時計遺伝子の発現に対する病原体関連分子パターンの影響を評価するためにマウスの脾細胞の使用

この方法は、微生物成分が分子時計をどのように変化させるかなど、免疫学や時間生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実行が容易で、分子時計に対するさまざまな微生物成分の影響が評価され、再現性が高いことです。プロトコールを開始するには、RPMI 1640にウシ胎児血清を最終濃度10%まで添加して培地を調製し、リストされたPAMP培地を添加することにより、50ミリリットルのチューブで試験するPAMPSのそれぞれに対して10ミリリットルのチャレンジ培地を準備します。

事前に準備したマウスの体幹に70%エタノールをスプレーし、ペーパータオルで拭きます。マウスを背中に置き、右側に少し傾けます。次に、マウスの左側、前足と後ろ足のほぼ中間に沿って解剖はさみを使用して毛皮を切り取ります。

鉗子を使用して腹膜をつかみ、脾臓を傷つけずに慎重に切開します。鉗子で脾臓を取り出し、氷上に約10ミリリットルの培養培地が入った滅菌50ミリリットルのチューブに入れます。次に、2ミリリットルの培地で脾臓を小さな滅菌ペトリ皿に移します。

脾臓を均質化し、2つの滅菌つや消しスライドのつや消し部分の間で脾臓を粉砕します。完全に均質化したら、脾細胞を含む2ミリリットルの培養培地を40ミクロンのナイロン細胞ストレーナーを介して50ミリリットルのチューブにピペットで移します。脾細胞を含む50ミリリットルのチューブのそれぞれに8ミリリットルの冷温培地を加え、チューブあたり総量10ミリリットルにします。

血球計算盤を使用してミリリットルあたりの細胞数を決定します。1ウェルあたり6番目の細胞に約10倍の1倍を6ウェル培養プレートに加えます。細胞を添加した後、細胞に3ミリリットルの培地または3ミリリットルのチャレンジ培地を加えます。

次に、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で3時間インキュベートします。P1000マイクロピペットに取り付けられた1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、ウェルの底から細胞をこすり落とします。同じピペットチップで、細胞を含む培地を15ミリリットルのチューブに移します。

細胞を167倍gで室温で5分間ペレット化します。上清を取り除き、細胞ペレットを5ミリリットルのPBSで洗浄します。細胞を167倍gで5分間2回目にペレット化した後、上清を除去し、細胞ペレットに600マイクロリットルの溶解緩衝液を添加します。

製造元の指示に従って、RNA抽出キットを使用して脾細胞からRNAを単離し、オプションのオンカラムDNA消化を実行します。メーカーの指示に従って、逆転写キットを使用して各サンプルのcDNAを合成します。総反応量20マイクロリットルの試料ごとに10マイクロリットルのRNAを使用してください。

いくつかのコントロールサンプルからmRNAを0.5ミリリットルのチューブに引き込み、定量PCRを行う際の標準曲線に使用するcDNAを調製します。10マイクロリットルの2X逆転写酵素マスターミックスを加えます。逆転写が完了したら、反応チューブに10マイクロリットルの水を加えます。これは、標準曲線の希釈系列の開始濃度として機能します。

マイナス1に10、マイナス2に10、マイナス3に10、マイナス4に10と指定された4本の0.5ミリリットルのチューブに45マイクロリットルの水を加えて、10倍希釈シリーズを実行します。P20マイクロピペッターを使用して、開始濃度の1マイクロリットルを5マイクロリットルを2番目のチューブに、マイナス1に10マイクロリットルを追加します。数回ピペッティングで上下させて混合し、10からマイナス1のチューブまで5マイクロリットルを10からマイナス2のチューブに移して混合します。

P20マイクロピペットを使用して5マイクロリットルを10からマイナス2のチューブからマイナス3の10に指定されたチューブに移し、混合します。最後に、P20マイクロピペッターを使用して、10からマイナス3のチューブからマイナス4の10と指定されたチューブに5マイクロリットルを移し、混合します。0.5マイクロリットルのプライマープローブアッセイ、5マイクロリットルの遺伝子発現マスターミックス、2マイクロリットルの水、および2.5マイクロリットルのcDNAを含むように反応を調製します。

RNAサンプルを96ウェルqPCRプレートにピペットで移します。さまざまな分子時計遺伝子のプライマープローブアッセイをインキュベートし、内在性コントロールのアッセイを含め、それをqPCRマシンにロードしてmRNAレベルの相対定量を決定します。実験セットアップ内で、定量、相対標準曲線、TaqMan ケミストリーを選択します。

次に、反応量を10マイクロリットルに変更します。プレートレイアウトに関連情報を入力します。単離されたRNAに対してqPCRを行い、分子時計遺伝子、clock、Per2、Dbp、およびRev-erb alphaの相対発現レベルを評価しました。

PAMPチャレンジ後、クロック発現レベルは対照細胞と比較して有意差はありませんでした。Per2の発現レベルは、LPSおよびODN1826をチャレンジした細胞で、チャレンジしていないコントロールと比較して有意に上昇しました。LPSは、Rev-erb αの発現を変化させた唯一のPAMPであり、mRNAレベルはチャレンジされていないコントロールよりも有意に低かった。

対照群と比較した場合、各PAMPのチャレンジ後のDbpでは、mRNAレベルが有意に低いことが観察されました。この手順に続いて、PAMP以外の分子を使用して、脾細胞の分子時計への影響を評価できます。