線虫ふるい: ローテク装置と小型の多細胞生物の並べ替えのための方法論
2018年7月4日
現在のプロトコルを含むソートと年齢をマッチさせた集団のクリーニングの方法論線虫。それは研究用の線虫の実験的人口を取得するのに単純な安価なとカスタムメイドの効率的なツールを使用します。
この方法は、C.elegansの特定の発生段階を必要とするアッセイを含む分子生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。遺伝子やタンパク質の発現レベルのアッセイのようなものです。この技術の利点は、体の大きさによって多数のC.elegansを正確かつ効率的に選択できることであり、これにより、通常は時間とコストがかかるアッセイの使用が容易になります。
一般に、この方法に不慣れな人は、アーチ型ターンオーバーステップを実行できなかったり、メッシュの中央で溶液の流れを維持できなかったりするため、苦労します。この方法は、洗浄と反転の手順を学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。テキスト内の特定の動きを解釈して視覚化するのが難しい場合があります。
まず、蓋付きの50 mLコニカルチューブを2本用意し、段付きドリルビットを使用して蓋の内側の唇から中心を取り外します。必要に応じて、ヤスリ、サンドペーパー、または回転ツールを使用して、蓋の端と上部を清掃して研磨します。次に、蓋の直径よりわずかに小さいナイロンモノフィラメント織りメッシュのディスクをカットします。
蓋の上面にテクスチャーを塗り、エタノールできれいにします。蓋を乾かした後、両方の蓋の上面にシアノアクリレート接着剤を塗布します。次に、モノフィラメントメッシュディスクを接着された1つの蓋に置きます。
メッシュの上部にある2番目の蓋を反転させ、蓋をしっかりと押し付けます。接着剤の最初の層が乾いたら、蓋の間の外側の隙間の周りにシアノアクリレート接着剤のたっぷりとしたリングを塗ります。次に、フィルターにそれぞれのメッシュ細孔サイズをラベル付けします。
まず、ふるいをラベル付きの50mLコニカルチューブの上に置きます。次に、液滴が形成され、合体し、フィルターの中心から滴り落ちるまで、生理食塩水をふるいの中心にピペットで送ります。M9バッファーを使用して、オーガープレートからC.elegansの集団を洗い流し、ガラスパスツールピペットを使用して、モノフィラメントメッシュの上側に線虫を含むバッファーを移します。
メッシュの中央で操作し、フィルターをM9バッファーですすぎ、必要に応じてこのすすぎステップを繰り返して、すべての細菌と小さなワームをメッシュに通します。次に、新しい50mLの円錐管をふるいの上部に取り付け、メッシュの細孔よりも大きい以前に収集されたワームが新しいチューブの内側を向くことになります。廃液チューブを取り外し、ふるいをすばやくひっくり返します。
次に、メッシュをM9バッファーで新しいコレクションチューブにすすぎます。採取したワームを約1分間沈殿させてから、緩衝液をワームのペレットから慎重に吸引します。ガラス製パスツールピペットを使用して、NGMプレート上に線虫の液滴を作成し、乾燥させます。
最後に、ふるいを逆浸透水とエタノールですすいでください。ふるいが乾いたら、将来の使用のために清潔な容器に保管してください。ふるいがたるんだ外観になったら廃棄してください。
このプロトコルでは、年齢が一致したC.elegansの集団を選別して洗浄するためのふるいが構築されました。ふるい処理群の動物は、成人期を通じて正常で自発的な運動パターンを示しました。さらに、ピックグループとふるいグループは、咽頭ポンプ速度に有意差を示さなかった。
ふるい群の動物は、試験日のいずれにおいても、すべての治療群と比較して、前方または後方の機械的刺激に対して正常に反応した。最後に、治療群の繁殖力を比較しました。ふるいの使用は、PICK処理群と比較した場合、子孫の数に大きな影響を与えませんでした。このテクニックを習得すれば、10分以内に完了することができます。
この手順を試行するときは、メッシュ領域の中央で操作することを忘れないでください。このビデオを見た後、Caenorhabditisふるいを組み立てて適切に使用して、体のサイズでワームを選別する方法をよく理解しているはずです。
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概要
このプロトコルでは、特製のツールを用いて、齢の揃ったCaenorhabditis elegansの個体群を分取および洗浄する方法について説明します。これにより、研究者は大規模な実験用個体群を効率的かつ低コストで得ることが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 分子生物学
- 発生生物学
背景
- C.elegansの特定の発生段階は、さまざまなアッセイにおいて極めて重要です。
- アッセイには、遺伝子およびタンパク質の発現レベルの解析が含まれる場合があります。
- 従来の手法は、時間とコストがかかることがあります。
- 手法を理解するためには、視覚的なデモンストレーションが不可欠です。
研究の目的
- C.elegansを体サイズに基づいて効率的に選別する方法を提供すること。
- 特定の発生段階を必要とするアッセイを容易にすること。
- この手法に不慣れな研究者がより容易に導入できるようにすること。
使用された手法
- 線虫選別用の特製ツール。
- 効果的な洗浄のためのアーチ状の反転ステップ。
- メッシュ中央での溶液の流れを維持。
- 学習を支援する視覚的なデモンストレーション。
主な結果
- 大量のC.elegansを正確に選別することが可能になった。
- 本手法により、分子生物学アッセイの時間とコストが削減される。
- 視覚的な補助により、特定の動作への理解が深まる。
- 本手法に不慣れな研究者のアクセシビリティが向上した。
結論
- 本プロトコルは、C.elegansを分取するための信頼性の高い手法を提供します。
- この技術を効果的に習得するためには、視覚的な補助資料が不可欠です。
- この手法は、分子生物学の研究に大きく貢献する可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
バイオファーマの研究開発において、C. elegansのようなモデル生物の同期集団を得ることは、再現性のある表現型スクリーニングおよびターゲットバリデーションアッセイにとって極めて重要です。Caenorhabditis Sieveを用いることで、体サイズによる迅速かつ費用対効果の高い分級が可能となり、初期探索ワークフローにおける時間とリソースの負担を軽減できます。これにより、生物学的インプットの均一性が確保され、アッセイの準備状態やポートフォリオの優先順位付けにおける予測的な信頼性が向上します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 年齢を揃えた線虫集団を用いることで、一貫した表現型解析が可能となり、治療仮説の検証を促進する。
- 運用的価値： 特殊な設備を必要とせず、同期化したコホートを生成するための低コストで拡張可能な手法を提供する。
- 予測的価値： アッセイにおける生物学的ばらつきを低減し、ターゲットのリスク低減に向けたデータの信頼性を向上させる。
スクリーニングとアッセイ開発
- 科学的価値： 特定の発育段階を分離することで、化合物スクリーニングの下流工程に向けた検証済みの生物学的システムを調製します。
- 運用の価値： 線虫の調製を標準化し、アッセイプレート間およびスクリーニングキャンペーン全体における再現性を向上させます。
- スケーラビリティ： 大規模な線虫集団を10分以内に迅速に処理することで、ハイスループットのニーズに対応します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： 運動能、ストレス応答、および産卵能のマーカーを維持することで、探索段階から前臨床検証に至るまで表現型の忠実性を保持します。
- メカニズムによるリスク低減： 同期させた集団における遺伝子およびタンパク質の発現レベルの信頼性の高い評価を可能にし、バイオマーカーの整合性をサポートします。
- リスク調整後の推進： 有効性および毒性プロファイリングのための一貫したモデルシステム入力を提供し、go/no-go判断を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
Caenorhabditis Sieveは、初期探索からリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、特にC. elegansを用いた表現型スクリーニングにおけるアッセイの準備状態とスクリーニングの再現性をサポートします。
- ディスカバリーバイオロジー：経路の解明や機能スクリーニングに不可欠な均一な線虫集団を提供することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：サイズベースのソーティングによりアッセイの準備を可能にし、線虫のサイズとステージを一定に保つことで、信頼性の高い化合物評価を実現します。
- アナリティクス：サイズ別に分離された定量的な出力を生成し、ノイズを低減した状態で、異なる発生段階にわたる条件の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ソーティング後も主要な健康指標（運動性、ストレス応答、繁殖力）を維持することで、前臨床段階への連続性を確保し、バイオマーカーの妥当性を支持します。
- エンタープライズでの再利用：複数のチームやプロジェクトにわたって再利用可能でメンテナンス負荷の低いツールとして機能し、モデル生物のハンドリングにおける標準化を推進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：表現型アッセイにおけるメカニズム的な曖昧さを排除することによる、予測精度の向上。
- 運用の価値：線虫調製ワークフローの標準化、再現性、および拡張性の向上。
- 戦略的価値：早期のリスク低減を通じた、より適切なGo/No-Go判断、資本効率の向上、および後期段階における生物学的リスクの軽減。
- ポートフォリオへの影響：信頼性の高いステージ固有のモデルシステムデータに基づく、リスク調整後の優先順位付けおよび推進判断。
実施上の留意点
- ふるいの組み立ておよび溶液の取り扱いに関する基本的な実験スキルが必要です。
- コニカルチューブ、ナイロンメッシュ、シアノアクリレート系接着剤、および標準的なバッファー（M9、生理食塩水）へのアクセスが必要です。
- 一貫性を確保するため、メッシュ中心の操作および反転技術に関するチーム間トレーニングが必要です。
- 適応上の検討事項として、標的となる虫のステージに応じたメッシュ孔径の選択、および様々なNGMまたは液体培養システムとの互換性が挙げられます。
- 実用上の制限として、時間の経過とともにメッシュが弛む可能性があり、分級精度を維持するために定期的な交換が必要です。
