粗抽出物の調製<ol>
<li>大腸菌(BL21) 50 mL コニカル チューブで polyhistidine タグ付きの金属タンパク質25を過剰発現の 9 ~ 10 g 細胞ペレットを取得します。</li>
		<li>容量は 45 〜 50 mL の細胞ペレットの 9 ~ 10 g ルーム一時換散/バインド バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール ph 8) の 1 グラムあたり 5 mL を追加します。定期的に溶解を促進する渦。ペレットが固定されている場合は、ぬるま湯のお風呂で解凍します。</li>
		<li>セル換散のための準備で 〜 3 ° C に細胞懸濁液を冷やす氷水浴室を使用して。 注: この時点で、超音波処理、ビード切削または別の方法でセル換散は可能です。それは急速な比較的安価な耳の保護具を必要としないので、ビード切削がここに示されています。</li>
		<li>製造元の指示に従ってチャンバーを加工 50 mL ビーズを組み立てます。</li>
		<li>塗りつぶしの完全な半分ビーズ ミル室冷蔵-20 ° C で保存されている 0.1 mm ガラスビーズ</li>
		<li>チルド細胞懸濁液と商工会議所の残りの部分を埋めるし、完全にチャンバーに 4 ° C の溶解/バインド バッファーを使用します。</li>
		<li>ビーズ工場のシャフトを回転させ、細胞懸濁液を混ぜて、ビーズに小さなヘラを使用します。</li>
		<li>、ピペットを使い、任意の大きな泡を削除し、上ふたをネジします。</li>
		<li>チャンバー任意の漏れからを完全に乾かし。</li>
		<li>氷いっぱいのジャケットと閉じてネジに 50 mL の充填室を反転、プラスチック ジャケットに氷の約 1 カップを追加します。</li>
		<li>モーターにアイス ジャケット室を確保します。</li>
		<li>15,800 rpm で 15 秒間ビーズ ミルをモーターで回転し、45 秒間休むことができます。8 回繰り返します。</li>
		<li>8 サイクルが完了したら、全体のセル換散のサスペンションをデカント 50 mL に大きいチューブ高速遠心分離 (25,000 g 以上) の評価を受けています。細胞の破片やガラスのビーズをペレットへの 4 ° C で 40-45 分遠心分離機と 25,000 x g でスピンでバランスの取れたチューブのペアを配置します。 注: 50 mL と高速遠心分離のための評価より大きい管が利用できない場合削除ガラス ビーズで遠心分離 50 mL の円錐管より小さいべリにデカントすることができますセル中断 (〜 25 mL) の小さいボリュームを生成するために 2 〜 3 分の g x 1000-2000e チューブ高速遠心分離の評価を受けています。</li>
		<li>遠心分離が完了したら、携帯無料クリア、イエローをデカント、きれいな 50 mL の円錐管に原油を抽出します。任意の細胞の残骸を転送しないように注意して取る。</li>
		<li>SDS ページ26の浄化の後で分析細胞粗抽出物の小さなサンプルを収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>IMAC のコラムの準備<ol>
<li>樹脂粒子、ルアーロック ロック コンセントとルアー ロック継ぎ手を含む上部のキャップを保持する下のベッド サポート装備 1.5 x 20 cm 列を取得します。流れを制御するバルブのルアーロック コンセントに適合します。</li>
		<li>リング スタンドに列をマウントするベンチトップで働いて、しっかりと。</li>
		<li>4 ° C で保存されている 20% エタノールでニッケル バインド nitriloacetic 酸 (Ni NTA) 樹脂の 50% のスラリーを取得します。</li>
		<li>軽く均等に樹脂を再停止するボトルを旋回します。</li>
		<li>作業室温とベンチトップ、卒業ピペット 2 mL の 1 mL をもたらすスラリーを撤回する定住樹脂 polyhistidine の 50-60 mg を結合できる蛋白質のタグし、列にスラリーを転送を使用します。</li>
		<li>活栓を開き、樹脂から重力によって流出する余分なストレージ ソリューションを許可します。</li>
		<li>安全に、活栓を閉じる</li>
		<li>パスツール ピペットを使用して慎重に冷やして換散/バインド バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール ph 8) を追加して樹脂-少なくとも 30 mL カラム。樹脂表面を邪魔しないように注意してください。飛散防止のための列の壁をバッファーを実行します。</li>
		<li>コレクション ビーカーに重力によって列からゆっくり流出する溶解/バインド バッファーを許可することで、樹脂を平衡します。</li>
		<li>バインド/換散バッファーに排水している主 ~ 5 mL の溶解バッファーが樹脂の上に残っている場合、バッファーの流れを停止する活栓を閉じ、直立、続行する準備ができるまで、1 週間をマウントされている列のまま。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. IMAC で Polyhistidine タグ ターゲットの浄化
<ol><li>洗浄バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール pH 8) と溶出バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール、10% グリセリン pH 8) を準備します。4 ° C でチルします。</li>
	<li>原油の無細胞抽出液添加の活栓を開いて、Ni NTA 樹脂を介して重力によって排出する換/結合バッファーの残りを許可する Ni NTA 列を準備します。すべてのバッファーに排水しているし、樹脂表面がさらされて、活栓を閉じる。</li>
	<li>携帯無料原油をパスツール ピペットで移しなさい、慎重にピペットを使用して樹脂で表面を邪魔しないように世話に抽出します。飛散防止のための列の壁を粗抽出を実行します。適用される粗野なエキスの量は polyhistidine タグ付きタンパク質の発現のレベルに依存粗抽出物の総量 50-60 mg が含まれていることを確認または Ni NTA 樹脂の mL あたりターゲット蛋白質の少ない (ステップ 1.2.4 を参照してください)。</li>
	<li>粗野なエキスのすべては列に転送されているとき、活栓を開いて列を重力によって排出することができます。この流れは、樹脂-SDS-PAGE による浄化の後の分析のため収集 100 μ L にバインドされないタンパク質で構成されます。26
</li>
	<li>原油無細胞抽出液の粘度はかなり列の重力流れを遅くできます。流れの速度を上げるには、単純な「ハンドポンプ」を適用します。<ol>
<li>10 mL ルアーロック注射器を取るし、プラスチック製のチューブと列キャップと注射器の間ルアーロック継手の短い長さを使用して、列のキャップに接続します。シリンジのプランジャーを引き出すし、列の上部にある列キャップに収まります。</li>
		<li>優しく; メスシリンダーに溶離液を集めることによって流量を手動で評価しながら、シリンジのプランジャーを圧縮します。1-2 mL の 1 分あたりの料金は、樹脂とこのセットアップと互換性が。流量が低下、ゆっくりシリンジのプランジャーの圧縮を上げます。</li>
		<li>樹脂への空気の導入を防ぐためには、列の cap を削除し応用液体のメニスカス樹脂ベッドの上の 5-10 の mm に達すると手押しポンプを接続でき、重力によって排出する残りのボリューム。</li>
	</ol>
</li>
	<li>携帯無料粗抽出物が排水完了し、樹脂表面は再び公開されている慎重に樹脂表面を邪魔しないように世話コラムに 〜 30 mL の冷製洗浄バッファーを追加するのにパスツール ピペットを使用します。飛散防止のための列の壁をバッファーを実行します。</li>
	<li>活栓を開き、列を通って流出する洗浄バッファーを許可します。このプロセスは、樹脂から弱結合蛋白質が削除されます。溶離液を破棄します。</li>
	<li>洗浄バッファーを排水すると、準備、16 というラベルの付いた、1 mL の一部分を収集するためのマイクロ遠心チューブ用。</li>
	<li>洗浄バッファーに排水しているし、樹脂面が再び露出、活栓を閉じる。慎重に 〜 30 mL のチルドの溶出バッファーを列-樹脂表面を邪魔しないように世話に追加するのにパスツール ピペットを使用します。飛散防止のための列の壁をバッファーを実行します。</li>
	<li>活栓をゆっくり開くし、列から polyhistidine タグ付きタンパク質を溶出溶出バッファーを許可します。マーク マイクロ遠心チューブ用、16 までの 1 の各溶離液の 1 mL を収集します。</li>
	<li>ブラッドフォードの試金など特定の方法に従って紫外可視分光測色的蛋白質の試金の試薬や機器のメーカー27,28を用いたタンパク質の画分をテストします。下図のように、Coomassie 青いを用いた比色定量法はスケール ダウン 100 μ L のボリュームに各画分から少量だけを犠牲にするために。</li>
	<li>比色蛋白質の 100 μ L の各分画のミックス 3 μ L 測定試薬と手動で、端数のタンパク質の存在を示すための任意の色の形成を観察分光計の検出は必要ありません。</li>
	<li>16 画分タンパク質が見つかった場合を続行 1 mL の一部分と蛋白質の試金を定期的に、溶出溶出画分タンパク質を多量に含まれなくなります。</li>
	<li>きれいな円錐管に蛋白質を含む分数を組み合わせるし、SDS ページ26後分析用 100 μ L のサンプルを撤回します。</li>
	<li>金属イオン補足因子の再構成を続行または-80 ° C で 3 mL 因数でタンパク質を凍結その 10% グリセロールが含まれていることを確認、溶出バッファーは凍結中に純粋なタンパク質を安定させるために保護剤の検討。</li>
	<li>Ni NTA カラムの溶出が完了したら、つまり、列になってすべての蛋白質と、分数で収集した別 25 mL の溶出バッファーの列、全体の ~ 5 mL の短期記憶の溶出バッファー 4 ° C で列を格納、または長期の保管用 20% エタノールで溶解/バインド バッファー。</li>
</ol>3. Fe2 +と標的タンパク質の再構成
<ol><li>Fe2 +の追加 注: 非ヘム鉄 (II) この例では L-DOPA ジオキシゲナーゼなどの酵素を結合アクティビティの Fe2 +イオンが必要です。鉄 (II) はすぐにアクティブではない鉄 (III) に酸化し、タンパク質の割合が全然、鉄なし浄化します。<ol>
<li>金属の溶解を開始するには、3 mL の溶出バッファーで中断精製酵素を取得します。ぬるま湯のお風呂を使用して迅速に解凍し、一度融解したものに、氷の上のタンパク質を入れて固定されている場合。</li>
		<li>チューブの蛋白質の量を使用して、アスコルビン酸ナトリウム (198.1 g/mol) サンプルの最終濃度 12.5 mM を作るに必要な量を計算します。また、ジチオトレイトール (DTT、154.25 g/mol) サンプルの最終濃度 12.5 mM を作るに必要な量を計算します。</li>
		<li>固体ナトリウム アスコルビン酸と DTT を追加し、やさしく、しかし徹底的に完全に溶解してミックスします。過度に積極的な混合と蛋白質の沈殿物が発生しないように注意して取る。蛋白質のサンプルに微量鉄 (II) 硫酸塩七水和物 (MW 278.01 g/mol) を追加します。</li>
		<li>鉄塩、タップ数が十分に小さい数 1 を得るために mm 顆粒 FeSO4•7H2O を固体の部分の紙の重量を量る、顆粒、上、紙を折るし、金属のヘラの平らな面でそれを粉砕します。</li>
		<li>タンパク質のチューブに結果として得られる粉末の粒度を追加します。</li>
		<li>ミックスする渦とバラ色のピンク色は、チューブに表示されます。</li>
		<li>タンパク質、キャップ、氷の上の 10-30 分のためのピンクのソリューションを孵化させなさい。ピンク色は、ゆっくりと時間をかけてフェードします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲルろ過<ol>
<li>約 6,000 の分子量排除限界 10 mL タンクが装備されても 1.5 x 12 cm] 列で 90-180 μ m の水分粒子サイズの範囲と球状ポリアクリルアミドゲルの 10 mL を充填したゲルろ過カラムを使用します。列が下位装備し、上段のベッドを列でガレージを保持し、ドライ運転から樹脂ベッドを防ぐため 30 um 多孔質ポリエチレン ディスクの形でサポートしているを確認します。リング スタンドをゲルろ過カラムをマウントします。</li>
		<li>あらかじめパッケージ化されたゲルろ過カラムを使用している場合は、キャップをはずし、上部ベッド サポート上余分なバッファーを注ぐ。</li>
		<li>コラムを平衡させ、まずバッファーの後続アッセイおよびストレージ、たとえば、50 ミリメートル NaH2PO4, 200 mM の NaCl、ph 8.0 10% グリセロールとの互換性で貯水池を充填します。</li>
		<li>あらかじめパッケージ化されたゲルろ過カラムを使用している場合は、バッファーのフローを開始し、ルアーロック スリップ フィットを公開するゲルろ過カラムの下部の先端をスナップします。列のルアーロック スリップまで活栓を合わせて開いたまま、重力によって点滴する列を許可します。</li>
		<li>バッファーが列から排水するいるし、上段のベッド サポート公開されます、活栓を閉じるし、露出上部ベッド サポートに溶液をピペットで列に Fe (II) 再構成スプライシングイントロン 〜 3 mL を追加します。</li>
		<li>活栓を開き、重力によって列を入力する全体の 3.0 mL サンプルを許可します。溶離液のこれらの最初の 3 mL を破棄します。ソリューションの処理中を形成する任意のピンク色は、列の先頭に保持されます。</li>
		<li>列は、滴下を停止するいるし、上段のベッド サポート公開されます 4 mL のゲル濾過バッファー (例えば、 50 mM NaH2PO4、200 mM の NaCl、ph 8.0 10% グリセロール) を列に追加します。活栓を開き、8 つの 0.5 mL 成分を遠心管に溶離液を収集します。</li>
		<li>前述のように測色的蛋白質の試金または紫外-可視27,28を用いたタンパク質画分をテストします。</li>
		<li>タンパク質を含む分数を組み合わせます。</li>
		<li>SDS-PAGE 解析26のサンプルを撤回します。</li>
		<li>アッセイまたはサンプルの保存を続行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者の開示があります。

Polyhistidine タグ組換えタンパク質と IMAC の精製のほかとなっているが事実上ユビキタスで生化学的文学3,4、5IMAC の酵素の浄化への応用生化学研究室の指導のまままばらで、公開メソッドは、常に教育のリソースの制約を考慮していない実験室20。さらに、教育研究所の IMAC の使用は活動および純度、IMAC 精製酵素理想的な教育活動を行う評価実験と結合したときに最も効果的です。酵素を含む教育研究室では、酵素の精製に IMAC のアプリケーションを拡張するために信頼性の高い、安価な方法が必要です。ベンチトップ IMAC を示すこのプロトコル依存の鉄 (ii) を再構成することによって金属タンパク質22IMAC のアプリケーションの制限にも対応しながら容易に入手可能で安価の実験室の供給を使用して金属、L-DOPA ジオキシゲナーゼ投稿浄化してください。試薬および材料の説明を使用して、8 つの学生グループのための消耗品のコストは、図 1と図 2の解析手順を含め、このプロトコルを実行する学期ごとの $500-600 の間を推定します。
Fe2 +切り離すこともできますアミノ酸配位子24と Fe2 +の安易な酸化から O2 Fe3 +、非ヘムの再構成を容易に組換えスプライシングイントロン アミノ酸キレート鉄 (ii) は酵素の浄化の典型的なコンポーネント。古典的なクロマトグラフィーを使用すると、いくつかのケースの32中の鉄の総損失を回避することが可能だが、バック還元剤33,34,35,の存在下での鉄 (II) の追加多くの場合、36嫌気性雰囲気37,38,39, の下で多くの場合、場合によっては過剰な鉄ではない削除33,34,36, 複雑任意の後続の試金。古典的なクロマトグラフィーと嫌気性雰囲気の連続した手順は、学部研究室は、このプロトコルの開発を促すための現実的ではありません。
追加の時間と労力と事前包装された列と比較してクロマトグラフィー計測を自動 Ni NTA 列のマニュアル化・主に重力によってサンプルの処理の時間がかかるが、手動の手順を可能にする実践的ですプロセスの背後にある科学の理解は深まる、学生による学習。ここで説明した条件の下で鉄 (II) 塩の添加は特に過剰ジチオトレイトールに敏感です。学生は、誤ってジチオトレイトールの過剰を追加、降水イベント可能性があります。それをベンチで研究所を最も効果的に使用できるように、演習では、到着する前に試薬量の計算を実行する学生を必要とする有用な発見しました。全体ベンチトップ IMAC 浄化 - - 蛋白質の溶出にセル換散から続いて再構成と以降の実習期間でアッセイ 1 4 時間検査期間で実現できます。

固定化金属キレートのヒスチジンの札を使用してホストの有機体の抽出物から polyhistidine タグ付きタンパク質の精製の最初の報告は、1988 年1,の2文献を入力しました。それ以来、polyhistidine タグ組換えタンパク質の固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) の水質及び添加の生化学的文学3,4、ほぼユビキタスになっています。 5。自動化されたクロマトグラフィーを用いたベンチトップとスピン列形式で、IMAC の浄化方法を実装できます。研究所では、親和性の浄化方法、特に IMAC が広く使用されて、彼らより少なく共通学部教育研究所。生化学研究室の研究室の最も広く使用されている教科書は日常的にこれらのメソッドの代わりより伝統的なイオン交換または色素結合クロマトグラフィー6,7,8選ぶを教えるか,9しますたとえば、アンダーソン10乳酸脱水素酵素の精製色素結合でアフィニティを使用し牛乳 α-ラクトアルブミン7,11 ・ ボイヤーの浄化に使用ニッケル nitriloacetic。酸マトリックスが、ない組換えポリ ヒスチジンの札は、樹脂に対するタンパク質の本質的な親和性に代りに頼る。いくつかの現代実験の教科書や出版物は、緑色または赤色蛍光タンパク質12,13などポリ ヒスチジンのタグ付きタンパク質のターゲットで固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーを実装して 14,15、抗体16、および選択した酵素1718,19,20,,もいくつかの未知関数21。おそらく、酵素の精製、教育研究室では、望ましいターゲットできる試金するアクティビティの以降のセッションで学生側「本物の科学」の経験を豊かにするため確かに、研究室の経験のこれらのタイプが公開されており、学生の学習に有益な成果報告17,18,20,21。まだ、IMAC の生化学研究室のスパース、ままし、公開メソッド可能性がありますに通常使用されるクロマトグラフィー インスツルメンテーションへのアクセスを想定しても教える酵素精製への応用を教室の研究室で使用し、20します。 また IMAC のとりわけ活動22に不可欠な酸化還元に依存した二価金属を結合する金属タンパク質への適用に制限があります。多くの場合、金属イオンを紛失したり降伏学部研究室に適さない不活性酵素精製中に酸化。
酵素の完全 1/3 バインド23金属イオンと生活23のすべての形態の鉄のほぼ普遍的な条件、にもかかわらず鉄は酵素学で最も問題のある金属イオンの中で間違いなく。IMAC の中に非ヘム鉄2 +結合酵素、特に損失および/または金属の酸化しやすいおそらくする fe2 +切り離すこともできますアミノ酸配位子24から使いやすさとヘムのような専用の有機配位子の不足。また、Fe2 +から Fe3 +の酸素依存酸化を負の自由エネルギー変化と Fe3 +の相対的な安定性のための水溶液中における自発的です。多くの場合、これらの課題は、嫌気性雰囲気および/または非 IMAC クロマトグラフィー法22の使用によって克服します。この記事でベンチトップ、Fe2 +依存スプライシングイントロン L-DOPA ジオキシゲナーゼして Fe2 +、アクティブ サイトの再構成に続いて、簡単、安価なクロマトグラフィー装置を浄化する IMAC を使用するデモンストレーションと酵素試金。これらのメソッドは、6-12 学生グループの独自の学部生物化学研究室で標準、学部レベルで酵素の調査のレパートリーを拡大する使用ことができます。

<table><tbody><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーズビーター 0.1mm ガラス</td>ビーズ <td>BioSpec 製品</td><td>11079101</td><td>各 1ポンド</td></tr><tr><td>50mL スクリューキャップ付きコニカルチューブ、滅菌済み</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性</td><td>アクロス (フィッシャー)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸ナトリウム</td><td>アクロス (フィッシャー)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT(ジチオスレイトール)</td><td>ラボサイエンティフィック</td><td>D-115</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>鉄(II)七水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA樹脂&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1.5 x 20 cm、35 ml、2個、&nbsp;</td></tr><tr><td>ストップコックバルブ、一方向、メス-オスルアー</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>50</td></tr><tr><td>BD 10mL ルアーロックシリンジ (非滅菌、針なし)</td> <td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>チューブ用フィッティング: 1.6 mm バーブ - メス ルアー</td><td>バイオラード</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>チューブ用フィッティング: 1.6 mm バーブ - オス ルアー&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ (内径 1.6 mm / 壁 0.8 mm 、蠕動ポンプで 0.2-5 ml/分用)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>パッケージ 1 個入り、内径 1.6 mm / 壁 0.8 mm、10 m、液体処理用低圧チューブ</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes、スナップキャップ、1.5mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドポリスチレン使い捨て血清ピペット</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドユニバーサルピペットポンプ</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドトランスファーピペットフィ</td><td>ッシャー&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG 脱塩カラム</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>30 個入り</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x サンプルバッファー</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (サンプルで 1:5 に希釈)</td></tr> <tr><td>ExpressPlus PAGE ゲル、4-20%、12 ウェル</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 ゲル</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ディスポーザブルキュベット、メチャクリレート</td><td>フィッシャー</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>500のケース</td></tr><tr><td>キュベット キャップ スクエア ディスポーザブル</td><td>フィッシャー</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>永久装備:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビーズビーター 50mLチャンバー&nbsp;</td><td>BioSpec製品</td><td>110803-50SS</td><td>1チャンバー</td></tr><tr><td>ビーズビーター</td><td>BioSpec製品</td><td>1107900-101</td><td>350mlポリカーボネートチャンバー、ローターアセンブリ、モーターベース、氷水冷却ジャケット、1ポンドのガラスビーズ。</td></tr><tr><td>遠心分離管、高速 PPCO、50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>ミニプレキャストゲル用ミニプロティアンテトラ垂直電気泳動セル、4-ゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658004</td><td>&nbsp;4ゲル縦型電気泳動システムには、電極アセンブリ、コンパニオンランニングモジュール、タンク、電源ケーブル付き蓋、ミニセルバッファーダム</td></tr><tr><td>PowerPac HC電源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1645052 100&ndashが含まれます。120/220&ndash;240V、大電流アプリケーション用電源、電源コード</td></tr><tr><td>UV-1800、UV-Probeソフトウェア</td>付属 <td>島津</td><td>製作所 UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek</td><td>Corp version 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

ベンチトップ固定金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、再構成し、polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Polyhistidine タグ付きタンパク質の固定化した卓上型金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) は大学生によって習得されて簡単と現代文献の最も広く利用された蛋白質の浄化方法となっています。しかし、金属結合蛋白質、鉄などの酸化還元敏感な金属との特にそれらへのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーの適用が多い所が学部で定期的に利用できない機器 - グローブ ボックスへのアクセスを実験室。この記事で示す分離、IMAC ポリ ヒスチジンのタグ付きの精製と金属イオンの溶解、レドックス活性、非ヘム鉄バインド extradiol ジオキシゲナーゼおよび様々 な基板を用いたジオキシゲナーゼのアッセイのベンチトップ メソッド濃度と酸素を飽和します。これらのメソッドは学生によって実行される、アクセス可能な主に学部機関で手頃な価格は、インストルメンテーションで学部教育と研究室で実装します。

BCM 341 の 2 つのコース研究室期間中にこのプロトコルを実行すると、これらの代表的な結果が学生によって収集された: ・ ミューレンバーグ大学で実験生化学。図 1に示します 20 kDa のポリ ヒスチジンの浄化の結果 4 時間教室研究所期間中に 2 つの学生によって演じられた金属、L-DOPA ジオキシゲナーゼのタグし、同じで SDS-PAGE を用いてその後期間中に学生。ポリ ヒスチジン タグ付きタンパク質は効果的に浄化された (図 1レーン 2)。ポリ ヒスチジン タグに対する抗体を使用してゲルのイムノブロット フローを通じて (データは示されていない)、タグ付きポリ ヒスチジン標的タンパク質の少量が失われていることを示します可能性がありますので、100 mg のターゲット蛋白質の量よりも大きい、溶解樹脂の結合容量を超えています。
図 2は、鉄 (II) とプロトコルで定義されているその後ゲル濾過で溶解後ポリ ヒスチジン タグ金属ターゲット、L-DOPA ジオキシゲナーゼの酵素反応に学生収集活動データを示しますここ。デッド ・ タイムの前にデータ収集を開始 5 秒は初めてこの手法を実行する学生の典型的です。公開されているアッセイを用いたし、出版された結果29と一貫性のある定常状態速度論的パラメーターが得られた、金属の堅牢なアクティビティが検出されました。定常状態速度論的パラメーターを決定する進行曲線30 図 2で示されていたしかし、基質濃度のシリーズで収集された初期のレートの非線型最小二乗フィッティングは均等に可能な31です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> 図 1。ポリ ヒスチジンの SDS-PAGE 解析タグ付きタンパク質の精製中に前後。レーン 1 - 分子量マーカー、2 精製タンパク質 (20 kDa) ポスト Ni 国税庁、3 Ni NTA 流、4 - 携帯無料粗抽出物の浄化、5 の前に - 細胞の残骸ペレット ポスト換散。サンプルは 5 x サンプル/読み込みバッファーを使用して準備され、ゲルの電気泳動システムを使用して既製の 4-20% ポリアクリルアミドのゲルの分離します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> 図 2。定常状態分析の鉄 (II) はバッファー (50 mM リン酸、200 mM の NaCl、pH 8) の基板 (l ドーパ-5 (赤) μ M、25 μ M (緑)、50 μ M (ブルー)) 金属 (すなわち、 L-DOPA ジオキシゲナーゼ、10 μ m) を再構成しました。トレース製品における 414nm を描きます。吸光度データは分割ビーム走査型紫外可視分光計29の 1 mL メタクリル酸キュベットを使用して継続的に買収されました。Raw データは、ミカエリス-メンテン型の定常状態近似 (KM 30.8 μ M ± 14.4 k猫明らか2.3 の-1 ± 0.05)30のモデルに合わせています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

卓上型固定化金属親和性クロマトグラフィー精製タグ polyhistidine のそれに続く再構成のためのプロトコル、学部教育研究室に適した非ヘム鉄バインド ジオキシゲナーゼを紹介します。

ベンチトップ固定金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、再構成し、Polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き

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この方法により、学部生は鉄結合性金属酵素を迅速に精製し、そのタンパク質を使用して構造と機能に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、非ヘム鉄結合酵素に適用できることです。学部生が利用でき、教育研究室ですぐに実装できます。この手順を開始するには、ルアーロックアウトレット、ルアーロックフィッティングも含まれる上部キャップ、および樹脂粒子を保持するための下部ベッドサポートを備えた1.5 x 20 cmのカラムを用意します。下部のルアーロックフィッティングにストップコックを取り付けて、流れを制御します。次に、以前に摂氏4度で保存したニッケル結合ニトリロ酢酸樹脂を20%エタノールに50%スラリーしたボトルを入手します。ボトルを静かに回して、レジンを均一に再懸濁します。室温で作業し、目盛り付きピペットを使用してスラリーを2mm取り出し、カラムに移します。余分な保存液がレジンから排出されたら、パスツールピペットを使用して、レジン表面を乱さないように、少なくとも30ミリリットルの冷却溶解結合バッファーを慎重に追加します。水しぶきを防ぐために、バッファーを柱の壁に通します。緩衝液が重力によってカラムからゆっくりと収集ビーカーに排出されるようにすることで、樹脂を平衡化します。まず、ストップコックを開き、残りの溶解結合バッファーをニッケルNTA樹脂を介して重力で排出させることにより、無細胞原油抽出物を添加するためのnickel-NTAカラムを準備します。バッファーが完全に排出され、樹脂表面が露出したら、活栓を閉じます。次に、パスツールピペットを使用して、表面を乱さないように注意しながら、無細胞の粗抽出物を慎重に樹脂にピペットで移します。原油抽出物をカラムの壁に流して、飛散を防ぎます。すべての粗抽出物がカラムに移されたら、ストップコックを開いて、カラムが重力によって排出できるようにします。後で分析するために、フロースルーの100マイクロリットルを収集します。短い長さのプラスチックチューブを使用して、10 ミリリットルのルアーロックシリンジをカラムのキャップに接続します。シリンジプランジャーを引き出し、カラムキャップをカラムの上部にしっかりと充填します。溶離液をメスシリンダーに集めながらプランジャーを静かに圧縮し、手動で流量を評価します。1分あたり1〜2ミリリットルの速度は、樹脂および実験装置に適合します。流量が遅くなるにつれて、シリンジプランジャーの圧縮をゆっくりと増加させます。塗布した液体のメニスカスが樹脂ベッドより5〜10ミリリットル上に達したら、カラムキャップと付属のハンドポンプを取り外して、樹脂への空気の混入を防ぎます。残りのボリュームを重力で排出させます。粗抽出物の水気を切らし、再び樹脂表面を露出させた後、パスツールピペットを使用して、樹脂表面を乱さないように注意しながら、約30ミリリットルの冷やした洗浄バッファーをカラムに慎重に追加します。ストップコックを開き、ウォッシュバッファーをカラムから排出します。カラムが排出されている間に、フラクション回収のために16本の微量遠心チューブを標識します。バッファーが完全に排出され、樹脂表面が再び露出したら、活栓を閉じます。パスツールピペットを使用して、レジンの表面を乱さないように注意しながら、冷却した溶出バッファーをカラムに約30ミリリットル慎重に追加します。次に、ストップコックをゆっくりと開き、溶出バッファーがカラムからポリヒスチジンタグ付きタンパク質を溶出させます。マークを付けた各微量遠心チューブに1ミリリットルの溶離液を回収します。タンパク質を試験した後、タンパク質含有画分をきれいな円錐形のチューブに結合します。金属イオン補因子の再構成を進めるか、タンパク質をマイナス80°Cで3ミリリットルのアリコートで凍結します。金属の再構成を開始するには、溶出緩衝液に懸濁した精製酵素の3ミリリットルのアリコートを氷の上に置きます。チューブ内のタンパク質の量を使用して、サンプル中のそれぞれの最終濃度が12.5ミリモルになるように、必要なアスコルビン酸ナトリウムとジチオスレイトールの量を計算します。固体のアスコルビン酸ナトリウムとジチオスレイトールを加え、穏やかに、しかし完全に混ぜ合わせます。固形の硫酸鉄七水和物の1ミリリットルの顆粒を数個、計量紙に軽くたたいます。紙を顆粒の上に折り、金属ヘラの平らな面で押しつぶします。得られた粉末の粒をタンパク質溶液を含むチューブに加えます。渦を巻いて混ぜると、バラ色がかったピンク色になります。チューブにキャップをし、ピンク色の溶液を氷の上で10〜30分間インキュベートします。ピンク色は時間が経つと色あせていきます。ゲルろ過には、1.5 x 12 cmのカラムに10 mLの球状ポリアクリルアミドゲルを充填したゲルろ過カラムを使用します。このカラムには10 mmリットルのリザーバーも装備されています。次に、テキストプロトコルで概説されているように列を平衡化します。バッファーがカラムから排出され、上部ベッドサポートが露出したら、ストップコックを閉じます。鉄2再構成金属酵素の3ミリリットル溶液を露出した上部ベッドサポートにピペットで移します。ストップコックを開き、3ミリリットルのサンプル全体を重力によってカラムに入れます。最初の3ミリリットルの溶離液を廃棄します。溶液の取り扱い中に形成されるピンク色は、カラムの上部に閉じ込められます。カラムの滴下が止まり、上部ベッドのサポートが露出したら、4 ミリリットルのゲルろ過バッファーを追加し、8.5 ミリリットルの画分に対して 4 ミリリットルの溶離液を収集します。タンパク質含有画分を組み合わせた後、テキストプロトコルに概説されているように、サンプルのアッセイまたは保存を進めます。この研究では、学生はポリヒスチジンタグ付き非ヘム鉄結合ジオキシゲナーゼを精製し、その後再構成しました。SDS-PAGE解析により、タグ付きタンパク質が効果的に精製されていることが分かります。ここには、精製されたL-ドーパジオキシゲナーゼを鉄2で再構成し、その後のゲルろ過後の酵素作用に関する学生が収集した活性データが示されています。データ収集が始まるまでに5秒の遅れが生じるのは、この手法を初めて実行する学生に典型的なものです。定常状態アッセイは、進行曲線を適合させることによって決定される速度論的パラメータが、公表された結果と一致していることを示しています。この手順を試みる際には、鉄分が多すぎるとタンパク質の沈殿を引き起こすため、鉄分が多いほど良いわけではないことを覚えておくことが重要です。タンパク質の3〜5モル過剰の鉄濃度で十分です。この手順に従って、学生は溶液の構造を測定したり、酵素や基質依存性の化学を調べたり、反応メカニズムに関する追加の質問に答えるための追加の実験を行うことができます。

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JoVE Journal

Biochemistry

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固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。...

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量

ここでは、ユビキチンリガーゼVon Hippel-Lindau E3リガーゼ(VHL)およびセレブロン(CRBN)を含むキメラ(PROTACS)を標的とするタンパク質分解によって誘導される三元複合体形成の生物物理学的特性評価のためのプロトコルについて説明します。 本明細書に例示される生物物理学的方法には、表面プラズモン共鳴(SPR)、生物層干渉法(BLI)、および等温滴定熱量測定(ITC)が含まれる。...

キメラを標的としたタンパク質分解による三元複合体形成評価のための生物物理学的アッセイの開発と応用(PROTACS)

この記事では、6X-ヒスチジンタグで標識されたヒト組換えタンパク質であるフラップエンドヌクレアーゼ1(FEN1)のアフィニティー精製の手順について説明します。このプロトコルでは、タグ付きタンパク質の精製に2つの異なる固定化金属イオンカラムを使用します。...

Fast Protein Liquid Chromatographyシステムを用いた6X-Hisタグ付きタンパク質のアフィニティー精製(英語) 

学ぶ固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによるポリヒスチジン標識非ヘム鉄結合ジオキシゲナーゼの精製と再構成法。学部生が酵素構造と機能を実験で探究できる教育用プロトコルです。

ベンチトップ固定金属アフィニティー・クロマトグラフィー、再構成し、Polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き

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