Name: 勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶリボヌクレオチド鎖特異的検出法：酵母ゲノムにおけるリボヌクレオチド定量化と誘発突然変異評価の手法。この方法はDNA複製とゲノム安定性の研究に応用可能です。

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我々 は自分の仕事のすべての現在および元クンケル研究室メンバーに感謝と議論のプロトコルに関連して今回発表されたデータを再利用します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH)、国立環境衛生研究所 (NIEHS) の学内研究部門から T.A.K. にプロジェクト Z01 ES065070 によって支えられました。

1. アルカリ加水分解と特異的南しみ (図 1)
<ol><li>細胞増殖とゲノム DNA の隔離<ol>
<li>酵母 DNA 精製キットの製造元の指示に従ってを使用して酵母ゲノム DNA を分離します。(0.5 の光学密度) と 1 の間の成長の指数の段階にあるカルチャを使用します。TE バッファー (10 mM トリス-HCl, pH 7.5、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)) x 1 の 35 mL で最終的な DNA ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>DNA に 5 mg/mL RNase A の 1 つの mL を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート</li>
		<li>3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) の 0.1 のボリュームを使用して DNA を沈殿させると氷の上に 20 分間 100% エタノールの 2.5 倍の量。</li>
		<li>16,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>70% のエタノールの 500 mL で 2 回ペレットを洗浄します。ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>ベンチにペレットを乾燥し、TE バッファー x 1 の 35 ml で再懸濁します。</li>
		<li>DsDNA BR アッセイ キットと蛍光 (資材表) を用いた DNA 量的に表わします。</li>
		<li>3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.2 と 2.5 量 100% の 0.1 のボリュームを使用する各サンプルから DNA の 5 mg の沈殿物の合計量 200 mL EtOH (中性ゲル コントロールが必要な場合に追加、必要に応じて 5 mg の DNA が必要な場合は、H2O を追加)。20 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>16,000 x g で 4 ° C で 20 分間遠心ピペットを使用して上清を除去します。</li>
		<li>ベンチにペレットを乾燥させます。H2o. 14 mL で DNA を再懸濁します</li>
	</ol></li>
	<li>アルカリ加水分解しゲル電気泳動<ol>
<li>1 M 島の 6 mL を追加し、55 ° C 2 時間インキュベートします。</li>
		<li>5 分間氷の上のサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>アルカリの DNA 読み込みバッファー x 6 の 4 つの mL を追加: 300 ミリメートル島、6 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、18 %polysucrose (資材表)、0.15% ブロム クレゾール グリーンと 0.25% キシレンシアノール FF。</li>
		<li>1% のアガロース、50 mM NaOH、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0 で構成されるアルカリ ゲルをキャストします。1 レーンあたり読み込まれる DNA のサンプルの 24 mL は、櫛を使用します。</li>
		<li>X アルカリ電気泳動バッファー 1 で室温でゲルを実行: 50 mM NaOH、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。DNA サイズ マーカーが含まれます。</li>
		<li>チューブを簡単にスピンし、アルカリ agarose のゲルに全体 24 mL サンプルを読み込みます。30 V、10 V で 18-20 h に続いて、30 分 electrophorese します。</li>
		<li>穏やかな動揺の中和バッファー i: 1 M トリス-HCl、1.5 M の NaCl に室温で各 45 分の 2 の孵化のためのゲルを中和します。</li>
		<li>SYBR ゴールド汚れ穏やかな揺れで部屋の温度で 2 時間の 1/10,000 の希釈を含む水 200 mL で中和されたゲルを浸すことによって、DNA を染色します。</li>
		<li>UV transilluminator を用いた DNA を可視化します。アルカリ感度の向上は、DNA5で未修理リボヌクレオチドのより高い密度を示す小さい DNA のフラグメントの出現を引き起こします。</li>
	</ol></li>
	<li>南転送<ol>
<li>アルカリのゲルから DNA を転送すると、毛管作用10正荷電のナイロン膜。Sambrook とラッセルのマニュアル10この転送を設定する方法の例があります。</li>
		<li>アルカリの転送バッファーに室温で 15 分間アルカリ ゲルを浸す: 0.4 M NaOH、1 M 塩化ナトリウム。</li>
		<li>(ゲルのサイズへカット) ナイロン膜を水で簡単に濡れているし、アルカリ転送バッファーで 5 分間浸します。</li>
		<li>ガラスのグラタン皿に 3 のガラス ビーカー (100 mL) を反転による転送プラットフォームの設定します。この料理は agarose のゲルのサイズより少し大きめにする必要があります。それらの上にガラス板を設定します。</li>
		<li>ガラス板を 3 MM CHR 濾紙 (ゲルとバッファー貯蔵所にエッジの上に羽織ることができます長い方の辺の幅のサイズにカット) の 2 の大きい部分をかけなさい。</li>
		<li>アルカリの転送バッファーをクロマトグラフィー紙と半塗りガラス皿に注ぐ。5 mL ガラス ピペットを使用して泡を滑らか。</li>
		<li>上、再度泡を滑らかに agarose のゲルを配置します。パラフィルムでゲルのすべての端を囲みます。アルカリの転送バッファーのゲルの少量を注ぐ。</li>
		<li>漬けナイロン膜のゲルの上に配置します。泡を滑らか。</li>
		<li>ウェット 2 紙の部分は agarose のゲルのサイズにカットします。膜の上にそれらを配置し、任意の気泡を滑らかに。</li>
		<li>転送サンドイッチの上にペーパー タオル (agarose のゲルよりも少し大きいサイズにするカット) の大規模なスタックを配置します。ペーパー タオルの上にガラス板を慎重に配置します。トップ (質量 400 g うまくの本) に重み付きオブジェクトを追加します。</li>
		<li>室温で一晩進む転送ができます。</li>
		<li>慎重に転送スタックを離れて取り、中和バッファー II に室温で 15 分間膜を浸す: 0.5 M トリス-HCl、pH 7.2、1 M 塩化ナトリウム。</li>
		<li>クロスリンク UV 架橋剤を用いた荷電のナイロン膜への DNA。架橋剤の膜を置き、autocrosslink の設定を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>南部のプローブの準備 注: ラギング鎖の DNA の繊維の対初期リードでアルカリに敏感なサイトのプロトコルに基づいていますを検出するここで説明している方法は11で公開以前。実験調査は III (図 3 a) 染色体のARS306の複製の起源に隣接する 2 つの方向 (または 1 つまたは OR2) のいずれかで挿入されているURA3のレポーターの遺伝子で実行されます。酵母ゲノム DNA にアルカリに敏感なサイトの存在は、リボヌクレオチド定款、DNA ポリメラーゼ活性12,13,14のバイオ マーカーとしてリボヌクレオチドの使用を許可するインジケーターです。ターゲットのレプリケーションでは、効率的なARS306の起源に隣接する DNA シーケンスを使用して、このアプローチは、他のゲノムの場所と同様に標的遺伝子を受けやすいはずです。<ol>
<li>次のプライマー対を用いたURA3レポーターの遺伝子の PCR 増幅 520 基ペア セグメント: URA3-F1 (5´ GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) と URA3 R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC)。</li>
		<li>テンプレートとして酵母ゲノム DNA の 10-20 ng、4 μ L 各のプライマー (10 μ M 在庫)、Taq バッファー Ex (Mg2 + plus)、dNTP の混合物 (2.5 mM) の 8 μ L、0.5 μ L の Ex Taq DNA ポリメラーゼの x 10 の 10 μ L の PCR 反応を実行 (5 U/μ L)、H2o. の 100 μ L に最終的な音量を調整して</li>
		<li>次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。1 分、1 分、2 分; 72 ° C 55 ° C の 95 ° C の 30 サイクル4 ° C で 10 分押しのための 72 ° C</li>
		<li>PCR 精製キットを使用して PCR の製品の浄化し、H2o. の 50 mL を使用して DNA を溶出これは今 radiolabeling 反応のテンプレートとして使えます。</li>
		<li>アンチセンス カイネティックスの次のプライマーを使用: 使用 URA3 A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) プローブ A. 焼鈍 DNA を可視化します。OR2 と鎖 DNA の遅れまたは 1 つのURA3は、tnascent、 URA3のとき、これは初期の主要な鎖 DNA に対応します。URA3 B (5´ CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) を使用して、プローブ B. 焼鈍新生 DNA を可視化します。URA3は、または 1 つの初期のラギング鎖の DNA URA3 OR2 の場合初期の主要な鎖 DNA に相当 (図 3)。<ol>
<li>テンプレート DNA、プライマー (10 μ M 在庫)、Taq バッファー (Mg2 + plus) Ex 10 x の 5 μ L、4 μ L (dCTP) マイナス 2.5 mM dNTPs の 2 μ L と 10-20 ng 増幅URA3フラグメントを用いた radiolabeling 反応を実行 -32P dCTP の 5 μ L (50 μCi)、0.5 μ L の ExTaq DNA ポリメラーゼ (5 U/μ L) H2O を実行次のカイネティックスのプログラムの 50 μ L に最終的な音量を調整して: 94 ° C、5 分。25 サイクル 94 ° c 1 分、55 ° C、30 秒、1 分; 72 ° C4 ° C で 5 分押しのための 72 ° C</li>
		</ol>
</li>
		<li>G-25 スピン列を使用して、非法人放射性ラベルを削除します。標識のサンプルを追加するには、前にピペッティングで 720 g、削除バッファー x で 1 分の列を遠心します。標識反応生成物と分類されたプローブを溶出する 720 x g で 2 分間遠心をロードします。</li>
		<li>95 ° c 直前のハイブリダイゼーション プローブを変性する 5 分間インキュベートします。簡単にクールな氷の上。</li>
	</ol></li>
	<li>南交配<ol>
<li>交配管に接液膜と 25 mL の作りたての交配バッファーを追加: 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2, 7% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、1% ウシ血清アルブミン (BSA)。ハイブリダイゼーション オーブンで回転で 1-2 時間の 65 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>慎重に、溶液を捨て、交配バッファー プラス放射性標識プローブの 25 mL を加えます。65 ° C 回転で 16-18 h で孵化させなさい。</li>
		<li>放射性廃棄物コンテナーに、溶液を注ぐ。隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション i: 40 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2、室温で 5 分の 5 の洗浄を行う 5 %sds、0.5 %bsa、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。</li>
		<li>隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション II と 65 ° C で 15 分の 2 洗浄を実行: 40 mM リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.2, 1 %sds、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0。</li>
		<li>ピンセットを用いたハイブリダイゼーション チューブから膜を取り出し、開いているプラスチック製のスリーブ プロテクターに置きます。カバーし、イメージング プレートを公開します。異なる露出時間 4 h から 4 d に至るまでの数をみてください。</li>
		<li>必要に応じて、除去し、再約 3-4 倍異なるプローブを用いてしみをプローブします。ストリップ、65 ° c 50% ホルムアミド、2 x SSPE ソリューションの 25 mL で 2 h の膜をインキュベートします。 注: 20 x SSPE 原液: 3 M の NaCl、0.2 M NaH2PO4、0.02 M の EDTA、pH 7.4。</li>
		<li>放射性廃棄物コンテナーに、溶液を注ぐ。隣酸塩 SDS 洗浄ソリューション II の 65 ° C で 15 分の 2 洗浄を実行します。</li>
		<li>ガイガー カウンターを持つ膜をチェックし、信号が残っている場合、ストリップのプロトコルを繰り返します。</li>
		<li>前述の通り前の雑種との交配を実行します。</li>
	</ol></li>
</ol>2 突然変異率と酵母菌の特異性の測定
<ol><li>細胞培養を準備します。<ol>
<li>(アデニンの補充のみ必要な場合は 250 mg/mL アデニンと補われる産スープの 5 mL に 100 mg/mL アデニンと補われた YPD 寒天上に成長した単一コロニー (健全な酵母細胞がサイズ適切なフォームに 30 ° C で 2-3 日植民地) を接種します。使用ずみはアデニン auxotroph) です。成長するシェーカー インキュベーターまたは 30 ° C で回転子の文化に達する飽和 (重度の成長障害なしひずみの 36-48 h) まで。</li>
		<li>〜 2000 x g で 5 分で細胞をスピンします。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、5 mL の滅菌水で洗浄を行う。</li>
		<li>500 mL の滅菌水に細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞培養とめっきの希釈<ol>
<li>非選択のコントロールの 1,600,000 のプレート 100 mL 完了 (COM) プレート上に各文化の要因によって 96 ウェル プレートで細胞を希釈します。</li>
		<li>Ura3変異体の選択、100 mL 原液細胞野生型 (WT) ひずみの 5 フォア プレートのプレートします。興味のひずみの突然変異率は WT ひずみよりも高くなると予想される場合、セルをそれに応じて希釈します。</li>
		<li>Can1変異体の選択、セルを 5 倍希釈、WT ひずみのカナバニン含むプレート (缶) 100 mL をプレートします。希釈率は 0.5 です。</li>
		<li>イースト菌のコロニーが形成されるまでは、30 ° C でプレートを孵化させなさい。成長欠陥なし系統、2-3 日は COM は通常十分なプレートと 5 フォア プレートの 3-5 日をすることができます。異なる系統間変異率を比較すると、同じ日にコロニーをカウントする成長を選択することをお勧めします。冷蔵室 (~ 4 ° C) でカウントする準備ができてのプレートを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自然突然変異率の計算<ol>
<li>各プレート上の目に見えるコロニーをカウントし、コロニー数のメモを取る</li>
		<li>ドレークの式を使用して突然変異率を計算: μ = f ÷ ln (μNt)。fは変異頻度の変異体の最終的な培養細胞の数で割った値の数によって計算されます。Nt は最終的な培養細胞の数であり、 μは突然変異率。この方程式は、ニュートン ・ ラプソン法などの反復的な方法で解決できます。突然変異率15を計算するリー ・ コールソンのテストを含むその他の推定方法あります。</li>
		<li>各分離株の utation 率の信頼区間と仮定すると対数正規分布を計算します。95% 信頼区間が最もよく使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>突然変異スペクトルの解析<ol>
<li>各 5 FOA から単一コロニーを拾うまたは板することができますと産板リフレッシュします。</li>
		<li>コロニー次のプライマーを用いて突然変異を検出するためにURA3またはCAN1の遺伝子そしてシーケンスを増幅する PCR を実行: URA3 F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') URA3 r (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') 両方の PCR の拡大のため、800 bp URA3遺伝子の塩基配列決定CAN1 F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') CAN1 r (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') の増幅特性と CAN1 AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3')、CAN1 9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3')、CAN1 10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') と CAN1 BR (5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1レポーターの遺伝子の順序のため。</li>
		<li>コロニー PCR を行うには、5 μ L H2O ので単一コロニーを再懸濁し、テンプレートとして 1 μ L を使用します。プライマー (5 μ M 株式) 5 x KAPA2G バッファー (Mg2 + plus) の 2 μ L のそれぞれの 1 μ L、dNTP (2.5 mM) の 0.5 μ L、0.5 μ L の KAPA2G 高速 DNA ポリメラーゼ、H2o. の 12 μ L を追加します。</li>
		<li>URA3遺伝子の増幅、次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。5 サイクル 95 ° C の 10 s、61 ° C、15 s、30 のための 72 ° C s;95 ° C の 10 のためのサイクル 35 秒、61 ° C、15 s 72 ° C、30 s;4 ° C で 2 分押しのための 72 ° CCAN1遺伝子の増幅、次の PCR プログラムを実行: 95 ° C、5 分。5 サイクル 95 ° C の 10 秒、61 ° C、15 s、45 のための 72 ° C s;95 ° C の 10 のためのサイクル 35 秒、61 ° C、15 s、45 のための 72 ° C s;4 ° C で 2 分押しのための 72 ° C</li>
		<li>突然変異を識別するために DNASTAR Seqman プロや Sequencher などのプログラムを使用して参照シーケンスにシーケンス結果を合わせます。</li>
		<li>突然変異型 (図 4) または突然変異の場所 (図 5) での突然変異のデータをコンパイルします。(観測されたイベントの数は突然変異体シーケンスの数で割った値) 突然変異の頻度の特定の突然変異率を乗じた全体的な突然変異率を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
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ここでは、2 組の DNA 複製と未修理リボヌクレオチドの変異原性の効果の中に組み込まれてリボヌクレオチドを半定量的に解析は、頻繁に実験のためのプロトコルについて述べる。ただし、これらのアプローチは、モデルが出芽酵母を真核生物を含む、他の微生物とさらに高い真核生物にこれらの技術を簡単に適合できます。
南しみが付くことと相まってアルカリ アガロース電気泳動による DNA の未修理リボヌクレオチドのプロービング リボヌクレオチドの現在の数と彼らに組み込まれたストランドに関する重要な情報を提供します。しかし、そのアルカリ感度は基本サイトなど、他の DNA の病変によっても発生に注意する重要です。リボヌクレオチドを DNA 検出の別の手段は、哺乳類細胞21で行われている精製の RNase H2 酵素治療で。我々 のアプローチはありますがラギング繊維URA3レポーターの遺伝子変異解析実験に用いたのと初期のリードでアルカリに敏感なサイトの調査、それは注文の他の場所でアニール プローブを設計することが可能他のゲノ...

真核生物の核 DNA の複製時に、リボヌクレオチドはすべての 3 つの主要な DNA replicases、DNA ポリメラーゼ (政治家) α、ε、δ1、2ゲノムに組み込まれます。RNase H2 依存リボヌクレオチド切除修理 (RER3) は、これらの組み込みのリボヌクレオチドの大半を削除します。
糖の水酸基 2' 2' 3' 環状リン酸や 5'-オハイオ州4と他の 1 つの端を解放、隣接のリン酸ジエステル結合を攻撃できる DNA のリボヌクレオチドは、加水分解を受けやすい。アルカリ条件大幅にこの反応を加速することができます。したがって、基本的なソリューションで潜伏中に埋め込まれたリボヌクレオチドの加水分解アルカリ アガロース電気泳動5で目視できるゲノム DNA の断片化が発生します。この DNA を膜に転送およびアルカリに敏感なサイトに、新生リード- またはラギング鎖の DNA を組み込むリボヌクレオチドによって引き起こされるを識別できるように特異的プローブを用いたサザンブロット解析によって検出できます。それぞれ。
酵母細胞 H2 RNase 活性、トポイソメラーゼ (Top1) 私は埋め込みリボヌクレオチド6,7で DNA をニックスするときリボヌクレオチドの除去を開始できます。ただし、Top1 は、リボヌクレオチドの 3' 側に切断、これは 5'-オハイオ州と桿菌に難治性 2' 3' 環状リン酸の DNA 終了を生成します。修理、またはこれらの '汚れた部分' の異常処理に失敗はゲノム不安定性につながることができます。さらに、切開繰り返し DNA シーケンス内で発生すると、修復処理は欠失変異体につながります。タンデムリピートのため、これは特に問題となる、削除に短い (の 2 つおよび 5 つの塩基対の間) が一般的に RNase H2 欠損細胞で観察されます。酵母リボヌクレオチド体用新生リーディング鎖合成中に無差別 DNA ポリメラーゼ ε 変異 (pol2 M644G) の活動によって悪化させる RNase H2 の不在で Top1 依存への有害な影響。
自発の突然変異につながる DNA のリボヌクレオチドの処理と適切なレポーター遺伝子を使用し、付属の形質転換の選択でこの変異を検出できます。変動試験やルリアと Delbrück の実験は、選択可能なレポーター遺伝子8,9を使用して突然変異率を測定する最も一般的な方法の 1 つです。酵母、 URA3とCAN1遺伝子は、遺伝子の機能が失われるすべての突然変異型の検出を可能にする前進突然変異試験で記者として使えます。突然変異率はターゲットのレポーターの遺伝子の変異のないシングル コロニーから始まった複数並列文化の観察中央値として。RNase H2 欠損株rnh201Δ はタンデムで 2-5 bp 削除の発現率が上昇によって引き起こされる主穏やかに上昇の全体的な突然変異率などの酵母は、シーケンスを繰り返します。したがって、リボヌクレオチドのゲノムの変異原性の効果を完全に特徴づける、特定の突然変異率を決定する必要があります。この場合は、 URA3またはCAN1のレポーター遺伝子を増幅し、シーケンスの種類と、突然変異の場所を決定することができます、特定の突然変異率を算出することができます。複数の独立したURA3またはCAN1変異体の突然変異をコンパイルは、突然変異スペクトルを生成する使用できます。

<table><tbody><tr><td>YPD培地</td><td></td><td></td><td>20gのデキストロース、20gのペプトン、10gの酵母抽出物、脱イオンH2Oで最大1Lまで、固体培地、オートクレーブ用の20gのバクト寒天を追加します。</td></tr><tr><td>COMプレート</td><td></td><td></td><td>1.3 g SCドロップアウトミックス、1.7 g酵母窒素塩基、アミノ酸または(NH4)2SO4、5 g(NH4)2SO4、20 gデキストロース、20 gバクト寒天脱イオンH2O最大1 L.pHを5.8に調整します。オートクレーブと30 &ndash;プレートあたり35ml。</td></tr><tr><td>CANプレート</td><td></td><td></td><td>1.3 gのSC-Uraドロップアウト粉末、1.7 gの酵母窒素塩基、アミノ酸または(NH4)2SO4、5 g(NH4)2SO4、20 gのデキストロース、20 gのバクト寒天、25 mgのウラシル、およびH2Oを最大1 L.オートクレーブで121°Cで15分間。Cを56°Cまで冷まし、フィルター滅菌した1%カナバニン硫酸塩溶液6mLを加えます。</td></tr><tr><td>5-FOAプレート</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Uraドロップアウトパウダー、1.7 g酵母窒素塩基、アミノ酸または(NH4)2SO4、5 g(NH4)2SO4、20 gデキストロース、20 gバクト寒天、25 mgウラシル、H2O最大800 mL。121°Cで15分間オートクレーブ。Cおよび60 &deg; C.まで冷やし、フィルター滅菌した0.5% 5-FOAの解決の200のmLを加える。</td></tr><tr><td>L-カナバニン硫酸塩</td><td>米国生物学的</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>米国生物学的</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mLガラス培養管</td><td></td><td></td>任意の<td>ブランド</td></tr><tr><td>30 >Cインキュベーター</td><td></td><td></td><td>シェーカーインキュベーターは代わりに使用することができます</td></tr><tr><td>96ウェルラウンドボトムプレート</td><td></td><td></td><td>滅菌、任意のブランド</td></tr><tr><td>3mmガラスビーズ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-312A</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>12チャンネルピペット</td><td></td><td></td><td>任意のブランド</td></tr><tr><td>Ex Taq DNAポリメラーゼ</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>エピセンターマスターピュア酵母DNA精製キット</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M 酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>新しいモデルが利用可能</td></tr><tr><td>dsDNA BR アッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>、シグマ、アルドリッチ</td><td>、E7889</td><td></td></tr>、<tr><td>Ficoll 400</td>、<td>Dot Scientific、Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>ブロモクレゾールグリーン</td>イースト<td>マン</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノールFF</td><td>インターナショナルテクノロジーズ株式会社</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 金核酸ゲル染色</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>UV トランスイルミネーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アマシャムナイロン膜 Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR クロモトグラフィー紙</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 スピンカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>ガイガーカウンター</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

核 DNA のリボヌクレオチドの存在は、ゲノム不安定性の源であると示されています。リボヌクレオチド定款のエクステントがアルカリ加水分解によって評価される、電気泳動のゲルの RNA は非常にアルカリ条件で加水分解しやすい。これは、南しみ分析との組み合わせで使用できます場所を決定し、リボヌクレオチドが組み込まれてに鎖。ただし、この手順は半定量的のみと感度は向上しますがアンチセンス サザンブロット プロービングにリボヌクレオチド コンテンツの小さな変化を検出する十分な区別できない場合があります。DNA のリボヌクレオチドの最も顕著な生物学的影響の 1 つとしては、前進突然変異試験を使用して自然発生突然変異を分析できます。適切なレポーター遺伝子を使用すると、選択した、全体的な機能の喪失の結果まれな突然変異ができるし、レポーターの遺伝子の DNA 塩基配列と変動実験からのデータを組み合わせることで特定の突然変異率を測定できます。変動アッセイは、さまざまな特定の遺伝的背景や成長条件で変異原性のプロセスを調べるに適用されます。

アルカリ アルカリ電気泳動続いて付いている genomic DNA の治療安定法人リボヌクレオチドの豊かさによる DNA 断片化の半定量的な検出が可能です。酵母ゲノム DNA 治療島5の有無のゲル画像を図 2に示します。Pol2、Polε の触媒サブユニットの M644L バリアントは、M644G 変異体を組み込んだ WT ポリメラーゼよりもより多くのリボヌクレオチド中リボヌクレオチドを組み込む能力を削減しています。プロトコルの詳細、アルカリのゲルは、アンチセンス サザンブロット法によりさらに検出できます。隣接する原点を基準にしてプローブのゲノムのサイトの場所の知識を持つ我々 は選択的に組み込まれて、新生リボヌクレオチドを調べることができるリードまたはラギング繊維。図 3は、発火初期複製の起源ARS30616の近くに 2 つの反対方向に挿入<...

リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2 つの実験的アプローチを紹介します。

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

この方法は、ゲノムの新生鎖、リーディング鎖、および遅行鎖DNAに組み込まれるリボヌクレオチドの数などの質問に答えるのに役立ちます。この方法は、酵母ゲノム中のリボヌクレオチド密度に関する定量的および定性的な情報を提供できますが、哺乳類のゲノムなどの他のシステムにも適用できます。アルカリゲル電気泳動は、全ゲノムおよび鎖特異的なサザンブロッティングにおけるリボヌクレオチドの取り込みを半定量的に観察し、特定のゲノム遺伝子座での感度と定量を向上させます。この手順を開始するには、新たに調製した酵母ゲノムDNAの各サンプルに6マイクロリットルの1モル水酸化カリウムを加え、摂氏55度で2時間インキュベートします。2時間後、サンプルを氷上で5分間インキュベートします。次に、各サンプルに4マイクロリットルの6〜6アルカリDNAローディングバッファーを加えます。1%のアガロース、50ミリモルの水酸化ナトリウム、1ミリモルのEDTA pH 8からなるアルカリ性ゲルを、レーンごとに24マイクロリットルのDNAサンプルをロードできるコームでキャストします。サンプルのチューブを短時間スピンダウンします。各サンプルの24マイクロリットル全体をアルカリ性アガロースゲルにロードします。適切なDNAサイズマーカーを含めます。30ボルトで30分間電気泳動します。次に、電圧を10ボルトに下げ、18〜20時間電気泳動します。翌日、ゲルを中和します。ゲルを中和バッファー1に浸し、室温で穏やかに撹拌しながら45分間インキュベートします。中和バッファーブレンドを新しいバッファーと交換します。そしてさらに45分間インキュベートします。DNAを染色するには、中和したゲルを、室温で1〜10000希釈のsybr金染色を含む200ミリリットルの水に2時間静かに振とうします。UVトランスイルミネーターを使用してDNAを視覚化します。アルカリゲルからのDNAは、毛細管現象によって正に帯電したナイロン膜に移されます。まず、アルカリ性ゲルを室温でアルカリ性転写バッファーに15分間浸します。次に、ナイロンメンブレンを水で短時間濡らし、アルカリ性転写緩衝液に5分間浸します。アガロースゲルのサイズよりわずかに大きいガラス製グラタン皿に3つの100ミリリットルガラスビーカーを反転させて、トランスファープラットフォームをセットアップします。ガラスビーカーの上にガラスプレートをセットします。3つのMMCHRクロマトグラフィーペーパーの2つの大きな部分をガラスプレートに掛けます。クロマトグラフィー紙の上にアルカリ転写バッファーを注ぎ、ガラス皿の半分を満たします。5ミリリットルのガラスピペットを使用して気泡を滑らかにします。アガロースゲルを上に置きます。再び、泡を滑らかにします。ゲルのすべての端をパラフィルムで囲みます。少量のアルカリ転写緩衝液をゲルに注ぎます。あらかじめ浸したナイロンメンブレンをゲルの上に置き、気泡を滑らかにします。アガロースゲルのサイズにカットしたクロマトグラフィーペーパーを2枚入れます。それらをメンブレンの上に置き、気泡を滑らかにします。トランスファーサンドイッチの上にペーパータオルの大きなスタックを置き、ペーパータオルの上にガラスプレートを慎重に置きます。上部に重りのあるオブジェクトを追加し、室温で一晩転送を進めます。翌日、トランスファースタックを慎重に分解します。メンブレンを室温で中和緩衝液2に15分間浸します。UVクロスリンカーを使用して、DNAを荷電ナイロンメンブレンに架橋します。自動クロスリンク設定を使用します。ハイブリダイゼーション手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されているように放射性標識プローブを調製します。接液メンブレンをハイブリダイゼーションチューブに転がし、新たに調製したハイブリダイゼーションバッファー25ミリリットルを加えます。摂氏65度をハイブリダイゼーションオーブンで回転させて1〜2時間インキュベートします。溶液を慎重に注ぎ出し、25ミリリットルのハイブリダイゼーションバッファーとプローブを加えます。65°Cで16〜18時間、回転させてインキュベートします。次に、溶液を放射性廃棄物容器に注ぎます。リン酸塩STS洗浄液をハイブリダイゼーションチューブに1つ加え、室温で5分間回転させます。このように、リン酸STS洗浄液1個で各5分間の5回の洗浄を行います。リン酸塩STS洗浄液による5回目の洗浄後、1つはリン酸塩STS洗浄液で膜を2回、2回、65°Cで回転しながら毎回15分間洗浄します。ピンセットを使用してハイブリダイゼーションチューブからメンブレンを取り外し、開いたプラスチックスリーブプロテクターにメンブレンを置きます。蓋をしてイメージングプレートに露光します。必要に応じて、ブロットを剥がし、別のプローブで再度プローブします。ストリッピングするには、メンブレンを25ミリリットルの50%ホルムアミド2XSSPE溶液で覆い、摂氏65度で2時間インキュベートします。溶液を放射性廃棄物容器に注ぎます。ハイブリダイゼーションチューブにリン酸STS洗浄液2を加え、摂氏65度で15分間回転させます。ガイガーカウンターでメンブレンをチェックし、シグナルがないことを確認してから、前に示したようにプレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションを行います。これらのゲル画像は、水酸化カリウムの有無にかかわらず処理された酵母ゲノムDNAが、RNH2を欠く細胞がゲノム中により多くのリボヌクレオチドを保持することを示しています。ポリメラーゼ2のM644L変異体はリボヌクレオチドを組み込む能力を低下させますが、M644G変異体は野生型ポリメラーゼよりも多くのリボヌクレオチドを組み込んでいます。アルカリ性アガロースゲルは、ストランド特異的サザンブロット分析によってさらにプローブできます。この例では、プローブは、ARS306の近くに2つの反対の向きで挿入されたURA3レポーター遺伝子内の新生先行DNA鎖にアニーリングします。新生リーディング鎖特異的プローブを用いたサザンブロッティングの代表的な結果は、野生型株およびリボヌクレオチド取り込みに適性であるポリメラーゼα、デルタ、イプシロンの変異体を発現する株において、リボヌクレオチドおよび新生リーディング鎖DNAのアルカリ切断によって引き起こされるDNA断片化パターンを示しています。このグラフは、南側のブロットから各レーンの合計に対する割合による放射性信号の定量化を示しています。手順を試行する際は、ロックフェイス細胞から常に新たに分離されたDNAを使用することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、DNA修復の分野の研究者が、複製DNAポリメラーゼによってリボヌクレオチドが取り込まれる密度と鎖を定量化する道を開きました。この手順に続いて、ゲノム内のリボヌクレオチドの位置などの追加の質問に答えるために、加水化末端シーケンシングやHydEn-seqなどの他の方法を実行できます。放射性物質の取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、作業台や機器の汚染を避けるために常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

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mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

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