マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング
September 5th, 2018
ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。
この方法は、新皮質の構造と機能の分析など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、脳内の大規模な三次元構造を明らかにすることができることです。この方法は新皮質についての洞察を提供することができますが、脊髄などの他の神経系にも適用できます。
トレーサーを成体マウスの橋に注入するには、まず蛍光標識されたコレラ毒素サブユニットBの1マイクロリットルを26ゲージのハミルトン注射器に引き込みます。.シリンジにインジェクターポンプを置き、次にシリンジとポンプを定位固定装置のマニピュレーターのツールホルダーに置きます。マニピュレータを垂直軸から後方に12度傾けます。
その後、マウスを定位固定装置の上に置きます。カミソリの刃を使って毛を取り除き、感染を防ぎます。次に、頭皮の10ミリメートルをカットして、ブレグマとラムダが見えるようにします。
ピペットを使用して0.1ミリリットルの1%リドカインを投与します。脳定位固定装置のマウスピースの垂直位置を調整して、ブレグマとラムダのZレベルが同じになるようにヘッドの角度を設定します。次に、マニピュレーターを脳定位固定装置にスライドさせて位置を調整し、シリンジの先端がブレグマに近づくようにします。
マニピュレータの位置を記録します。マニピュレーターのツールホルダーを動かして、シリンジを引っ込めます。続いて、マニピュレータを後方に5.4ミリメートル、横方向に0.4ミリメートル動かします。
先端が頭蓋骨のエントリーポイントに近づくようにシリンジを進めてから、シリンジを引っ込めてエントリーポイントに印を付けます。マークされた位置に、直径約1ミリメートルの穴を開けます。シリンジの先端を穴に通し、先端の深さがブレグマで測定された深さより6.9ミリメートル大きくなるようにします。
次に、ポンプを使用して1マイクロリットルのトレーサーを毎分0.2マイクロリットルで注入します。注射後、シリンジを脳から取り出します。必要に応じて、露出した脳を微小原線維止血剤の小さな断片と瞬間接着剤で覆います。
露出した脳を生理食塩水で拭いて感染を防ぎ、頭皮を縫合します。次に、マウスを脳定位固定装置から取り外します。マウスが摂氏30度のインキュベーターで麻酔から約1時間回復するのを待ちます。
マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。マウスが完全に回復したら、マウスを他の動物の会社に戻します。脳組織を採取するには、ハサミで頭皮を切って頭蓋骨を露出させます。
次に、露出した頭蓋骨の正中線をハサミで切ります。次に、鉗子を使用して頭蓋骨を取り除きます。ブレグマとラムダの位置をマークする必要がある場合は、まず頭蓋骨の片側を取り外してください。
次に、細いタングステン針を脳のブレグマとラムダの位置に挿入し、残りの頭蓋骨を取り除きます。続いて、脳サンプルをビブラトームプラットフォームに置きます。厚さ500マイクロメートルまでの切片をPBSで室温で切断します。
この手順では、スライスを4ミリリットルのスケールS0溶液が入った5ミリリットルのプラスチックチューブに移します。次に、摂氏37度で穏やかに振とうしながら12時間インキュベートします。12時間後、ピペットを使用してチューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールA2溶液を追加します。
スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら36時間インキュベートします。36時間後、チューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールB4溶液を追加します。スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら24時間インキュベートします。
24時間後、チューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールA2溶液を追加します。スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら12時間インキュベートします。12時間後、チューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのPBSを追加します。
スライスを室温で穏やかに振とうしながら6時間インキュベートします。その後、スライスを2ミリリットルのプラスチックチューブに慎重に取り出します。一次抗体と1ミリリットルのABスケール溶液中で、摂氏37度で48〜72時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
その後、スライスを5ミリリットルのプラスチックチューブに慎重に取り出します。それらを4ミリリットルのABスケール溶液で2時間、室温で2回、穏やかに振とうしながらインキュベートします。その後、スライスを2ミリリットルのプラスチックチューブに慎重に取り出します。
蛍光標識した二次抗体を1ミリリットルのABスケール溶液中で、摂氏37度で48時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。4ミリリットルの抗体スケール溶液が入った5ミリリットルのプラスチックチューブにスライスを慎重に取り出し、室温で穏やかに振とうしながら6時間インキュベートします。溶液を取り出し、4ミリリットルのABスケール溶液を加え、室温で穏やかに振とうしながらスライスを2時間2回インキュベー
トします。次に、溶液を取り出し、4ミリリットルの4%PFAを加え、室温で穏やかに振とうしながらスライスを1時間インキュベートします。次に、溶液を取り出し、4ミリリットルのPBSを加え、室温で穏やかに振とうしながらスライスを1時間インキュベートします。溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールS4溶液を加え、スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら12時間インキュベートします。
続いて、スペーサーをスライドガラスの上に置き、スライスをスペーサーに置き、スライスをスケールS4溶液に浸します。スペーサーをカバーガラスで密封します。カバーガラスに水を入れ、共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡と水浸長時間対物レンズを使用してスライスを画像化します。
本研究では、Tlx3-cre AI9トランスジェニックマウスのtdTomato発現により皮質投射ニューロンを緑色で標識し、7週齢で逆行性トレーサーCTB488を橋に注入することにより、マゼンタの脳下投射ニューロンを可視化した。これは、皮質領域のおおよその位置を示すトップビューです。これは、大脳下投射ニューロンを示すCTB488蛍光と皮質投射ニューロンを示すtdTomato蛍光の斜め図であり、これはマージされた画像です。
2つの細胞タイプの細胞体は、脳の広範囲にわたって見え、光学切片は周期的なマイクロカラムを示しました。この画像は、Crym-eGFPマウスの光学切片におけるeGFP発現脳下投射ニューロンの細胞体と頂端樹状突起を示し、この画像は、抗体スケール法によりC57 Black 6マウスの橋にCTB488を注入することにより、緑色で標識されたパルブアルブミン発現細胞とマゼンタで標識された大脳下投射ニューロンを示しています。この手順に続いて、脳組織の定量的特性評価などの追加の質問に答えるために、3D画像処理などの他の方法を実行できます。
その開発後、この技術は、皮質生物学の分野の研究者がマウスの脳における新しいモジュラー組織を探求する道を開きました。
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概要
この研究は、マウスの脳組織のティッシュクリアリング、蛍光マーキング、および大規模イメージングの詳細なプロトコルを概説しています。この方法により、研究者は新皮質の細胞タイプの三次元構造を視覚化でき、その構造と機能に関する貴重な洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 組織イメージング
- 蛍光マーキング
背景
- 新皮質の構造と機能は神経科学において基本的なものです。
- 細胞組織の理解は主要な研究課題に対処するのに役立ちます。
- この技術は脊髄などの他の神経系領域に拡張できます。
研究目的
- 脳構造の向上した視覚化のための方法論を開発すること。
- 新皮質内の細胞タイプの組織を調査すること。
- より広範な神経系研究に適用可能な枠組みを提供すること。
使用された方法
- 共焦点または二光子顕微鏡を用いた大規模イメージング。
- 使用されるモデルには成体マウスと延髄などの特定の脳領域が含まれます。
- プロトコルはトレーサー注入と組織準備の手順の詳細を示しています。
- Scale S0、A2、B4などの溶液でインキュベーションや蛍光抗体の使用が重要なステップでした。
主要な結果
- この方法は、マウスの脳組織における大規模な三次元構造を明らかにします。
- 皮質投射ニューロンや他の細胞タイプの特定のマーキングが達成されました。
結論
- この研究は、ニューロンの組織を視覚化する堅牢な方法を示しています。
- この発見は、新皮質の構造とその機能の理解に大きく貢献しています。
- この方法論は、神経科学研究の多様な応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
