ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

この方法は、生物医学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、ゼブラフィッシュを使って病気の遺伝子モデルを生成することなどです。この手法の主な利点は、シンプルなハイスループット法を使用して遺伝子型を早期に同定できることです。

この方法は、遺伝性てんかんのゼブラフィッシュモデルを用いた広範な研究を可能にするだけでなく、他の遺伝病モデルやあらゆるタイプの突然変異研究にも適用することができます。一般に、この方法に不慣れな個体は、幼虫のヒレの切断を尾の色素ギャップ内で正確に行わなければならないため、困難を抱える可能性があります。ゼブラフィッシュの幼生のヒレのクリッピングを開始する前に、解剖面を準備します。

9cmのシャーレ蓋の内面にオートクレーブテープをテープで貼り付け、実体顕微鏡で蓋を固定します。3 dpfの幼虫を最小限のストレスで収容するためのP1000ピペットチップを準備するには、ピペットチップの端を直径2mmに切り取ります。受精後3〜5日、またはdpf、ゼブラフィッシュの幼生をペトリ皿に入れ、1x E3胚培地に1.5ミリモルトリカインを麻酔します。

改造したP1000マイクロピペットを使用して、ゼブラフィッシュの幼生をピックアップして麻酔し、ペトリ皿の蓋に配置されたオートクレーブテープに置きます。幼虫を取り巻く余分なトリカイン溶液を取り除きます。その領域は、ひれをうまく切片にして拾うためにできるだけ乾燥している必要がありますが、生存を確保するためにはまだ濡れている必要があります。

出血を防ぎ、ヒレのクリッピング中に幼虫の生存を確保するために、切断は色素ギャップ内で発生する必要があります。この画像に示すように、血液循環の限界まで遠位。実体顕微鏡下で作業し、マイクロメスを使用して尾びれを切片にします。

切開中は、脊索の損傷を避けるために、安定して、しかし穏やかに下向きに圧力をかけます。切片化されたフィンを顕微鏡で視覚化し、マイクロメスブレードの先端の上にピースを配置します。フィンが入ったマイクロメスを小さな濾紙の表面に置きます。

切除された組織にメラノサイトが存在するため、ひれは小さな黒い斑点として現れます。DNA抽出を成功させるためには、プロトコールを続行する前に、フィンの配置を示す黒い点が濾紙上に観察されることが重要です。ハサミとピンセットを使用して、フィンを含む濾紙を、25マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウム溶液を含む96ウェルPCRプレートのウェルに移します。

次に、平底の96ウェル組織培養プレートを調製し、PCRプレートのラベルに従ってウェルに番号を付けます。200マイクロリットルの新鮮なe3胚培地を充填した改造されたP1000ピペットを使用して、穏やかな圧力でゼブラフィッシュの幼生を慎重に収集します。PCRプレートと同じウェル番号の96ウェルプレートに幼虫を分注します。

フィンを含む濾紙が溶液にしっかりと沈んでいることを確認してください。各カット間のクロスコンタミネーションを防ぐために、マイクロメスの刃とピンセットを70%エタノール溶液に浸して清掃します。清潔なペーパーティッシュでブレードを拭くか、拭きます。

すべての幼虫をクリップしたら、遺伝子型が特定されるまで、幼虫を摂氏28度の96ウェルプレートに保存します。この手順を開始するには、フィンピースを含む96ウェルPCRプレートをシールし、サンプルをGの1000倍で1分間遠心分離します。すべての濾紙が水酸化ナトリウム溶液に浸されていることを確認するため。

組織溶解には、サーマルサイクラーでサンプルを摂氏95度で5分間加熱します。その後、摂氏4度まで10分間冷却します。次に、各サンプルに 6 マイクロリットルの 500 ミリモル tris-HCL pH8.0 を加えます。

サンプルをボルテックスします。プレートをGの1500倍にして室温で5分間短時間遠心分離します。この方法を用いてゲノムDNAを抽出するには、前に示したようにフィンをクリップしますが、クリップしたフィンの付いた濾紙を、30マイクロリットルの5%キレート樹脂を含む96ウェルPCRプレートのウェルに加えます。

すべてのフィンピースをクリップした後、96ウェルPCRプレートをシールし、サンプルを短時間遠心分離して、すべてのフィルターペーパーがキレート樹脂に浸されていることを確認します。サーマルサイクラーでサンプルを摂氏95度で15分間加熱し、続いて摂氏4度まで10分間冷却します。サンプルを短時間遠心分離して樹脂ビーズをペレット化し、懸濁液中のDNAを取得します。

マルチプレックスPCRアッセイにより、ホモ接合型変異体、ヘテロ接合体、および野生型幼虫の識別が可能になります。テキストプロトコルに詳述されているように、PCR反応を設定します。PCR反応は96ウェルサーマルサイクラーで行ってください。

ホウ酸ナトリウム緩衝液中の1%アガロースゲルを調製し、1xゲルレッドで染色します。このプロセスを容易にするために、可能であれば、マルチチャンネルピペットと互換性のあるゲルシステムを使用して、サンプルのロード時間を短縮することでより高いスループット能力を実現します。ゲルを1xホウ酸ナトリウム緩衝液中で250ボルトで15分間泳動します。

紫外線下でゲルを画像化し、異なる遺伝子型を識別できるようにします。このアッセイを開始するには、テキストプロトコルに記載されているように、1.5 mmスペーサープレートと15サンプルコームを使用して、2つの12%ポリアクリルアミドゲルを調製します。縦型電気泳動システムと1x TBEバッファーをランニングバッファーとして使用します。

テキストプロトコルに記載されているようにPCRを実施した後、PCR産物を摂氏94度で5分間加熱し、続いて摂氏4度で10分間冷却します。PCRサンプルあたり10マイクロリットル、および分子量マーカーの8マイクロリットルをロードします。ゲルを150ボルトで1時間、または分子量マーカーがガラスプレートのフットラインにほぼ到達するまで泳がせます。

紫外線下でゲルを画像化し、異なる遺伝子型を識別できるようにします。このプロトコルは、ヘテロ接合性交配の子孫の遺伝子型決定に使用され、変異体回腸はaldh7a1遺伝子の最初のコーティングエクソンに5塩基対の挿入を持っています。野生型と変異型の両方の回腸のPCR増幅から期待される結果は、434 BPアンプリコンです。

293 BPバンドは変異型回腸の増幅から生じ、野生型回腸では195 BPバンドが得られます。1%アガロースホウ酸ナトリウムゲルでのPCR反応の解析により、レーン2および6の野生型遺伝子型、レーン3、4、および5のヘテロ接合型遺伝子型、およびレーン1のホモ接合型変異体遺伝子型が同定されました。ヘテロ二本鎖融解アッセイによって遺伝子型決定された種々の変異。

plpbp遺伝子のplpbpot101およびplpbpot102変異体回腸は、それぞれフレームシフトおよび早期停止コドンにさせました。変性およびアニーリング後、ヘテロ接合動物のPCRフラグメントには、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して容易に分離および視覚化できるヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖DNAが含まれます。化合物ヘテロ接合型変異体遺伝子型はレーン2、4、および8で同定され、ヘテロ接合型遺伝子型はレーン3、6、7、9、および10で同定され、野生型遺伝子型はレーン5で同定されました。

一度習得すると、この技術を使用して96匹の幼虫をヒレにクリッピングすることは、適切に実行すれば1時間未満で行うことができます。この手順に続いて、組織抽出のための同じ遺伝子型のゼブラフィッシュの幼生のプールなどの他の方法を実行し、バイオマーカー調査や疾患モデルなどの追加の質問に答えるために注文することができます。開発後、この技術は、ゼブラフィッシュの疾患経路生理学を探求するための代謝性てんかんのモデルの分野での研究への道を開きました。

このビデオを見た後、尾びれの顕微鏡解剖によって生後3日齢のゼブラフィッシュの幼虫を適切に遺伝子型決定する方法をよく理解しているはずです。