Name: 次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶ FLIPS法によるHIV-1潜伏ウイルス単離増幅と次世代シーケンス解析。単一感染細胞からの近全長プロウイルス増幅と複製能評価により、HIV治療戦略開発に貢献する。

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この作品が支持された (1U19AI096109 および 1UM1AI126611-01) の治療法を見つけるにデラニー エイズ研究企業 (あえて)amfAR HIV 撲滅 (ARCHE) 共同研究助成 (amfAR 108074-50-RGRL); エイズ研究財団からの研究コンソーシアムオーストラリア センター HIV や肝炎ウイルスの研究 (ACH2);UCSF GIVI センター エイズ研究 (P30 AI027763);オーストラリア国立保健医療研究審議会 (AAP1061681)。博士ジョーイ ライ、ウエストミード ライブラリの準備および彼の施設の使用の彼の訓練のための医学研究所ゲノム施設マネージャー、ゲノミクス (大学のニュー ・ サウス ・ ウェールズ、シドニー、オーストラリア) の Ramaciotti センターに感謝したいと思いますシーケンスを行う。我々 はこの研究のサンプルを寄付者に感謝の気持ちで認めます。

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

反転アッセイは、増幅し、シーケンス シングル、フルレングスの HIV-1 proviruses 近くの効率的かつ高スループット方法です。複数の要因とプロトコル数と得られるシーケンスの質に影響を与える重要な手順は、識別されています。まず、セル数、セルの人口の HIV-1 感染頻度増幅 proviruses の数に影響します。たとえば、前の文書約半分として多くのシーケンスの+ T ナイーブ cd4 陽性の同じ数から得られた細胞エフェクター メモリー CD4 と比較して+ T 細胞。ナイーブ細胞通常エフェクター記憶細胞2より低い感染頻度があるためにです。第二に、セル換散抽出プロセスの DNA を失うリスクがないゲノム DNA を取得する列を用いた抽出メソッドをお勧めします。最後に、任意の pcr アッセイと汚染を防止するは、重要です。ポジティブ コントロール、DNA の浄化と定量化、およびライブラリの準備の追加ゲノムの DNA の処理、マスター ミックスを準備するため分離クリーン エリアを指定必要があります。これは、ここに示してなどシングル コピーの試金のため特に重要です。
反転法の実装は、参加者のサンプルではなく、pNL4 3 プラスミドなど肯定的な制御を実行しているを含める必要があります最初。これは HIV 1 肯定的な細胞の使用に任意のトラブルシューティングの前の得られるシーケンスは、これらのプラスミッドのための利用可能な参照の配列と比較することとなります。1 HIV 陽性細胞を使用すると、ほとんどない proviruses が増幅される場合 hiv-1 サブタイプ (フリップが B のサブタイプに固有のために設計したプライマー) および細胞集団の感染頻度を考慮することが重要です。プライマー シーケンスは、他のサブタイプを一致するように変更/再設計することができます。さらに、肯定的な制御を含んでいるもが実行ごとの PCR に含まれます。
反転は、SPS を含む、以前のシーケンス試金の制限を克服しています。増幅とフルレングスの HIV-1 proviruses 近くのシーケンス、反転は、HIV-1 の proviruses の潜在的な複製能力を判断できます。これは SPS のみサブ ゲノム領域をシーケンスし、したがってそのままプライマー結合部位とシーケンスの選択を使用して可能ではなかった。さらに、反転は、以前フルレングス シーケンス試金1,4で採用された複数の増幅と配列のプライマーを利用しながらに関連付けられている制限を克服します。PCR NGS と組み合わせて HIV 1 LTR 地域の 2 回は、フリップは、数と必要なプライマーの複雑さを減少します。反転はプライマーの不一致、すなわち欠陥 proviruses の誤同定と集団内のいくつかの proviruses を増幅することができないことの結果を受けにくいため。反転プロトコルも効率的であり、シーケンスの前の方法よりもの高いスループットを実現できます。
明らかに、反転は、HIV-1 proviruses の遺伝的組成を決定する既存の方法上の利点を提供します。ただし、反転の限界を認識することが重要です。まず、反転法は開発されていない潜在的な HIV 1 貯蔵所のサイズを測定するためのツールとして反転増幅すべて HIV 1 provirus 細胞集団内に存在かどうかを決定するための解析が完了するいないと。反転は代わりに異なる細胞集団2間貯留層の組成の相対的な比較を行うために役立ちます。第二に、そのまま HIV-1 proviruses のレプリケーション能力は体内の分析では、Hoらによって実行されるものなどを行わなければ確実性を特定できません。4. 第三に、反転は、HIV-1 proviruses の統合サイトを決定する設計されていません。
反転プロトコルへのマイナーな変化は、そのアプリケーションを増やすことができます。たとえば、シーケンスが異なるできるプライマーで増幅し、塩基配列に複数の hiv-1 サブタイプ変更します。プラズマ 1 HIV ウイルス粒子の配列は、nested pcr 法の前に cDNA 合成添加を介して可能です。単一分子配列方法の将来利用de novoアセンブリの必要性がなくなります。
統合の HIV-1 proviruses の遺伝子配列は、潜在的な HIV 1 貯水池の私達の理解を増加しています。反転は、組成と潜在的な貯留層の分布の解明、将来の研究のための重要なツールです。ただし、反転のアプリケーションは、貯水池を超えて拡張することができます。将来の研究利用 CRISPR Cas 技術は、特定のターゲットを判断したり、コーディングの識別を支援する反転とウイルスにより逆にエージェントの待機時間に対応する非コーディングの地域。ウイルスゲノム組換えは、大きな内部欠失のジャンクション サイト見てによってよりよく理解可能性があります。

長期的な抗レトロ ウイルス療法 (ART) の個人で解決しない、潜在的な HIV 1 貯水池の遺伝学的解析が統合された proviruses の大半の欠陥と複製無能な1を理解することが重要されています。,2。 統合プロウイルス順序逆のトランスクリプションのプロセス中にエラーが発生します。欠陥プロウイルスのシーケンスを生成するいくつかのメカニズムは、間違いやすい 1 HIV 逆転写酵素酵素34、および/または APOBEC 誘起超変異5,6の切り替えテンプレート。二最近の研究が発見した遺伝子そのまま潜在的レプリケーション有能な長期的なアートの個人から分離された HIV-1 proviruses の約 5%、HIV 1 血中アートの停止時の急回復に貢献するかもしれない1,2,7. 以前の研究は、レプリケーション主務の HIV-1 proviruses が世間知らずとは別のメモリー cd4 陽性で存続することを識別した+ T 細胞サブセット (中央、経過とエフェクター メモリー T 細胞を含む) の重要性を示すこれらをターゲット細胞将来的に撲滅戦略2,8,9です。
早い洞察力分布、動態と潜在 HIV 1 貯水池の維持を実現した HIV 1 ゲノム10 のサブ ゲノム領域の遺伝的特性を示す単一プロウイルス シーケンス (SPS) 法の活用、11,12,13。SPS は、単一 HIV 1 provirus からの 1 つの感染した細胞をシーケンスすることができる汎用性の高いツールです。ただし、SPS ではそれだけ系列のプライマー結合部位内で大きな欠失を含むサブ ゲノム領域とミスの proviruses proviruses のレプリケーション能力を特定できません。前の研究は、SPS がによるレプリケーション有能な貯留層のサイズを過大評価を実証して 13 〜 17 倍を介して選択的にそのままサブ ゲノム領域2のシーケンスします。
SPS、Hoらの制限に対処するため4ブルーナーら1は、フルレングスの HIV-1 proviruses 近くのシーケンスにアッセイを開発しました。これは決定する長期的なアートの個人の遺伝子そのままと潜在的レプリケーション主務の HIV-1 proviruses の周波数を許可しました。これらの試金は増幅し、塩基配列 (サンガーを介してシーケンス) 取得 (そのまままたは欠陥) のシーケンス HIV 1 provirus 組み立てられた、サブ ゲノムの領域。このアプローチの 3 つの制限: 1) 複数配列のプライマーの使用が誤ってプロウイルスのシーケンスに欠陥を導入するリスクを増加し、2) プライマーの不一致は、増幅を防ぐことができます特定の proviruses と 3) は、しばしば、プロウイルス シーケンス全体は、これらのメソッドの専門性のため解決できません。
既存のフルレングス HIV 1 プロウイルス シーケンス試金の制限を克服するためにFull -Length私個々Proviral Sequencing (反転) アッセイを開発しました。反転は次世代シーケンサー (NGS)-ベースのアッセイを増幅し、高スループットかつ効率的にフルレングス (そのまままたは不良) HIV-1 の proviruses に近いシーケンスします。反転前の試金、上の利点を提供は、プライマーが使用数が制限したがって、プライマーを proviruses の人口を制限する可能性があります不一致キャプチャまたは誤ってウイルス シーケンスに欠陥が生じる可能性が低くなります。反転前の試金よりより少なく技術的に難しいもとメインの手順を 6: 1) 換散の HIV-1 感染細胞、2) nested pcr 法の限界希釈の非常に節約された特異的なプライマーで実行を介して単一の HIV-1 proviruses の増幅HIV-1 5' と 3' U5 LTR 地域 (図 1 a)、3) 浄化と 4 増幅産物の定量) NGS、5 のため増幅された proviruses の図書館準備) NGS、6) それぞれのコンティグを取得するシーケンス proviruses のde novoアセンブリ個々 の provirus。
反転から生成される系列は、遺伝子そのままと潜在的レプリケーション主務 (図 1)2であるそれらを識別して除去の厳格なプロセスを受けることができます。そのまま遺伝子 proviruses は、複製無能な provirus 生成の結果すべての既知の欠陥を欠いています。これらの欠陥があります: 5' 信号または主要な包装の変異や frameshifts、超変異/有害な停止コドンとなる大規模な内部削除反転シーケンス スプライス ドナー (MSD) のサイト。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> 図 1: フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転) アッセイで重要な手順です。(A) HIV 1 DNA ゲノム nested pcr 法によるフルレングス (欠陥とそのまま) HIV-1 proviruses 近く増幅に反転で使用する 5' と 3' の U5 LTR 地域のプライマー結合部位を持つ。(B) 80 サンプル井戸 (各希釈用 20 井戸)、4 のネガティブ コントロール井戸 1 肯定的な制御をも含む 96 ウェル PCR プレートのレイアウト。(C) 遺伝子そのままと潜在的レプリケーション主務の HIV-1 proviruses を識別するために使用される除去のプロセスです。この図は、Hienerらから変更されています。2.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI、pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>ネステッドPCR用に5 mMに希釈</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 代替溶液</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96 well thermocycler</td><td></td><td></td><td>Any 96 well thermocycler can be used</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA ポリメラーゼハイフィデリティ</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x High Fidelity バッファー [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 および PCR2 プライマー</td><td></td><td></td><td>脱塩。希釈して(100&micro;M) H2O</td></tr><tr><td>PCRプレート付き 96ウェル、ハーフスカート、シングルノッチコーナー、クリア</td><td>アクシゲン</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシール 「B」接着シール</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>96ウェルPCRプレートをシールするために必要</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 感染性分子クローン (pNL4-3)</td><td>以下の試薬は、NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114) から入手したものです。</td><td></td><td>105 copies/mL に希釈し、ポジティブコントロール</td></tr>の <tr><td>PCR プレートスピナーまたは卓上遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-GEL 48 1% Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Precast 1% アガロースゲル (96 ウェルプレートあたり 2 個のゲルを使用)。任意の1%アガロースゲルを置換できます。臭化エチジウムを配合。</td></tr><tr><td>DirectLoad ワイドレンジDNAマーカー</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>10kbまでの任意のラダーで代用可能</td></tr><tr><td>マザーEベースデバイス</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>プレキャスト48ウェルの1%アガロースゲルの実行に必要</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ ゲルドキュメンテーションシステム</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>アガロースゲルを含むエチジウムブロマイドの任意の視覚化システムを使用可能</td></tr><tr><td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>長期保存用ヒートシールフィルム</td></tr><tr><td>96ウェル 0.8 mL 保存プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB0765</td><td>0.8 mL 96ウェルプレート 磁気ビーズベースのPCR精製に必要な</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (PCR精製キット)</td> <td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td>磁気ビーズベースのPCR精製キット。他のPCR精製キットはここで代用できます (e.g. QIAquick PCR精製キット (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>エチルアルコール、ピュア200プルーフ、分子生物学用</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shaker</td><td></td><td></td><td>オプション</td></tr><tr><td>バッファー EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Elution buffer</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>dsDNA濃度を測定するための蛍光ベースの染色</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNAライブラリ調製キット</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Nextera XT DNAライブラリ調製キットに必要</td></tr><tr><td>Library Quantification Kit - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>その他のライブラリ定量キットは、(例えば JetSeq DNAライブラリ定量 Lo-Roxキット (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>自動電気泳動システム。高感度DNAキットと組み合わせて使用</td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq Platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

次世代シーケンシングのフルレングスの hiv-1 proviruses 近くの増幅

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転) アッセイはフルレングス (そのまま、欠陥)、HIV-1 の proviruses の近くの 1 つのシーケンスを増幅しに設計されている効率的かつ高スループット方法。反転では、統合された hiv-1 細胞集団内の遺伝的組成の決定ことができます。有害な停止コドン/超変異、フレーム シフト突然変異および代理要素 cis 諸国における突然変異/削除が必要な大規模な内部の削除など、逆のトランスクリプションの間に起こる HIV 1 プロウイルス シーケンス内の欠陥を識別してウイルス粒子成熟の反転は、統合 proviruses 複製することができないを識別できます。反転法は、これらの欠陥がない、したがって潜在的レプリケーション主務 HIV-1 proviruses を識別するために利用できます。反転のプロトコル: HIV-1 感染細胞の換散は、フルレングスの HIV-1 proviruses 近くの PCR を入れ子になった (HIV 1 5 を対象としたプライマーを使用して ' と 3' LTR)、DNA 精製と定量、ライブラリの準備のため次世代シーケンス (NGS)、NGS、プロウイルス コンティグとレプリケーション主務 proviruses を識別するための簡単な消去法のde novoアセンブリ。反転は、シーケンスに設計された従来の方法上の利点統合単一プロウイルス シーケンスなどの HIV-1 proviruses を提供します。反転増幅未定、複製能力を有効にフルレングスの proviruses 近くのシーケンスし、も少ない増幅プライマー、プライマーの不一致の結果を防止を使用します。反転特に潜在貯留層内での統合の HIV-1 proviruses の遺伝的風景を理解するための便利なツール、ただし、その利用を統合された hiv-1 遺伝的組成が必要である、任意のアプリケーションに拡張できます。

反転アッセイを増幅し、フルレングスの HIV-1 proviruses の近くの 1 つのシーケンスします。プロトコルには、フルレングスのプロウイルス シーケンスの近くを取得する 6 の手順が含まれます。これらの手順が含まれます: 換散の感染細胞、フルレングス (そのまま、欠陥) HIV-1 proviruses、DNA 精製、定量化、ライブラリの準備、NGS、シーケンスのネストされた PCR とのde novoアセンブリ シーケンス proviruses。各ステップの終わりは、次のステップの前に (例えば増幅 DNA、精製した DNA、配列ライブラリまたはシーケンス) 製品の品質を評価するチェックポイントと見なすことができます。評価の各ステップの最後に実行され、期待どおりの結果は以下の通りです。
次の nested pcr 法の増幅産物は 1% の agarose のゲル (図 3) で実行されます。PCR の最初の品質は、正と負のコントロールの検査によって決定できます。増幅産物を含むネガティブ コントロール井戸が汚染を示す、増幅産物の不在の肯定的な制御の井戸は十分な増幅を示します。次に、配列の増幅産物を含む井戸が選択されます。複数の増幅 proviruses の混合物を含んでいる井戸を避けるためは、終点希釈で増幅産物を含む井戸だけはシーケンスと見なされます。ポアソン分布によると井戸の 30% は増幅産物の肯定的なとき、終点希釈が見つかります。この希釈では、80% これらの井戸を含む単一の増幅 provirus のチャンスします。さらに、複数のバンドは、ゲルで表示される長さの異なる複数の増幅 proviruses を含む井戸をこの段階で視覚化できます。(図 3) を配列するために、これらの井戸を選択しないでください。
次のシーケンスの選択増幅 proviruses の精製、定量化により、精製段階で失われたプロウイルス DNA がないです。増幅 provirus の DNA 濃度が場合 &lt; 0.2 ng/μ L、プレートを精製することができます PCR2 で残りのサンプル。ライブラリの準備、個々 のライブラリが定量化は次のようなチェックポイントが発生します。これにより、個々 の proviruses されている適切に断片化、タグし、シーケンスの前に増幅されます。プロウイルスのライブラリを個々 に 4 の最後のライブラリ濃度に等モル量でプールされます nM (またはシーケンス プロバイダーで指定された)。個々 のプロウイルス ライブラリの濃度が低すぎる場合、シーケンス ライブラリ プールから除外することができます。 または個々 のライブラリが再び準備します。プールされたライブラリの濃度の最終チェックは、平均のフラグメントの長さを確認すると共にシーケンスの前に実行されます。
品質管理手順de novoアセンブリ段階は最終的なプロウイルス contig を組み立てるために使用する読み取りの品質を保証する前に。これらの手順が含まれます: アダプター シーケンス、5' と 3' ヌクレオチド、厳格な品質管理制限のトリミングと短いリードを無視しての除去。CLC ゲノミクス ワークベンチは、トリミングが低品質の領域を削除するための十分なかどうかを判断する読み取りおよびガイド トリミング設定し、後の初期品質を評価するために前に使用することができます品質管理レポートを提供できます。さらに、 de novoアセンブリの組み立てられたコンティグの品質評価できます十分な深さ (&gt; 1000 倍) と適用範囲 (図 4 a) の均一性。混合集団は、この段階で識別できます。複数のフルレングス (~ 9 kb) proviruses の混合物は、凹凸によりショート (大規模な内部削除を含む) とフルレングスの proviruses の混合物が識別できるに対し 40% 以上の周波数を持つ複数の Snp の存在によって識別されます。(図 4 b) 同じ参加者からフルレングス参照にマッピングを次の範囲をお読みください。
アプリケーションによっては、「r: A 言語と統計計算のための環境」の27のパッケージとして利用可能な ggtree などのツールを使用して最終的な配置を視覚化できます。 されます最近の研究では、反転シーケンス HIV-1 proviruses 素朴な中央、経過、エフェクター メモリー cd4 陽性から+ T に利用された特定の細胞のサブセットが高かった場合を識別する目的での長期的なアートの個人から分離した細胞そのまま遺伝子と潜在的レプリケーション主務 HIV 12の割合。ここでは、本研究 (参加者 2026) 1 つの参加者から分離されたシーケンスの視覚的表現は、(図 5) が表示されます。この参加者は経過メモリー cd4 陽性エフェクター、そのままシーケンスとシーケンスの大半 (97%) あった不良、+ T 細胞。この可視化ツールは、大規模な内部削除シーケンスの数とゲノム内の位置を示すに便利です。それは有害な停止コドンとなる、フレーム シフト突然変異、MSD のサイトおよび/または包装信号の削除/変異とシーケンスを示すためさらに付けることができます。
反転法の 1 つのアプリケーションは、遺伝子そのままと潜在的レプリケーション主務の HIV-1 proviruses の id です。CD4 から分離された 531 シーケンスの最近の調査で+ T 細胞の長期的なアートの参加者 6 名から 26 (5%) の遺伝子そのまま HIV-1 proviruses された識別された2。残りの欠陥のある proviruses が含まれて反転シーケンス (6%)、大規模な内部削除 (68%)、有害な停止コドン/超変異 (9%)、フレーム シフト突然変異 (1%)、および欠陥包装信号および/または MSD サイト (11%) の変異.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> 図 2: HIV-1 proviruses のde novoアセンブリのワークフローの概要。ワークフローにおける主要なステップがあります: 1) シーケンスを読んで品質管理、2) マージ重複するペア、3) de novoアセンブリ、および 4) 再合意形成それぞれの色が赤、青、緑、オレンジをされています。この図は、Hienerらから変更されています。2.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> 図 3: 例の agarose のゲルの PCR 増幅 HIV 1 proviruses.1、2、3、6、9、10 の井戸には、増幅の HIV-1 proviruses が含まれています。よく 10 を含む大規模な内部削除 provirus、よく 2 (混合物)、長さの異なる 2 つの HIV-1 proviruses の co 拡大を含む、よく 12 には肯定的な制御が含まれます。増幅産物を含む井戸の割合は 60% は単一のテンプレートを分離する必要割合上に注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> 図 4: 読み取りマッピングの出力例。(A) の例は、単一フルレングス HIV 1 provirus の増幅による適用範囲を示します。次のde novoアセンブリすべての読み取りは組み立てられた contig コンセンサス シーケンスを生成するにマップされます。ソフトウェア プラットフォームを十分なともカバレッジ検査マップの読み取りは許可します。(B) 例 (混合物) の異なる長さの 2 つの HIV-1 proviruses の共同の増幅を示します。混合物を決定するには、読み取りが同じ参加者からフルレングス (~ 9 kb) 参照シーケンスにマップし、マッピングを検査します。不均一なカバレッジの存在は、混合物を示しています。この図は、Qiagen14の許可を得て再現します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> 図 5: CD4 から分離された HIV 1 プロウイルス シーケンスの例の視覚化+ T 細胞サブセット長期的なアートの個人から。個々 の HIV-1 プロウイルス シーケンスは、水平方向の線によって表されます。この図は、Hienerらから変更されています。2.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

潜在性の決定の増幅とフルレングス (そのまま、欠陥) HIV-1 の proviruses の近くの 1 つのシーケンスに効率的かつ高スループット方法を提供でき、フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転)レプリケーション能力。反転は、潜在的な HIV 1 貯水池をシーケンス処理する設計されています以前の試金の限界を克服します。

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

この方法は、HIVプロウイルスおよび異なる細胞タイプの遺伝的組成を決定するなど、HIV分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。特に遺伝的に無傷で、潜在的に複製能力のあるものを特定する。この技術の主な利点は、単一のHIV感染細胞からほぼ全長HIVプロウイルスを増幅し、次に次世代シーケンシングによってこれらを配列できることです。まず、テキスト プロトコルで説明されているように、すべてのバッファを準備します。細胞ペレットを取得し、100万個の細胞あたり100マイクロリットルのライシスバッファーを追加します。上下にピペットを入れ、混ぜます。サーマルサイクラーで55°Cで1時間インキュベートし、摂氏85度を15分間加えて細胞をライスします。単一のHIV-1 DNAプロウイルスの増幅を開始するには、テキストプロトコルの表1に示すように、第1ラウンドPCR用試薬を混合します。96ウェルPCRプレートの85ウェルに38マイクロリットルを加え、このプレートをPCR 1とラベル付けします。この後、PCR1プレートをゲノムDNAの添加用に指定した透明な領域に移動させます。塩酸トリ酸塩を使用して、1〜3の比から1〜81の比率からゲノムDNAを連続的に希釈し、各希釈液の45マイクロリットルを調製することを確認する。希釈したゲノムDNAを各サンプルウェルに2マイクロリットル、塩酸塩トリトリリットルを各陰性対照ウェルに2マイクロリットル加えます。正のコントロールを除いてプレート全体を密封します。次に、正のコントロールを追加するために指定された領域に移動します。対応するウェルに正のコントロールの2マイクロリットルを追加し、完全にプレートをシールします。PCR プレート スピナーを使用して、PRC 1 プレートを短時間回転させ、残りの内容物をウェルの側面から引き下げます。テキストプロトコルで概説されているように、サーマルサイクラーでPCR 1プレートを実行します。次に、表1に示したPCRの第2ラウンドの試薬を混合します。このPCR 2ミックスの28マイクロリットルを新しい96ウェルPCRプレートの85ウェルに加えます。このプレートに PCR 2 というラベルを付けます。プレートスピナーを使用して、PCR 1プレートを簡単に回転させて、ウェルの側面から残った内容物を引き下げる。このプレートの各ウェルに塩酸塩トリトリリットル80マイクロリットルを加えます。この後、マルチチャネルピペットを使用して、PCR 1プレートの各ウェルからPCR 2プレート内の対応するウェルに2マイクロリットルを転送します。PCR 2プレートを透明な粘着ラップでシールします。プレートスピナーでPCR 2プレートを簡単に回転させます。一方、PCR 1プレートをヒートシールフィルムで密封し、長期保存のためマイナス20°Cで保存します。テキストプロトコルで説明されているように、サーマルサイクラーでPCR 2プレートを実行します。次に、PCR 2プレートを簡単に回転させて、残った内容物をウェルの側面から引き下げる。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに塩酸塩トリ60マイクロリットルを加えます。次に、エチジウム臭化物を含む2つの48ウェルに15マイクロリットルのアガロースゲルを1%プリキャストして実行します。増幅された製品を含むウェルとそのおおよそのサイズを特定し、ゲル画像を保存します。この後、30%以下のウェルが増幅産物に陽性である希釈を決定する。まず、プレートスピナーを使用して、PCR 2プレートを短時間回転させ、残りの内容物をウェルの側面から引き下げます。増幅された製品を含むウェルから40マイクロリットルを新しい96ウェルミディプレートの対応する井戸に移します。次に、磁性ビーズを室温に持ち込み、80%エタノールの新鮮な溶液を調製することを確認する、磁気フィードベースの精製キットをセットします。ビーズが室温に達すると、それらが完全に再中断されていることを確認するためにそれらを渦。マルチチャンネルピペットを使用して、ミディプレートの各ウェルに40マイクロリットルの増幅産物に40マイクロリットルのビーズを加えます。上下に10回軽くピペットで混ぜます。室温で5分間インキュベートします。その後、プレートを磁気スタンドに移し、2分間放置します。この後、上清を取り除き、廃棄します。プレートをスタンドに残したまま、各ウェルに80%エタノール溶液の200マイクロリットルを加えてビーズを洗います。室温で30秒間インキュベートし、上清を取り除いて捨てます。この洗浄プロセスをエタノールを添加して上澄み物を捨てるまで一度繰り返します。マルチチャネルピペットを使用して、余分なエタノールを除去します。ビーズを15分間乾燥させます。この後、スタンドからプレートを取り外します。各ウェルに溶出バッファーの30マイクロリットルを追加し、10回上下に軽くピペットで混ぜます。室温で2分間インキュベートします。プレートを磁気スタンドに戻し、2分間放置します。マルチチャンネルピペットを使用して、上清の25マイクロリットルを新しい96ウェルPCRプレートの対応するウェルに移します。次に、スペクトル光度計を使用して、各増幅されたDNA産物の近似濃度を決定し、記録します。二本鎖DNA定量キットをセットし、無菌DNAフリー水でバッファーを1回希釈します。平底組織培養プレートの適切な数の空の井戸に99マイクロリットルのバッファーを追加します。その後、100マイクロリットルのバッファーを3つの空き井戸に加えます。測定される増幅産物ごとに、精製されたDNAを1マイクロリットルずつ三重に加えて、各ウェル含有緩衝液に添加する。希釈ラムダ二本鎖DNAは、マイクロリットル当たり2ナノグラムから10倍に、マイクロリットル当たりゼロナノグラムをポイントし、標準を調製する。各二本鎖DNA標準の100マイクロリットルを3つの井戸に加えます。蛍光染料をバッファーで1~200個希釈します。サンプル、ブランクまたは標準を含む各井戸に100マイクロリットルを素早く加え、上下にピペットを入れます。この後、光との接触を避けるためにホイルでプレートを覆います。マイクロプレートリーダーを使用して、蛍光放出を記録します。各サンプルに二本鎖DNAの濃度を測定するために記録された測定値を使用してください。その後、各精製物を水で希釈し、マイクロリットル当たり2ナノグラムの濃度をゼロポイントにします。入れ子 PCR に続いて、増幅産物は1%アガロースゲルで実行されます。PCR の初期品質は、コントロールを検査することによって決定できます。増幅産物を含む陰性制御は汚染を示し、増幅産物を含まない正の対照は不十分な増幅を示す。単一増幅プロウイルスを含む終点希釈時に実行されるウェルのみがシーケンシング用に考慮されます。異なる長さの複数の増幅されたプロウイルスを含む井戸は、この段階で視覚化することができますが、シーケンシングのために選択しないでください。デノボアセンブリの場合、組み立てられたコンティグの品質は、カバレッジの十分な深さと均一性を評価することができます。混合集団は、不均一なカバレッジの存在によってこの段階で識別することもできます。1人の参加者から分離された配列の視覚的表現は、その配列の97%に欠陥があることを明らかにする。エフェクターおよび過渡的メモリCD4陽性T細胞に見られる無傷の配列を有する。この手順を試みる一方で、限度希釈で得られた増幅産物(ウェルの30%以下が陽性)だけが単一のプロウイルスを含んでいるということを覚えておくことが重要です。この手順に従って、増幅産物を配列決定してHIVプロウイルスの遺伝子組成を決定することができる。その開発後、この技術は、HIV分野の研究者が、遺伝的に無傷のHIVプロウイルスおよび治療中の患者の異なる細胞タイプの分布を探求し、遺伝的に無傷で潜在的に複製可能な有能なプロウイルスが隠れる場所を決定する道を開いた。HIV感染細胞との作業は危険であり、適切な個人用保護具の着用や認定ラボの作業などの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られる必要があることを忘れないでください。

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Research

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