Name: 時計遺伝子の発現に対する病原体関連分子パターンの影響を評価するためにマウスの脾細胞の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学ぶマウス脾細胞を用いた時計遺伝子発現への病原体関連分子パターンの影響評価法。免疫学と概日生物学の研究において、微生物成分が分子時計に与える作用を解析する再現性の高い手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業によって支えられた教員研究費ハートフォード大学の教養と科学学部長のオフィスから。

調査中, 動物のケアと治療国立衛生研究ポリシー遵守制度のガイドラインに従って, ハートフォード大学動物施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 動物の同調
メモ: 20 週齢雄 B6129SF2/J マウスの研究で使用します。
<ol><li>マウスに 12 h 光 (標準的なオーバーヘッド白色光) を同調/12 h 暗いサイクル実験開始前 2 週間。 注: ここで同調因子タイム (ZT) 0 に対応して点灯し、ZT12 消灯、すべての他の環境要因 (すなわち食糧、水および部屋の温度) を維持しながら定数21。</li>
</ol>2. 楽器、培地、およびチャレンジ中の準備
<ol><li>オートクレーブ鉗子と解剖はさみ。アルミ箔とオートクレーブの曇らされた顕微鏡スライドのペアをラップします。</li>
	<li>ウシ胎児血清 (FBS) を追加することで培地を準備すると、10% の最終的な集中を RPMI 1640。次の PAMPs を培養培地に追加することによって 50 mL チューブに挑戦中の 10 mL を準備 (10% RPMI FBS);LP (5 μ g/mL)、ODN1826 (5 μ g/mL)、リステリア菌を熱殺された (108 HKLM/mL)、または、推奨濃度別種緑化。</li>
	<li>暖かい培地と水のお風呂で 37 ° C にチャレンジ中、室温で約 70 mL の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.2) を維持します。</li>
	<li>10 mL の培地 10 mL のピペット、ピペット 50 mL のチューブに援助を使用して氷の上を追加します。</li>
	<li>微生物汚染を防ぐためにビーカーにハサミ、鉗子を解剖の両端を 100 mL ビーカーと場所に 70% のエタノールの約 30 mL を追加します。</li>
	<li>50 mL のチューブでバッファー RLT すべて 1 mL に 10 μ L β-メルカプトエタノール (ドラフト) の下を追加することにより RNA の隔離のための換散バッファーを準備します。必要な (約 1 × 106細胞から成っているサンプルあたり 600 μ) となる量だけを作る。 注: バッファー RLT、シリカ膜への RNA のバインディングをサポートする RNA 抽出キットのコンポーネントです。</li>
</ol>3. 卵白アルブミンの分離と挑戦
<ol><li>彼らの元のケージでそれらを維持流量 3 L/分続行呼吸停止後 1 分の CO2を供給でケージに CO2を追加することによって麻酔を介して特定の同調因子でもマウスを安楽死させます。</li>
	<li>頭蓋骨の付け根首の両側に親指と人差し指を置くことによって頚部転位による死を確認します。尾または頭蓋骨22から頚椎の分離を引き起こし後肢の基部 (他の手を使用して) すぐに引きながら、または、頭蓋底の棒を押します。</li>
	<li>70% のエタノールとペーパー タオルで拭くとマウス トランクをスプレーします。そのバックとその右側にわずかに傾いたにマウスを配置します。毛皮を切り取る、解剖を使用してはさみ、マウスの左側に沿ってについて途中でフロントと後ろ脚の間。</li>
	<li>鉗子を使用すると、腹膜をつかんで慎重に脾臓を損傷しないように切開を行います。鉗子で脾臓を取り外し、培地の氷の約 10 ml 滅菌 50 mL チューブに入れます。残りの家畜を繰り返します。 注: 脾臓腎臓豆の色である、それは長く、腎臓よりも平坦。</li>
	<li>
小さな滅菌シャーレに培養液 2 mL で 1 つ脾臓を転送します。
	<ol>
<li>2 つの滅菌曇らされたスライドのつや消し部分の間研削によって脾臓を均質化します。均質化過程で培地で問題と細胞を維持、可能であれば。</li>
		<li>一度徹底的に均質化、50 mL のチューブに 40 μ m ナイロン携帯こし器を通って脾細胞を含む培地の 2 mL ピペットで移しなさい。</li>
		<li>培地、細胞ストレーナーと曇らされたスライドの新しいペア、50 mL の管を使用して残りの脾臓の上記の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各 10 mL/チューブの合計ボリュームの脾細胞を含む 50 mL チューブに冷たい培養液 8 mL を追加します。診断の 1 ミリリットルあたりのセルの数を決定します。</li>
	<li>6 ウェル培養皿に約 1 × 106細胞/ウェルを追加します。細胞を実験に使用されている異なる PAMPs の数に対応し、コントロールを含める井戸の数も追加します。それぞれの井戸に培地のまたは挑戦中の 3 mL 3 mL を追加します。</li>
	<li>37 ° c 3 時間 5% CO2で板を孵化させなさい。</li>
	<li>まあ使用して P1000 のピペットに添付 1,000 μ L ピペット先端部の底から細胞をこすり取る。15 mL チューブに同じ 1,000 μ L ピペット チップを用いた細胞を含む培地を転送します。</li>
	<li>167 x g室温で 5 分間遠心分離して細胞をペレットします。上澄みを除去し、5 mL の PBS のセル餌を洗浄します。</li>
	<li>ペレットのセル 167 x gで 5 分間の 2 回、上清を除去、細胞ペレットに細胞を溶解するために換散バッファーの 600 μ L を追加します。RNA の隔離に進みます。</li>
</ol>4. RNA の隔離と cDNA の統合
<ol><li>製造元の指示に従って RNA 抽出キットを使用して脾細胞からの RNA を隔離し、'オプション' の列に DNA 消化を実行します。</li>
	<li>CDNA 合成前に cDNA 合成キットの濃度が最適な RNA 範囲 (最大 2 μ g) 内にあることを確認する微量分光光度計を用いた RNA 濃度を決定します。</li>
	<li>
製造元の指示に従って逆のトランスクリプション キットを使用してサンプルの各合成 cDNA。20 μ L の全反応量のサンプルの各 RNA の 10 μ L を使用します。逆のトランスクリプション (たち実行) の完了時に 20 μ L を追加 H2O 各反応にします。
</li>
	<li>P10、P20 マイクロ ピペットを使用して cDNA を準備する 0.5 mL チューブにいくつかのコントロールのサンプル (10 μ L の合計のための 2 サンプルから例えば5 μ L) から mRNA をプールする標準的なカーブを作成します。<ol>
<li>10 μ L 2 x の逆転写酵素のマスターの組合せを追加します。</li>
		<li>逆のトランスクリプションの完了時に標準曲線の希釈系列で開始濃度 (「1」) となる反応管に H2O の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>10 倍希釈系列 (1 に 10-4) を実行するには、10-410-3、10-210-1に示される 4 つの 0.5 mL チューブに P100、P200 ピペットを用いた水の 45 μ L を追加します。<ol>
<li>P20 micropipettor、上下にピペッティングしてミックスを使用して、最初の管 (10-1) に「1」の開始の集中の 5 μ l 添加、数回、チューブに 10-1チューブから転送 5 μ L 指定 10-2とミックス。</li>
			<li>10-3を指定管に 10-2管から P20 マイクロ ピペットを使用して 5 μ L を転送し、ミックスします。10-4を指定管に 10-3チューブから P20 micropipettor を使用して 5 μ L を転送し、ミックスします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)
<ol><li>QPCR による相対定量の mRNA のレベルを決定します。実験セット内で「定量-相対標準曲線」と"TaqMan"化学を選択します。10 μ L を反応ボリュームの変更は、プレート レイアウト(例えば、ターゲット遺伝子、標準曲線、記者等)に関連情報を入力します。</li>
	<li>プライマー ・ プローブ測定の 0.5 μ L、遺伝子表現マスター ミックスの 5 μ L、H2O 2 μ L と 2.5 が含まれるように反応を準備 (10-100 ng) の cDNA の μ L。<ol>
<li>反応を標準曲線からのそれらを含めて各反応を実行する重複するいると、2 の余分な反応否定的なコントロールの数によって (cDNA) を除く上記の試薬をそれぞれ乗じてマスター ミックスを調製します。ピペッティングのバリエーション。</li>
		<li>ピペット 7.5 μ L ピペットやマルチ チャンネル ピペットの 96 ウェル リアクション プレートの前もって決定された井戸に準備のマスターの組合せの。ピペットの未知数および標準、適切な井戸に cDNA の 2.5 μ L と 2.5 μ L H2O 陰性対照の井戸に。</li>
		<li>様々 な分子時計遺伝子のプライマー ・ プローブの試金が含まれても、内因性制御 (例えば、β-アクチン) の試金。</li>
	</ol>
</li>
	<li>相対式の値を決定するために各複製の平均の相対的な量を計算し、各サンプルでは、 β-アクチンの平均の相対的な量によって標的遺伝子の平均の相対的な量を分割します。</li>
</ol>6. 統計解析
<ol><li>統計解析ソフトウェアを使用して、列統計情報オプションでプログラムにデータを入力します。Dunnett の事後テストと対照種緑化チャレンジ後時計遺伝子発現の平均値の違いを評価するために一方向の分散分析を選択します。</li>
</ol>

<ol><li>Bell-Pedersen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+from+multiple+oscillators%3A+lessons+from+diverse+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).</li>
<li>Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22483041">Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).</li>
<li>Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+shock+induces+circadian+gene+expression+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells.</a> Cell. 93, 929-937 (1998).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+Central+and+Peripheral+Circadian+Oscillators+in+Transgenic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+circadian+rhythms+in+mammalian+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms.</a> Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).</li>
<li>Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Clock+Proteins+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Circadian Clock Proteins and Immunity.</a> Immunity. 40, 178-186 (2014).</li>
<li>Keller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+clock+in+macrophages+controls+inflammatory+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+expression+of+clock+genes+in+mouse+macrophages%2C+dendritic+cells%2C+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells.</a> Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pattern-recognition+receptors+in+innate+immunity+update+on+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Publ.+Gr%22%5BJournal%5D)">The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors.</a> Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).</li>
<li>Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+responses+to+endotoxin+treatment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Circadian responses to endotoxin treatment in mice.</a> J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).</li>
<li>Okada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+LPS+Causes+Transient+Suppression+of+Biological+Clock+Genes+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats.</a> J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).</li>
<li>Haimovich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+endotoxin+synchronizes+and+suppresses+clock+gene+expression+in+human+peripheral+blood+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes.</a> Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).</li>
<li>Curtis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+innate+immunity+in+macrophages+by+miR-155+targeting+Bmal1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).</li>
<li>Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Circadian+Clock+Controls+Toll-like+Receptor+9-Mediated+Innate+and+Adaptive+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity.</a> Immunity. , (2012).</li>
<li>Gibbs, J. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22184247">The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines.</a> PNAS. 109, 582-587 (2012).</li>
<li>Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3654533/">Circadian rhythm abnormalities.</a> Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).</li>
<li>Bovbjerg, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+and+cancer%3A+sleep+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation.</a> Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).</li>
<li>Fu, L., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock%3A+pacemaker+and+tumour+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).</li>
<li>Germain, A., Kupfer, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18680211">CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION.</a> Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5158/basic-mouse-care-and-maintenance">Basic Mouse Care and Maintenance.</a> JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).</li>
<li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition.</a> AVMA. , (2013).</li>
<li>Silver, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-associated+molecular+patterns+alter+molecular+clock+gene+expression+in+mouse+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes.</a> PLoS One. , 12-15 (2017).</li>
<li>Silver, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844017321199">Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells.</a> Heliyon. , 00579(2018).</li>
<li>Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https//phenome.jax.org">https//phenome.jax.org</a> (2018).</li>
</ol>

著者は、何を開示します。

このプロトコルでは、定量化し、遺伝子の発現を決定する際に使用されている RNA の純度を評価する微量分光光度計を使用できます。核酸は 260 で紫外線を吸収する nm、蛋白質は通常 280 で光を吸収する nm、RNA 抽出プロシージャ (例えばフェノール) 中に使用される他の潜在的な汚染物質が 230 で検出可能な nm。したがって、吸光度 260/280 (、) の比を評価することにより nm (蛋白質に RNA) および 230/260 nm (非蛋白質の汚染物に RNA)、RNA の品質を評価することができます。高品質の RNA が蛋白質の汚染を示す低い比率として、1.8-2.1 の A260/280 比率。純粋な RNA サンプルでお越しの際にも 2.0 の A260/230 比。
ターゲット遺伝子 (すなわち、Per2, 時計, 試とDbp) の相対的な表現を決定する際、内因性制御遺伝子 (式のレベルはサンプル間違いはありません遺伝子) も選択する必要があります。ターゲット遺伝子の相対発現し、内因性制御遺伝子の発現に...

生理学および行動のほぼすべての側面の 24 h 振動を調整、哺乳類で、マスターのクロックは視床下部1,2の視交叉上核 (SCN) 内にあります。個体レベルでの生物学的プロセスを制御する、に加えてマスター時計はまた体3,4,5を通じて末梢細胞時計を同期します。コアは、期間(Per1 3)、クリプト(Cry1 2)、 Bmal1で構成されています一方、分子時計の機械は少なくとも 3 つの連動転写翻訳フィード バック ループから成っている、時計遺伝子6,7.コア分子時計の正確なタイミングを維持する以外にもいくつかの補助的な時計遺伝子産物 (例えば、試とDbp) はまた非時計遺伝子の発現を調節する、すなわち、時計被制御遺伝子 (CCGs)6,7。
機能分子時計は、様々 な免疫組織 (例えば、脾臓およびリンパ節)8と細胞 (例えば、 B 細胞、樹状細胞、マクロファージ)8,9に記載されています。これらの細胞は検出し、病原体関連分子パターン (PAMPs)、Toll 様受容体 (Tlr)10などの自然免疫認識受容体を介して、保存された微生物のコンポーネントに対応します。これまで、細菌の細胞壁構成成分、べん毛タンパク質は、微生物の核酸10など微生物の成分を認識する、13 の機能的な Tlr が記載されています。種緑化、リポ多糖 (LPS)、TLR4、によって認識されるグラム陰性菌の細胞壁の成分は、生物・分子レベルでの概日リズムを変更する示されています。たとえば、組合の生体内で挑戦の閃光のような位相遅延マウス11の活動によって測定されると SCN と肝臓の in situハイブリダイゼーションおよび量的な PCR によって決定される減らされた時計遺伝子発現につながったそれぞれのラットの12を実行します。組合の指定する生体内で挑戦後、ひと末梢血白血球13と皮下脂肪14の分析は、qPCR を介して測定としていくつかの時計遺伝子の発現の変化を明らかにしました。最後に、ヒトのマクロファージともにつながったマウス腹腔マクロファージの LPS 挑戦前のヴィヴォ時計式 qPCR14によって測定されるように変更。
ここでは、ODN1826 (を含む総合的なオリゴヌクレオチド非メチル化 CpG モチーフ)、PAMPs LPS の影響を評価するためのプロトコルについて述べると熱殺されたリステリア菌(HKLM)、TLR4、TLR9、TLR2、認識にそれぞれ、マウス脾細胞における分子時計遺伝子発現。マウス脾臓摘出術、卵白アルブミンの分離とチャレンジ、RNA 抽出、cDNA 合成、qPCR いくつか時計遺伝子の発現を評価するために、プロトコルが含まれます。このプロトコルは、非常に小さな動物に免疫細胞の数が多いのタイムリーな取得またはすることができますし、携帯電話の操作は前のヴィヴォ様々 な PAMPs と挑戦します。免疫応答8,15,16のさまざまな側面を調節する分子時計が示されている、したがって、分子時計の破壊の適切な時間に依存した変動損なう可能性が高く、免疫応答。さらに、概日リズムの混乱は深刻な病態17,18,,1920につながることができます、のでそれがあります脾細胞の広い範囲に挑戦する研究者にとっての分子時計への影響を評価します。

<table><tbody><tr><td>つや消しスライドフィ</td><td></td><td>ッシャー12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナーフィ</td><td>ッシャー</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 または 74106</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>大容量 cDNA 逆転写キット</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays b-actin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assays Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>qPCR machine StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96 ウェル反応プレート (0.1 mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>統計解析ソフトウェア</td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

時計遺伝子の発現に対する病原体関連分子パターンの影響を評価するためにマウスの脾細胞の使用

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

遺伝子発現への動作は、概日リズムは、生理学のほぼすべての側面を調節します。ここでは、病原体関連分子パターン (PAMPs) リポ多糖 (LPS)、ODN1826、熱殺されたリステリア菌とマウス脾細胞に挑戦し、概日リズムの分子の影響を検証する手法を提案します。時計。以前は、研究はさまざまなモデル (例えばマウス、ラットおよび人間) の品揃えから体内と体外のアプローチを使用して分子時計に LPS の影響を調べることに焦点を当てています。このプロトコルでは、分離と定量的 PCR によって時計遺伝子発現後挑戦を評価する方法論と同様に、脾細胞の挑戦をについて説明します。このアプローチは、だけでなく時計の表現を変えることができると同様に他の分子が、分子時計に微生物成分の影響を評価するために使用することができます。このアプローチは、時計式に影響を与える種緑化トール様受容体相互作用の分子機構をいじめる離れて利用できます。

マウスが ZT13 で犠牲になった、脾細胞が隔離され前のヴィヴォPAMPs LP、ODN1826、または HKLM に挑戦します。3 h 後 RNA が分離され、qPCR 比類のない制御の細胞と比較して試、 Dbp、 Per2時計分子時計遺伝子の相対発現レベルを評価するために使用されました。種緑化挑戦後、時計式レベルは制御の細胞 (図 1A) の式よりも大幅に異なるでした。Per2式有意に高値細胞の LPS と比類のないコントロール (図 1B) と比較した場合の ODN1826 に挑戦します。組合が試式を変更する唯一の種緑化 mrna いた比類のないコントロール (図 1<stron...

このプロトコルでは、マウスの脾細胞を使用して分子時計遺伝子発現を変更、病原体関連分子パターンを発見する手法について説明します。

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

この方法は、微生物成分が分子時計をどのように変化させるかなど、免疫学や時間生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実行が容易で、分子時計に対するさまざまな微生物成分の影響が評価され、再現性が高いことです。プロトコールを開始するには、RPMI 1640にウシ胎児血清を最終濃度10%まで添加して培地を調製し、リストされたPAMP培地を添加することにより、50ミリリットルのチューブで試験するPAMPSのそれぞれに対して10ミリリットルのチャレンジ培地を準備します。事前に準備したマウスの体幹に70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで拭きます。マウスを背中に置き、右側に少し傾けます。次に、マウスの左側、前足と後ろ足のほぼ中間に沿って解剖はさみを使用して毛皮を切り取ります。鉗子を使用して腹膜をつかみ、脾臓を傷つけずに慎重に切開します。鉗子で脾臓を取り出し、氷上に約10ミリリットルの培養培地が入った滅菌50ミリリットルのチューブに入れます。次に、2ミリリットルの培地で脾臓を小さな滅菌ペトリ皿に移します。脾臓を均質化し、2つの滅菌つや消しスライドのつや消し部分の間で脾臓を粉砕します。完全に均質化したら、脾細胞を含む2ミリリットルの培養培地を40ミクロンのナイロン細胞ストレーナーを介して50ミリリットルのチューブにピペットで移します。脾細胞を含む50ミリリットルのチューブのそれぞれに8ミリリットルの冷温培地を加え、チューブあたり総量10ミリリットルにします。血球計算盤を使用してミリリットルあたりの細胞数を決定します。1ウェルあたり6番目の細胞に約10倍の1倍を6ウェル培養プレートに加えます。細胞を添加した後、細胞に3ミリリットルの培地または3ミリリットルのチャレンジ培地を加えます。次に、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。P1000マイクロピペットに取り付けられた1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、ウェルの底から細胞をこすり落とします。同じピペットチップで、細胞を含む培地を15ミリリットルのチューブに移します。細胞を167倍gで室温で5分間ペレット化します。上清を取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルのPBSで洗浄します。細胞を167倍gで5分間2回目にペレット化した後、上清を除去し、細胞ペレットに600マイクロリットルの溶解緩衝液を添加します。製造元の指示に従って、RNA抽出キットを使用して脾細胞からRNAを単離し、オプションのオンカラムDNA消化を実行します。メーカーの指示に従って、逆転写キットを使用して各サンプルのcDNAを合成します。総反応量20マイクロリットルの試料ごとに10マイクロリットルのRNAを使用してください。いくつかのコントロールサンプルからmRNAを0.5ミリリットルのチューブに引き込み、定量PCRを行う際の標準曲線に使用するcDNAを調製します。10マイクロリットルの2X逆転写酵素マスターミックスを加えます。逆転写が完了したら、反応チューブに10マイクロリットルの水を加えます。これは、標準曲線の希釈系列の開始濃度として機能します。マイナス1に10、マイナス2に10、マイナス3に10、マイナス4に10と指定された4本の0.5ミリリットルのチューブに45マイクロリットルの水を加えて、10倍希釈シリーズを実行します。P20マイクロピペッターを使用して、開始濃度の1マイクロリットルを5マイクロリットルを2番目のチューブに、マイナス1に10マイクロリットルを追加します。数回ピペッティングで上下させて混合し、10からマイナス1のチューブまで5マイクロリットルを10からマイナス2のチューブに移して混合します。P20マイクロピペットを使用して5マイクロリットルを10からマイナス2のチューブからマイナス3の10に指定されたチューブに移し、混合します。最後に、P20マイクロピペッターを使用して、10からマイナス3のチューブからマイナス4の10と指定されたチューブに5マイクロリットルを移し、混合します。0.5マイクロリットルのプライマープローブアッセイ、5マイクロリットルの遺伝子発現マスターミックス、2マイクロリットルの水、および2.5マイクロリットルのcDNAを含むように反応を調製します。RNAサンプルを96ウェルqPCRプレートにピペットで移します。さまざまな分子時計遺伝子のプライマープローブアッセイをインキュベートし、内在性コントロールのアッセイを含め、それをqPCRマシンにロードしてmRNAレベルの相対定量を決定します。実験セットアップ内で、定量、相対標準曲線、TaqMan ケミストリーを選択します。次に、反応量を10マイクロリットルに変更します。プレートレイアウトに関連情報を入力します。単離されたRNAに対してqPCRを行い、分子時計遺伝子、clock、Per2、Dbp、およびRev-erb alphaの相対発現レベルを評価しました。PAMPチャレンジ後、クロック発現レベルは対照細胞と比較して有意差はありませんでした。Per2の発現レベルは、LPSおよびODN1826をチャレンジした細胞で、チャレンジしていないコントロールと比較して有意に上昇しました。LPSは、Rev-erb αの発現を変化させた唯一のPAMPであり、mRNAレベルはチャレンジされていないコントロールよりも有意に低かった。対照群と比較した場合、各PAMPのチャレンジ後のDbpでは、mRNAレベルが有意に低いことが観察されました。この手順に続いて、PAMP以外の分子を使用して、脾細胞の分子時計への影響を評価できます。

the-use-mouse-splenocytes-to-assess-pathogen-associated-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

出典: Mendspacher, J. H. および Fessler, M. B.マウスにおける実験的な細菌性肺炎の誘導および表現型解析のための非侵襲的かつ技術的に非集中的な方法です。 J. Vis. Exp.

感染研究のためのマウス脾臓における細菌負荷の評価

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

bm12リンパ球のC57BL/6レシピエントへの移植は、全身性エリテマトーデスの確立されたモデルです。ここでは、このモデルを使用して疾患を開始する方法と、フローサイトメトリーによってT濾胞ヘルパー細胞、胚中心B細胞、および形質細胞を特徴付ける方法について説明します。...

C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル

ここでは、ヒト膵島細胞と初代筋管の概日生物発光と分泌活性を並行して監視するための設定について説明します。このために、ルシフェラーゼコアクロックレポーターのレンチウイルス遺伝子導入を採用し、続いてin...

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer...

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

この新しく開発された蛍光ベースの技術は、リアルタイムで、高時間分解能でマウスを自由に移動を視交叉上核 (SCN)...

生体内で蛍光レポーターを使用してマウス視交叉上核における時計遺伝子発現のモニタリング

MALT1 免疫を調節するが、不明確のままどのようにこれが発生します。MALT1 の生得的なシグナリング Toll 様や C 型レクチン様受容体、MALT1 が骨髄性サイトカインの生産を調節することを示すの下流と下流への貢献を解明する選択的 MALT1 paracaspase 阻害剤 MLT 827 を使いました。C...

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

ここでは、マウス二次リンパ球器官におけるサイトカインインターフェロンガンマを分泌する細胞の局在化を可視化する簡単な共焦点イメージング法について述べた。このプロトコルは、多様な組織における他のサイトカインの可視化のために拡張することができる。...

リステリア単球遺伝子感染症後のマウス脾臓におけるインシチュインターフェロンガンマ産生のイメージング

学ぶマウス脾細胞を用いた時計遺伝子発現への病原体関連分子パターンの影響評価法。免疫学と概日生物学の研究において、微生物成分が分子時計に与える作用を解析する再現性の高い手法です。

時計遺伝子の発現に対する病原体関連分子パターンの影響を評価するためにマウスの脾細胞の使用

さらに動画を探す