勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出
2018年7月26日
リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。
この方法は、ゲノムの新生鎖、リーディング鎖、および遅行鎖DNAに組み込まれるリボヌクレオチドの数などの質問に答えるのに役立ちます。この方法は、酵母ゲノム中のリボヌクレオチド密度に関する定量的および定性的な情報を提供できますが、哺乳類のゲノムなどの他のシステムにも適用できます。アルカリゲル電気泳動は、全ゲノムおよび鎖特異的なサザンブロッティングにおけるリボヌクレオチドの取り込みを半定量的に観察し、特定のゲノム遺伝子座での感度と定量を向上させます。
この手順を開始するには、新たに調製した酵母ゲノムDNAの各サンプルに6マイクロリットルの1モル水酸化カリウムを加え、摂氏55度で2時間インキュベートします。2時間後、サンプルを氷上で5分間インキュベートします。次に、各サンプルに4マイクロリットルの6〜6アルカリDNAローディングバッファーを加えます。
1%のアガロース、50ミリモルの水酸化ナトリウム、1ミリモルのEDTA pH 8からなるアルカリ性ゲルを、レーンごとに24マイクロリットルのDNAサンプルをロードできるコームでキャストします。サンプルのチューブを短時間スピンダウンします。各サンプルの24マイクロリットル全体をアルカリ性アガロースゲルにロードします。
適切なDNAサイズマーカーを含めます。30ボルトで30分間電気泳動します。次に、電圧を10ボルトに下げ、18〜20時間電気泳動します。
翌日、ゲルを中和します。ゲルを中和バッファー1に浸し、室温で穏やかに撹拌しながら45分間インキュベートします。中和バッファーブレンドを新しいバッファーと交換します。
そしてさらに45分間インキュベートします。DNAを染色するには、中和したゲルを、室温で1〜10000希釈のsybr金染色を含む200ミリリットルの水に2時間静かに振とうします。UVトランスイルミネーターを使用してDNAを視覚化します。
アルカリゲルからのDNAは、毛細管現象によって正に帯電したナイロン膜に移されます。まず、アルカリ性ゲルを室温でアルカリ性転写バッファーに15分間浸します。次に、ナイロンメンブレンを水で短時間濡らし、アルカリ性転写緩衝液に5分間浸します。
アガロースゲルのサイズよりわずかに大きいガラス製グラタン皿に3つの100ミリリットルガラスビーカーを反転させて、トランスファープラットフォームをセットアップします。ガラスビーカーの上にガラスプレートをセットします。3つのMMCHRクロマトグラフィーペーパーの2つの大きな部分をガラスプレートに掛けます。
クロマトグラフィー紙の上にアルカリ転写バッファーを注ぎ、ガラス皿の半分を満たします。5ミリリットルのガラスピペットを使用して気泡を滑らかにします。アガロースゲルを上に置きます。
再び、泡を滑らかにします。ゲルのすべての端をパラフィルムで囲みます。少量のアルカリ転写緩衝液をゲルに注ぎます。
あらかじめ浸したナイロンメンブレンをゲルの上に置き、気泡を滑らかにします。アガロースゲルのサイズにカットしたクロマトグラフィーペーパーを2枚入れます。それらをメンブレンの上に置き、気泡を滑らかにします。
トランスファーサンドイッチの上にペーパータオルの大きなスタックを置き、ペーパータオルの上にガラスプレートを慎重に置きます。上部に重りのあるオブジェクトを追加し、室温で一晩転送を進めます。翌日、トランスファースタックを慎重に分解します。
メンブレンを室温で中和緩衝液2に15分間浸します。UVクロスリンカーを使用して、DNAを荷電ナイロンメンブレンに架橋します。自動クロスリンク設定を使用します。
ハイブリダイゼーション手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されているように放射性標識プローブを調製します。接液メンブレンをハイブリダイゼーションチューブに転がし、新たに調製したハイブリダイゼーションバッファー25ミリリットルを加えます。摂氏65度をハイブリダイゼーションオーブンで回転させて1〜2時間インキュベートします。
溶液を慎重に注ぎ出し、25ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーとプローブを加えます。65°Cで16〜18時間、回転させてインキュベートします。次に、溶液を放射性廃棄物容器に注ぎます。
リン酸塩STS洗浄液をハイブリダイゼーションチューブに1つ加え、室温で5分間回転させます。このように、リン酸STS洗浄液1個で各5分間の5回の洗浄を行います。リン酸塩STS洗浄液による5回目の洗浄後、1つはリン酸塩STS洗浄液で膜を2回、2回、65°Cで回転しながら毎回15分間洗浄します。
ピンセットを使用してハイブリダイゼーションチューブからメンブレンを取り外し、開いたプラスチックスリーブプロテクターにメンブレンを置きます。蓋をしてイメージングプレートに露光します。必要に応じて、ブロットを剥がし、別のプローブで再度プローブします。
ストリッピングするには、メンブレンを25ミリリットルの50%ホルムアミド2XSSPE溶液で覆い、摂氏65度で2時間インキュベートします。溶液を放射性廃棄物容器に注ぎます。ハイブリダイゼーションチューブにリン酸STS洗浄液2を加え、摂氏65度で15分間回転させます。
ガイガーカウンターでメンブレンをチェックし、シグナルがないことを確認してから、前に示したようにプレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションを行います。これらのゲル画像は、水酸化カリウムの有無にかかわらず処理された酵母ゲノムDNAが、RNH2を欠く細胞がゲノム中により多くのリボヌクレオチドを保持することを示しています。ポリメラーゼ2のM644L変異体はリボヌクレオチドを組み込む能力を低下させますが、M644G変異体は野生型ポリメラーゼよりも多くのリボヌクレオチドを組み込んでいます。
アルカリ性アガロースゲルは、ストランド特異的サザンブロット分析によってさらにプローブできます。この例では、プローブは、ARS306の近くに2つの反対の向きで挿入されたURA3レポーター遺伝子内の新生先行DNA鎖にアニーリングします。新生リーディング鎖特異的プローブを用いたサザンブロッティングの代表的な結果は、野生型株およびリボヌクレオチド取り込みに適性であるポリメラーゼα、デルタ、イプシロンの変異体を発現する株において、リボヌクレオチドおよび新生リーディング鎖DNAのアルカリ切断によって引き起こされるDNA断片化パターンを示しています。
このグラフは、南側のブロットから各レーンの合計に対する割合による放射性信号の定量化を示しています。手順を試行する際は、ロックフェイス細胞から常に新たに分離されたDNAを使用することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、DNA修復の分野の研究者が、複製DNAポリメラーゼによってリボヌクレオチドが取り込まれる密度と鎖を定量化する道を開きました。
この手順に続いて、ゲノム内のリボヌクレオチドの位置などの追加の質問に答えるために、加水化末端シーケンシングやHydEn-seqなどの他の方法を実行できます。放射性物質の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、作業台や機器の汚染を避けるために常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この研究は、真核生物の核DNA複製中にDNAにリボヌクレオチドが組み込まれる実験的アプローチを提示します。適切に除去されない場合のリボヌクレオチドの潜在的な変異原性効果を強調します。
主要な研究要素
科学分野
- DNA複製
- ゲノム安定性
- 変異原性
背景
- リボヌクレオチドはDNAに見られる非標準的なヌクレオチドです。
- 除去されない場合、DNA損傷につながる可能性があります。
- その組み込みを理解することはゲノム完全性にとって重要です。
- リボヌクレオチドの組み込みを定量化する方法が必要です。
研究目的
- DNAにおけるリボヌクレオチドの組み込みを定量化する。
- リボヌクレオチドの変異原性効果を評価する。
- 様々なゲノム系に適用可能な方法を開発する。
使用された方法
- 半定量分析のためのアルカリゲル電気泳動。
- 感度の高い定量化のための鎖特異的サザンブロッティング。
- DNAサンプルに対する水酸化カリウム処理の使用。
- 最適な結果を得るための制御温度でのインキュベーション。
主な結果
- 酵母DNAにおけるリボヌクレオチド組み込みの定量データ。
- リーディング鎖とラギング鎖における組み込みの比較。
- リボヌクレオチドの変異原性ポテンシャルに関する洞察。
- 哺乳類ゲノムへの方法の適用可能性。
結論
- リボヌクレオチドはゲノム安定性にリスクをもたらします。
- 開発された方法は組み込みの定量化に効果的です。
- 結果はDNA損傷メカニズムの理解に影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Ribonucleotide incorporation into genomic DNA represents a source of instability that can confound target validation and lead identification efforts in drug discovery. Quantifying this incorporation enables mechanistic de-risking by clarifying sources of spontaneous mutagenesis that may obscure phenotype-genotype relationships in preclinical models. This capability supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true therapeutic signals from artifacts of DNA damage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates whether observed phenotypes stem from intended target modulation or ribonucleotide-induced DNA damage.
- Operational Value: Provides strand-specific quantification to de-risk hypotheses about gene function in yeast-based screening systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of isogenic yeast strains with defined ribonucleotide levels for consistent assay backgrounds.
- Operational Value: Standardizes genomic DNA quality control to reduce variability in fluctuation assays and reporter gene validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures ribonucleotide-induced mutagenesis rates to assess genetic stability of disease-relevant systems over extended culture.
- Operational Value: Supports longitudinal monitoring of genomic integrity in preclinical models used for lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation requires clean genetic backgrounds, particularly when using yeast models for pathway interrogation or phenotypic screening.
- Discovery Biology: Clarifies whether ribonucleotide incorporation contributes to background mutagenesis in fluctuation assays used for target validation.
- Screening: Ensures reagent consistency by qualifying DNA samples used in southern blot-based validation of genetic constructs.
- Analytics: Generates quantitative strand-specific data that enables comparison of polymerase variants or genetic backgrounds in lead identification campaigns.
- Translational Research: Tracks genomic stability metrics that inform risk-adjusted advancement from hit-to-lead stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable QC checkpoint for genomic DNA integrity across multiple yeast-based discovery platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying a known source of spontaneous mutagenesis in genetic screens.
- Operational Value: Introduces standardization for DNA sample preparation that improves reproducibility across fluctuation assays and southern blotting.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision confidence by controlling for DNA damage confounders in target validation data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by flagging models with elevated ribonucleotide levels that may require mitigation strategies.
Implementation Considerations
- Expertise in nucleic acid handling, radioactive probe techniques, and southern blot hybridization.
- Alkaline gel electrophoresis equipment, UV cross-linker, and phosphorimager for signal detection.
- Standardized protocols for potassium hydroxide treatment, neutralization, and membrane transfer to ensure inter-lab consistency.
- Adaptation considerations include optimizing probe design for different genomic loci and adjusting hydrolysis times for varying DNA sample qualities.
- Practical limitations include the semi-quantitative nature of alkaline gels without southern blotting and hazards associated with radioactive materials requiring specialized waste handling.
