Name: マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぶマウス大脳皮質の細胞組織を可視化する組織透明化と蛍光標識を用いた大規模三次元イメージング法。この手法は神経細胞の構造と機能を詳細に解析し、神経科学研究に広く応用可能です。

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ありがとう宮脇敦史・洋浜 AbScale 実験に彼らのアドバイスは、原稿の編集のためのチャールズ ・横山恵理子大島とその技術支援のみゆき岸野。この仕事は科学研究省の教育、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省) 日本の倫理学に理化学研究所から研究資金倫理学と補助金によって支えられた (革新的なエリア「メゾスコ ピック Neurocircuitry」; 22115004) とS. S. (25890023)。

すべて実験プロシージャ理化学研究所和光動物実験委員会と理化学研究所遺伝子組換え実験安全委員会によって承認され、理化学研究所脳科学の動物施設の制度のガイドラインに従って実行研究所。
1. イメージング室の準備
<ol><li>
イメージング室19
	<ol>
<li>シリコーンゴム シートを使用して、様々 な厚さの約 5 mm ・床版の厚さの商工会議所を準備します。また、シャーレ、ガラスの下部 (図 1 a) を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スペーサーをスライスします。
	<ol>
<li>シリコーンゴム シートの厚さ 0.5 mm (図 1) を用いたサンプルを保持するスペーサーを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. トレーサー注入法
メモ: は、ポンス (2.1) または丘 (2.2) に注射をください。丘へ注入しながら、視覚と運動の領域を含む広い脳領域のポンス ラベル サブ大脳投射ニューロンへの注入は、視覚野でサブ大脳投射ニューロンをラベル付けします。制御実験用蛍光標識したコレラ毒素サブユニット b. の代わりに生理食塩水を注入します。無菌状態の維持のため、プラスチックの手袋をエタノールで洗浄と滅菌装置を使用します。
<ol><li>
成体マウスの橋に注射をします。
	<ol>
<li>蛍光標識したコレラ毒素サブユニット B の 1 μ L を描画 (25 μ g/μ L の PBS) 26 G ハミルトン注射器に。</li>
		<li>注射器で噴射ポンプを配置します。</li>
		<li>脳定位固定装置にマニピュレーターのツール ホルダーに注射器やポンプを配置します。マニピュレーター 12 ° 垂直軸から後方に傾けます。</li>
		<li>ペントバルビ タール ナトリウムを腹腔内に注入することによって (c57bl/6 j またはTlx3-cre/Ai9) オスかメスの成体マウスの麻酔 (60 mg/kg 体重) やイソフルラン (2-3%) を投与することによって。しっぽはマウスは完全に麻酔したことを示す、ピンセットでつままれてマウスの応答がないを待ちます。</li>
		<li>脳定位固定装置にマウスを配置します。</li>
		<li>感染症を防ぎ、頭皮の 10 mm を切る前とラムダが表示されるようにかみそりの刃を使用して髪を慎重に取り外します。ピペットを使用して 1% リドカインの 0.1 mL を管理します。前とラムダ、同じ z レベルできるように脳定位固定装置のマウスピースの垂直位置を調整することで頭の角度を設定します。</li>
		<li>注射器の先端に近い前、脳定位固定装置にそれをスライドさせて、マニピュレーターの位置を調整し、マニピュレーターの位置を記録します。マニピュレーターのツール ホルダーを動かすことによって、注射器を撤回します。</li>
		<li>移動マニピュレーター 5.4 mm 後方と 0.4 mm 横。先端が頭蓋骨にエントリ ポイントの近くにあるように注射器を進めます。注射器を撤回し、エントリ ポイントをマークします。</li>
		<li>マークの位置に直径約 1 mm の穴をドリルします。</li>
		<li>ヒント深さは 6.9 mm 前で測定するよりも、穴からシリンジの先端を挿入します。</li>
		<li>トレーサーの 0.2 μ L/分でポンプを使用の 1 μ L を注入します。</li>
		<li>脳から注射器を削除します。</li>
		<li>必要に応じて、微繊維性止血と瞬間接着剤の小さな断片と露出した脳をカバーします。</li>
		<li>感染症を防ぐために、頭皮を縫合ピペット付属生理食塩水を使用して露出した脳をすすいでください。</li>
		<li>脳定位固定装置から、マウスを削除します。通常は 1 h で 30 ° C でインキュベーターで麻酔から回復するマウスを許可します。放置しないでください、マウスまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。それは完全に回復した後マウスを他の動物の会社に戻ります。</li>
		<li>3-7 日のマウスを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
成体マウスの上の丘に注射をします。
	<ol>
<li>先端直径 30-50 μ m のガラス ピペットを準備します。</li>
		<li>ガラス ピペットをプラスチック管 (図 2 a) ハミルトン注射器に接続します。</li>
		<li>パラフィン液体ガラス ピペット、プラスチック製のチューブ、およびハミルトンの注射器を入力します。</li>
		<li>注射器で噴射ポンプを配置します。</li>
		<li>マニピュレーターをガラス ピペットを置き、マニピュレーター 60 ° 垂直軸 (図 2 b) から後方に傾けます。</li>
		<li>2.1.4–2.1.9 を実行します。マニピュレーターの位置は、1.4 mm 後方に,、ラムダの外側 0.5 ミリメートルです。</li>
		<li>頭蓋骨に小さなプラスチック パラフィン フィルムを配置し、トレーサー溶液の約 1 μ L をつけます。すぐにガラス ピペットを進めるし、トレーサー溶液の少なくとも 0.5 μ L でそれを埋めます。</li>
		<li>ヒント深さは脳の表面から 3.0 mm、ガラス ピペットを挿入します。</li>
		<li>0.2 μ l/min のポンプを使用してトレーサーの 0.5 μ L を注入します。</li>
		<li>ガラス ピペットを脳から削除します。</li>
		<li>2.1.13–2.1.16 を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 固定・ トリミング
<ol><li>注入ペントバルビ タール ナトリウム (60 mg/kg 体重) 腹腔マウス (c57bl/6 j またはTlx3-cre/Ai9、手順 2 で説明したトレーサー注入の有無。しっぽはマウスは完全に麻酔したことを示す、ピンセットでつままれてマウスの応答がないを待ちます。</li>
	<li>マウスをマウス transcardially20 0.9% 生理食塩水を灌によって人道的に安楽死させます。</li>
	<li>灌によってマウス20を修正 0.1 M リン酸緩衝液 (7.5) で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)。</li>
	<li>
はさみのペアを使用して記述されている20として頭蓋骨を公開する頭皮をカットします。
	<ol>
<li>はさみのペアを使用して公開されているスカルの正中線をカットします。頭蓋骨鉗子を使用してを削除します。</li>
		<li>前とラムダの位置をマーキングが必要な場合は、まず頭蓋骨の 1 つの半球を削除します。前と頭蓋骨、脳に残りのラムダの位置で脳に細いタングステン針を挿入し、残りの頭蓋骨を削除します。 注: 脳は、4 ° C で PBS で格納することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗体の抑制的なニューロンの汚損を実行するためには、スライスに脳サンプルをカットします。
	<ol>
<li>Vibratome に脳サンプルを配置します。</li>
		<li>室温で PBS で厚 500 μ m までのスライスを切り 5 (AbScale 法) の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>抗体染色が必要な場合はトリムに脳サンプル ブロック (3 mm 厚) かみそりの刃 (図 3) を使用して、手順 4 (SeeDB メソッド) に進みます。 注: 脳に格納できる PBS 4 ° C でカットまたはトリミング後。抗体の汚損が必要ない場合 AbScale 法よりも時間が必要なために、SeeDB メソッドをお勧めします。</li>
</ol>4. 抗体染色 (SeeDB 法) なしクリア
<ol><li>0.5% α-チオグリセ 20 mL、20% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。</li>
	<li>0.5% α-チオグリセ 20 mL、40% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。</li>
	<li>0.5% α-チオグリセ 20 mL、60% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 4 時間インキュベートします。</li>
	<li>0.5% α-チオグリセ 20 mL、80% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 12 時間インキュベートします。</li>
	<li>0.5% α-チオグリセ 20 mL、100% (w/v)、果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 12 時間インキュベートします。</li>
	<li>0.5% α-チオグリセ 20 mL、80.2% (w/w) 果糖を含む 50 mL プラスチック チューブにヘラを使用してサンプルを転送し、室温で穏やかな揺れで 24 時間インキュベートします。 注: は、慎重に変形を可能な限り小さく維持するサンプルを処理します。サンプルはすぐに不透明になることが示されるより長いサンプルを孵化しないで。</li>
	<li>80.2% 果糖液 (図 1 b) でいっぱい撮像室にサンプルを埋め込みます。必要に応じて、周辺ゴム接着剤の小さなピースを置くことによってサンプルを修正します。商工会議所が深すぎる場合は、サンプルを配置する前に商工会議所のフロア プレートを置きます。</li>
	<li>イメージングの商工会議所にガラスカバー付きシャーレを置き、皿と水浸漬の目的距離の長い作業と共焦点または 2 光子顕微鏡を用いた画像に水を入れます。励起波長と放出フィルターは、表 1のとおりです。必要に応じて、電動ステージを使用します。</li>
</ol>5. 抗体染色 (AbScale 法) をクリア
<ol><li>表 2に説明されているように、試薬を準備します。</li>
	<li>Sca/es 0 溶液 4 mL を含む 5 mL プラスチック チューブにヘラを使用してスライスを転送し、37 ° c (図 4 b) 穏やかな揺れで 12 時間のそれらを孵化させなさい。</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eA2 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 36 h のスライスを孵化させなさい</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eB4 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 24 h のスライスを孵化させなさい</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eA2 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 12 h のスライスを孵化させなさい</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除して 4 mL の PBS を追加し、室温で穏やかな揺れで 6 時間スライスを孵化させなさい。</li>
	<li>ヘラを使って 2 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。</li>
	<li>穏やかな揺れで 37 ° C (図 4)、48-72 時間 AbScale 溶液 1 mL の一次抗体 (表 3) を孵化させなさい。</li>
	<li>ヘラを使用して 5 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。</li>
	<li>穏やかな揺れで部屋の温度で 2 回 2 h の AbScale 溶液 4 mL で孵化させなさい。</li>
	<li>ヘラを使って 2 mL プラスチック チューブにスライスを慎重に取り外します。</li>
	<li>蛍光標識二次抗体 (テーブルの材料、1: 100) 穏やかな揺れで 37 ° C で 48 時間 AbScale 溶液 1 mL 中にインキュベートします。</li>
	<li>慎重に AbScale 溶液 4 mL を含む 5 mL プラスチック チューブにヘラを使用してスライスを削除、室温で穏やかな揺れで 6 時間スライスを孵化させなさい。</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し AbScale 溶液 4 mL を追加し、室温で穏やかな揺れで 2 回 2 h のスライスを孵化させなさい。</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し、4% の 4 つの mL を追加 PFA と室温で穏やかな揺れで 1 h のスライスを孵化させなさい。</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除して 4 mL の PBS を追加し、室温で穏やかな揺れで 1 h のスライスを孵化させなさい。</li>
	<li>ピペットを使用してチューブからソリューションを削除し Sca/eS4 溶液 4 mL を追加し、37 ° C で穏やかな揺れで 12 h のスライスを孵化させなさい</li>
	<li>スライド ガラスにスペーサーを配置、スペーサーでのスライスを配置し、Sca/eS4 ソリューションとスライスを浸します。カバーガラス (図 1) とスペーサーをシールします。</li>
	<li>カバーガラスと共焦点または 2 光子顕微鏡を用いた浸水距離目標の長い作業イメージに水を置きます。必要に応じて、電動ステージを使用します。 注: サンプルの深い部分は、ラベリングの偏りのないことを確認する表面的な部分に同様にラベル付けするかチェックしてください。 注: テスト抗体の浸透は、表 3に示すです。</li>
</ol>6. セル位置の決定
<ol><li>各位置にスキャンした画像の三次元画像フィルター14 (図 5 a-5D) を使用して相関値を計算します。</li>
	<li>(図 5) の相関値のピークの位置を決定します。</li>
	<li>セル (図 5E) を検索するピークの周りの画像を調査します。</li>
</ol>

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<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
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我々 はマウス皮質層 5 の主要な細胞型の細胞型特異組織の大規模な三次元画像を取得するための手順を提示しています。従来スライス染色に比べると、メソッドは新皮質の三次元組織の決定に有用です。メソッドにより、広いから画像取り込みと深い脳領域は一般的な生体内の2 光子励起顕微鏡または従来の共焦点顕微鏡と比較してし、したがって、皮質細胞の包括的な分析を許可できます。組織。
このメソッドの重要なステップは、抗体浸透です。抗体のサブセットは貧しい浸透厚い標本 (表 3) を示し、したがって、AbScale メソッドには使用できません。本研究で使用される抗体と均一なラベルを取得するには、脳を 500 μ m のスライスにカットする必要があります。小さい抗体フラグメント、例えば、工場または F(ab') 2 フラグメントおよび/またはクリア方法21,22,<sup clas...

哺乳類の大脳皮質はそれぞれ特定の遺伝子発現パターン、電気生理学的および生化学的特性、シナプス接続は、細胞の種類、数が多いから成るし、生体内機能1,2 、3,4,5,6,7。これらの細胞型を繰り返し構造に整理するかどうかがはっきりしなかった。視覚的方位選択性コラムや体性感覚の樽など、皮質カラム構造を繰り返しているが、細胞組織不明8,9のままです。これらは特定の皮質領域内に存在であり、脳全体のシステムではないです。
新皮質層 5 のニューロンの大部分は、4 つの主要な種類に分類されます。サブ大脳投射ニューロン興奮性ニューロンの主要なタイプは、ポンス、脊髄、上丘など皮質下のターゲットへ軸索をプロジェクトし、したがって、皮質の主要な出力経路10を表します。皮質投射ニューロンの興奮性ニューロンのもう一つの主要なタイプは、皮質10を支配します。抑制的なニューロンはまた 2 つの主要なクラスを含む: パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞11。
最近の分析は示す繰り返し構造12,13,14に 4 つのセルの種類を分類しました。サブ大脳投射ニューロン12,13,14と皮質投射ニューロン14は、直径 1-2 細胞の配向柱状を特定細胞型に整理します。パルブアルブミンとソマトスタチンを表現する細胞は、サブ大脳投射ニューロンの配向柱状で具体的にはなく、皮質投射ニューロン14の配向柱状を合わせます。配向柱状自身は定期的にフォーム六角形格子配列14およびマウス脳12,14言語、視覚、体性感覚と運動の分野を含む複数の皮質にある整列します。人間の脳の13のエリア。マイクロカラムを個々 のニューロン同期された活動の展示し、同様の感覚の反応がある14。これらの観察は、レイヤー 5 セル タイプはまとめる機能モジュールを繰り返しの最初の知られている脳全体の組織を表すマイクロカラム格子構造を示しています。
配向柱状約 10 μ m の半径を持っていると約 40 μ m の空間的周期.また、配向柱状の向きは尖樹状突起、皮質14の彼らの位置によって変化に平行です。したがって、マイクロカラム システムは数十マイクロメートルの典型的な厚さと従来の皮質のスライスを使用して解析することは困難です。さらに、周期性の解析の脳領域と、したがって、共焦点顕微鏡の典型的な画像領域の広い範囲から三次元データを必要とするまたは 2 光子励起イメージング生体内では狭すぎます。
最近では、厚い組織15,16をクリアする技術が開発されています。ここマイクロカラム システムを構成するマウス皮質層 5 の主要な細胞型の大型の三次元のイメージを取得するこれらのメソッドのアプリケーションについて述べる。逆行性ラベリングすることCrym egfpトランスジェニック マウス12と皮質投射ニューロンは、逆行のどちらかによりラベル付けされた強化された緑色蛍光タンパク質の発現によって、皮質下投射ニューロンが付きますラベリングやTlx3-cre/Ai9 マウス17の tdTomato 式で。パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞の免疫組織化学によるラベルです。(抗体スケール S) AbScale 法18 (を参照してください深い脳) SeeDB 法19他の実験に使用されている間、実験を汚す抗体が使用されます。これらのメソッドは、従来のイメージング方法上記の困難を克服し、層 514の正確な細胞組織を明らかにします。

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp トランスジェニックマウス</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre トランスジェニックマウス</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴムシート</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5 mm 厚さ</td></tr><tr><td>シリコーンゴムシート</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm 厚さ</td></tr><tr><td>シリコーンゴムシート</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>厚さ3.0mm</td></tr><tr><td>シャーレ ファ</td><td>ルコン</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>松波</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 555コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 594コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素サブユニットB(組換え体)、Alexa Fluor 647コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>インジェクターポンプ</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons インジェクション</td></tr><tr><td>インジェクターポンプ</td><td>KDサイエンティフィ</td>ック <td>KDS 100</td><td>スーペリアコリキュラス注射</td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>成重</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>共立製薬</td><td>ソムノペンチル</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ファイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リドカイン</td><td>アストラゼネカ</td><td>キシロカイン注射 1% エピネフリン</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>トーヨーアソシエイツ</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical silk</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipett</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Liquid, light</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>大塚</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Inter medical</td><td>&Phi;0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL プラスチックチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&α;-チオグリセロール</td><td>ナカライ テスク</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) フルクトース</td><td>ナカライ テスク</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>二光子顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>水浸長作動距離対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>水浸長作動距離対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>電動ステージ</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>セムロック</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>セムロック</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>クロマ</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL プラスチックチューブ</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL プラスチックチューブ</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>尿素ナ</td><td>カライテスク</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>ナカライテスク</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-ソルビトール</td><td>和光</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>メチル-&β;-シクロデキストリン</td><td>東京化学工業</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&γ;-シクロデキストリン</td><td>和光</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-L-ヒドロキシプロリン</td><td>皮膚必須活性剤</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ナカライ テスク</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ アルブリッチ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td> <td>ナカライ テスク</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) クロス吸着 セカンダリ抗体, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG (H+L) 高交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>水浸長時間対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>アンチNeuN</td><td>ミリポア</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>アンチニューン</td><td>ミリポア</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>アンチ CTIP2</td><td>アブカム</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>アンチスタット 2</td><td>アブカム</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>アンチ GAD67</td><td>ミリポア</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>アンチ GABA</td><td>シグマ</td><td>a2052</td><td></td></tr><tr><td>アンチパルブアルブミン</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>アンチパルブアルブミン</td><td>フロンティア研究所</td><td>PV-GO-AF460</td><td></td></tr><tr><td>抗パルブアルブミン</td><td>シグマ</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>抗パルブアルブミン</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>抗ソマトスタチン</td><td>半島研究所</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>抗 c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

哺乳類の大脳皮質は特定の電気生理学的および生化学的性質、シナプス、それぞれ興奮性と抑制性のニューロンの多くの種類の構成され、生体内での機能しますが、彼らの基本的な機能と解剖学的組織細胞からネットワークの規模にはよくわかっていません。ここで脳皮質の細胞組織の調査のための広い領域にわたって蛍光標識細胞の三次元イメージング法について述べる.特定の種類のニューロンの蛍光の逆行性神経トレーサーの注射やトランスジェニック マウスにおける蛍光タンパク質の発現によってラベルです。ブロック脳サンプルなど北半球の固定後に準備、透明なクリア方法、組織で作られて、特定の細胞型の蛍光反応を受けます。大きな作動距離の対物レンズとモーターを備えられた段階装備共焦点または 2 光子の顕微鏡を使用して大規模な領域がスキャンされます。このメソッドは、マウス大脳皮質における細胞型固有マイクロカラム機能モジュールの定期的な組織を解決できます。プロシージャは、多様な脳の領域や他の複雑な組織に三次元細胞アーキテクチャの研究のために役立ちます。

我々 は/Ai9 トランスジェニック マウスのTlx3-creで tdTomato の発現による皮質投射ニューロンをラベルし、サブ大脳投射ニューロンを橋に CTB488 の逆行性のトレーサーを注入して可視化します。脳の左半球は SeeDB メソッドを受けたし、長い作業距離目的浸水を搭載した 2 光子顕微鏡を使用してスキャン (25 X、n. a. 1.1 作動距離 2 mm) と電動ステージ。401 の画像のスタック (512 x 512 ピクセル; ピクセル サイズ = 0.99 μ m) z ステップ = 2.8 30 スキャン位置のそれぞれで μ m が得られました。2 つの細胞の細胞体は脳の領域 (図 6)、および定期的な配向柱状 (図 7 a) を示した光学セクションの広い範囲にわたって表示されていた。さらに、(c57bl/6 j の背景を持つヘテロ接合体として維持される) Crym egfp</em...

ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

この方法は、新皮質の構造と機能の分析など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、脳内の大規模な三次元構造を明らかにすることができることです。この方法は新皮質についての洞察を提供することができますが、脊髄などの他の神経系にも適用できます。トレーサーを成体マウスの橋に注入するには、まず蛍光標識されたコレラ毒素サブユニットBの1マイクロリットルを26ゲージのハミルトン注射器に引き込みます。.シリンジにインジェクターポンプを置き、次にシリンジとポンプを定位固定装置のマニピュレーターのツールホルダーに置きます。マニピュレータを垂直軸から後方に12度傾けます。その後、マウスを定位固定装置の上に置きます。カミソリの刃を使って毛を取り除き、感染を防ぎます。次に、頭皮の10ミリメートルをカットして、ブレグマとラムダが見えるようにします。ピペットを使用して0.1ミリリットルの1%リドカインを投与します。脳定位固定装置のマウスピースの垂直位置を調整して、ブレグマとラムダのZレベルが同じになるようにヘッドの角度を設定します。次に、マニピュレーターを脳定位固定装置にスライドさせて位置を調整し、シリンジの先端がブレグマに近づくようにします。マニピュレータの位置を記録します。マニピュレーターのツールホルダーを動かして、シリンジを引っ込めます。続いて、マニピュレータを後方に5.4ミリメートル、横方向に0.4ミリメートル動かします。先端が頭蓋骨のエントリーポイントに近づくようにシリンジを進めてから、シリンジを引っ込めてエントリーポイントに印を付けます。マークされた位置に、直径約1ミリメートルの穴を開けます。シリンジの先端を穴に通し、先端の深さがブレグマで測定された深さより6.9ミリメートル大きくなるようにします。次に、ポンプを使用して1マイクロリットルのトレーサーを毎分0.2マイクロリットルで注入します。注射後、シリンジを脳から取り出します。必要に応じて、露出した脳を微小原線維止血剤の小さな断片と瞬間接着剤で覆います。露出した脳を生理食塩水で拭いて感染を防ぎ、頭皮を縫合します。次に、マウスを脳定位固定装置から取り外します。マウスが摂氏30度のインキュベーターで麻酔から約1時間回復するのを待ちます。マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。マウスが完全に回復したら、マウスを他の動物の会社に戻します。脳組織を採取するには、ハサミで頭皮を切って頭蓋骨を露出させます。次に、露出した頭蓋骨の正中線をハサミで切ります。次に、鉗子を使用して頭蓋骨を取り除きます。ブレグマとラムダの位置をマークする必要がある場合は、まず頭蓋骨の片側を取り外してください。次に、細いタングステン針を脳のブレグマとラムダの位置に挿入し、残りの頭蓋骨を取り除きます。続いて、脳サンプルをビブラトームプラットフォームに置きます。厚さ500マイクロメートルまでの切片をPBSで室温で切断します。この手順では、スライスを4ミリリットルのスケールS0溶液が入った5ミリリットルのプラスチックチューブに移します。次に、摂氏37度で穏やかに振とうしながら12時間インキュベートします。12時間後、ピペットを使用してチューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールA2溶液を追加します。スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら36時間インキュベートします。36時間後、チューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールB4溶液を追加します。スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら24時間インキュベートします。24時間後、チューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールA2溶液を追加します。スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら12時間インキュベートします。12時間後、チューブから溶液を取り出し、4ミリリットルのPBSを追加します。スライスを室温で穏やかに振とうしながら6時間インキュベートします。その後、スライスを2ミリリットルのプラスチックチューブに慎重に取り出します。一次抗体と1ミリリットルのABスケール溶液中で、摂氏37度で48〜72時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。その後、スライスを5ミリリットルのプラスチックチューブに慎重に取り出します。それらを4ミリリットルのABスケール溶液で2時間、室温で2回、穏やかに振とうしながらインキュベートします。その後、スライスを2ミリリットルのプラスチックチューブに慎重に取り出します。蛍光標識した二次抗体を1ミリリットルのABスケール溶液中で、摂氏37度で48時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。4ミリリットルの抗体スケール溶液が入った5ミリリットルのプラスチックチューブにスライスを慎重に取り出し、室温で穏やかに振とうしながら6時間インキュベートします。溶液を取り出し、4ミリリットルのABスケール溶液を加え、室温で穏やかに振とうしながらスライスを2時間2回インキュベートします。次に、溶液を取り出し、4ミリリットルの4%PFAを加え、室温で穏やかに振とうしながらスライスを1時間インキュベートします。次に、溶液を取り出し、4ミリリットルのPBSを加え、室温で穏やかに振とうしながらスライスを1時間インキュベートします。溶液を取り出し、4ミリリットルのスケールS4溶液を加え、スライスを摂氏37度で穏やかに振とうしながら12時間インキュベートします。続いて、スペーサーをスライドガラスの上に置き、スライスをスペーサーに置き、スライスをスケールS4溶液に浸します。スペーサーをカバーガラスで密封します。カバーガラスに水を入れ、共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡と水浸長時間対物レンズを使用してスライスを画像化します。本研究では、Tlx3-cre AI9トランスジェニックマウスのtdTomato発現により皮質投射ニューロンを緑色で標識し、7週齢で逆行性トレーサーCTB488を橋に注入することにより、マゼンタの脳下投射ニューロンを可視化した。これは、皮質領域のおおよその位置を示すトップビューです。これは、大脳下投射ニューロンを示すCTB488蛍光と皮質投射ニューロンを示すtdTomato蛍光の斜め図であり、これはマージされた画像です。2つの細胞タイプの細胞体は、脳の広範囲にわたって見え、光学切片は周期的なマイクロカラムを示しました。この画像は、Crym-eGFPマウスの光学切片におけるeGFP発現脳下投射ニューロンの細胞体と頂端樹状突起を示し、この画像は、抗体スケール法によりC57 Black 6マウスの橋にCTB488を注入することにより、緑色で標識されたパルブアルブミン発現細胞とマゼンタで標識された大脳下投射ニューロンを示しています。この手順に続いて、脳組織の定量的特性評価などの追加の質問に答えるために、3D画像処理などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、皮質生物学の分野の研究者がマウスの脳における新しいモジュラー組織を探求する道を開きました。

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウスの新皮質に挿入直角microprismsは通常、スライスに見られる視点を持つ複数の皮質層の深いイメージングが可能になります。一ミリmicroprismsは、広い視野（〜900μm）と樹状突起棘を解決するために十分な空間解像度を提供します。我々はV層神経イメージングとmicroprismsを使用して新皮質の血管イメージングを示す。...

マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す...

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの​​脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合：安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳の高解像度多画像を示す。...

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。...

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

この記事では、高分解能、蛍光標識したマウスの脳の微細脳解剖と、再構築するための完全な実験手順について説明します。説明されたプロトコルは、試料調製及び清算、画像化、データ後処理およびマルチスケール視覚化のための取付片を備えている。...

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。...

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

マウスの仔の脳をカットするために、複数の角度を使用して、我々は主要な聴覚中脳と前脳構造のほとんどの間の接続をキャプチャ前述の急性脳スライスを改善。...

商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

ここでは、自由に動くマウスの複数の皮質層にわたる細胞 - 解像度で大規模なCa 2+イメージングを行うための手順を提示する。移植されたプリズムプローブと結合された小型頭部装着型顕微鏡を使用して、数百の活性細胞を同時に観察することができる。...

多層皮質Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

このプロトコルでは、iDISCO+を使用して無傷のマウス脳の磁気共鳴イメージング、クリアリング、および免疫標識を行う方法について説明し、その後、ライトシート顕微鏡を使用したイメージングの詳細な説明、およびNuMorphを使用したダウンストリーム分析について説明します。...

MRI、組織透明化、ライトシート顕微鏡を用いた無傷新生児マウス脳の全脳単一細胞イメージングと解析

この研究では、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)と造影剤をex vivo...

マウス新生児脳のマイクロCTイメージングと形態解析

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶマウス大脳皮質の細胞組織を可視化する組織透明化と蛍光標識を用いた大規模三次元イメージング法。この手法は神経細胞の構造と機能を詳細に解析し、神経科学研究に広く応用可能です。

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

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