Name: 生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶ、アフリカツメガエルのオタマジャクシを用いた嗅覚経路の機能評価法。生体イメージングと行動実験により、神経損傷と回復メカニズムをリアルタイムで観察し、神経可塑性の理解に貢献します。

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この作品は、エル Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO; からの補助金によって支えられました。SAF2015-63568-R) M. G. F. Fuortes 記念フェローシップ、スティーブン ・ w ・ Kuffler 奨学基金、ローラ、アーサー Colwin 恵まれて夏研究奨学基金から競争的研究賞によって、欧州地域開発基金 (ERDF) を cofunded、フィッシュバッハ親睦と海洋生物学研究所の、国立アフリカツメガエル リソース RRID:SCR_013731 (森の穴、マサチューセッツ) この仕事の部分が行った偉大な世代ファンド。またセルサ プログラムに感謝/ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ機関サポートのため。アダムローリーはセラ Húnter やつです。

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<li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li>
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<li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li>
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リビングで嗅覚経路の機能を調査するために役立つ手法について述べるアフリカツメガエルのオタマジャクシ。現在のプロトコルはアフリカツメガエル; へのアクセス、仕事、またはそれらの研究所にとって特に便利しかし、神経細胞の再生と修復の細胞および分子基盤を調査しているそれらの研究のための興味深いですも。アフリカツメガエルで得られた結果は、されるメカニズムを識別するためにその他の脊椎動物モデルで収集したデータを結合できます。説明する方法便利な遺伝子組み換えアフリカツメガエル18,22,23の開発、オタマジャクシ24、神経系疾患の実験モデルに適用できます。 25。
再現性の高い生体内でデータを取得するためには正しくア...

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の正常な機能を学習する優れた動物モデルを構成します。神経機能生体内で3 を調査できるようにアフリカツメガエル幼生のユニークな特性を透明性、完全に配列されたゲノム1,2, と外科、電気生理学とイメージング技術へのアクセス.この動物モデルの複数の実験的可能性のいくつかはオタマジャクシ感覚運動系4,5,6に対して徹底的な研究によって説明されます。情報レベル シナプスの処理の多くの側面を研究に特に適して神経回路は、アフリカツメガエルのオタマジャクシの嗅覚系7です。まず、そのシナプスの接続はよく定義された: 嗅覚受容ニューロン (ORNs) プロジェクトの嗅球へと臭気マップを生成する糸球体内の僧帽細胞の樹状突起とシナプスの接触を確立します。第二に、その ORNs は嗅覚経路8の機能を維持するために一生神経によって継続的に生成されます。第三に、アフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムは、素晴らしい再生能力を示すが完全切除9後の嗅球を改革することが.
本稿では嗅覚経路の機能を研究する行動実験と生活オタマジャクシで嗅糸球体の画像を結合する方法をについて説明します。ここで詳細な方法は、嗅神経断裂10後の嗅球糸球体接続機能回復の研究に使用されました。嗅覚情報処理の進化は脊椎動物の代表であるアフリカツメガエルのオタマジャクシで得られたデータ保存します。
X. tropicalisを使用して説明する方法を例示されるが、 Xで容易に実装することができます。発生学。大人のX. laevisの大きいサイズにもかかわらず両種は幼生の段階で著しく似ています。主な違いは、ゲノムのレベルで存在します。X. laevisには、allotetraploid のゲノム、長い生成時間 (約 1 年) によって大抵定められる貧しい人々 の遺伝的少ないが表示されます。対照的に、X の性はその短い世代時間 (5-8 ヶ月) と二倍体ゲノムのための遺伝の修正に向いています。代表的な実験は、野生型動物と 3 つの異なる形質転換線に図示されている: Hb9:GFP (X. tropicalis)、NBT:GFP (X. tropicalis)、tubb2:GFP (X. laevis)。
現在の作業に記載されている方法論は、アフリカツメガエルにおいて遺伝的進行と共に考慮されなければなりません。シンプルさと提示の技術の導入が容易になります CRISPR Cas9 技術12によって生成されたアフリカツメガエル行と同様に、既に説明した変異体11を評価する場合に役立ちます。アフリカツメガエル幼生へのアクセスを有するあらゆる研究室で実装できる嗅覚神経を縦断面に使用手術についても述べる。アプローチがシナプス前のカルシウム応答を評価するために使用し、嗅覚に基づく行動が特定の機器を必要とするとはいえ適度な費用でご利用いただけます。方法論研究グループでの使用を促進するために簡単な形式で掲載して、改善を実装することによって、または他の技術、すなわち,組織学的または遺伝学的アプローチへの関連付けによってより複雑なアッセイの拠点を設定することができます。

<table><tbody><tr><td>水族館用塩(インスタントオーシャンソルト)</td><td>テクニプラスト</td><td>XPSIO25R</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr>ピン<tr><td>セット#5(先端0.025×0.005mm)</td><td>ワールド精密機器</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>バンナスハサミ(先端0.015×0.015)</td><td>ワールド精密機器</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Whatman定性濾紙</td><td>Fisher Scientific</td><td>WH3030917</td><td></td></tr><tr><td>X. laevis tubb2-GFP</td><td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td><td>NXR_0.0035</td><td></td></tr><tr><td>X.tropicalis NBT-GFP</td><td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-7001</td><td></td></tr><tr><td>カルシウム グリーンデキストラン, カリウム塩,10,000 MW、アニオン性</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション用ホウケイ酸毛細血管</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-75-10</td><td>O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm.</td></tr><tr><td>プーラー</td><td>サッター インスツルメント</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>パーカー インスツルメンツ</td><td>ピコスプリッツァー III</td><td></td></tr><tr><td>シルガルド-184</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>761028-5EA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフィル マイクロピペット</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>AxioImager-A1</td><td></td></tr><tr><td>マスター-8 刺激装置</td><td>A.M.P.I.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>浜松</td><td>画像EM</td><td></td></tr><tr><td>電磁弁</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>VC-6 6チャンネルシステム</td><td></td></tr><tr><td>ダウコーニング 高真空グリース</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>636082B</td><td></td></tr><tr><td>ツボクラリン塩酸塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T2379</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>ツァイス</td><td>MRC-5 カメラ</td><td>ゼンで制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>カメラレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>MVL8ML3</td><td>使用するカメラモデルに適応させるべき複数の可能性があります</td></tr><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>RSコンポーネント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニホールド</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>MP-6 灌流マニ</td><td></td></tr><tr><td>ピュレーター ソリューションをローカルに配信するためのマイクロマニピュレーター</td><td>ナリシゲ</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ミニ磁気クランプ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>MAG-7、MAG-6</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0755</td><td>O.D.=1.57 mm.、I.D.=1.14 mm。</td></tr></tbody></table>

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。多数のイメージング技術、電気生理学的手法、行動アッセイへのアクセシビリティなど、複数の実験的利点を提供します。アフリカツメガエル幼生の嗅覚系は特に正常な開発の間に確立されたまたは傷害の後改革シナプスの機能を調査するために適しています。ここでは、リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生。嗅覚に基づく行動アッセイと嗅球の糸球体におけるシナプス カルシウム反応の生体内測定の組み合わせの概要を説明します。メソッドは、シナプス接続の配線を検討する嗅神経の断裂と組み合わせることができます。中枢神経系細胞における GFP レポーターを表現する野生型および遺伝子組換え動物を用いる実験を紹介します。遺伝子組換えオタマジャクシに説明した方法の適用は、脊椎動物の動作を定義する分子基盤の解明に役立ちます。

本稿で提案する体内のアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚システムの機能の研究を実行する 2 つの相補的アプローチの組み合わせ: 私) 生活の糸球体におけるシナプス前 Ca2 +のイメージング手法を変更オタマジャクシ蛍光カルシウム インジケーター、および ii を使用して) 匂いは特定の水系匂いへの反応を調査するため行動のアッセイを導かれます。嗅覚情報処理を傷害10後の回復を評価するこれらのアプローチが採用されているので嗅覚神経を transecting のための簡単な方法についても述べる.
嗅覚経路の断裂アフリカツメガエルオタマジャクシ プロシージャの妥当性を証明する 2 つの方法があります。両方は蛍光レポーターを使用して...

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

この方法は、生体内でシナプス前末端がどのように機能するのかといった神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この一連の技術の主な利点は、ゼノプスオタマジャクシを動物モデルとして使用する嗅覚経路の機能を主張する無料のアプローチを示していることです。この手順を実証することは、私、ベアトリス・テルニ、パオロ・パッチョラです。0.02%MS2 22麻酔液中のセルロース定性的なフィルターペーパーの2枚を湿潤し、解剖スコープの下に置くことによって、セクションの手順を開始します。その後、タンクからオタマジャクシを選び、麻酔液の皿に浸します。オタマジャクシは2〜4分以内に泳ぐのをやめるべきです。ピンセットを使用して尾部レベルで適用される機械的刺激に対する反応がないことにより、適切な麻酔を確認します。麻酔をしたオタマジャクシをフィルターペーパーのスコープの下に置きます。脳の構造を視覚化できるように、その後ろ側を上向きにして動物を配置します。行動実験では、静脈はさみを使用して両方の神経をトランセクトし、嗅球に到着するすべての臭気情報を抑制します。2マイクロリットルのカルシウムグリーン1デキストリン溶液を含むポルドガラスピペットをロードし、マイクロインジェクターに入れます。解剖顕微鏡の下に麻酔をしたオタマジャクシをフィルターペーパーの上に置き、ピペットの先端を鼻カプセルの主な空洞に移し、0.15〜0.3マイクロリットルの染料を送達する。オタマジャクシを2~3分間所定の位置に置いておきます。パスツールピペットを使用して、乾燥を避けるために、動物のより多くのコドル部分に0.02%MS2 22溶液を滴下します。オタマジャクシが10分以内に正常な水泳を回復する必要がある回復タンクに動物を転送します。注射の翌日に嗅球の糸球体層のレベルで蛍光を観察する。最初に嗅球の上の皮膚を取り除くことによって、画像化のための麻酔付きオタマジャクシを準備します。静脈はさみを使用して、嗅球のレベルで中枢神経系の端にあるオタマジャクシの皮膚に横切りを行います。視神経の位置によって容易に識別することができるテクタムに切り傷を延長することを避ける。パスツールピペットを使用して0.02%MS2 22溶液の滴を適用し、ピンセットを使用してカット皮膚をつまみ、神経系の上に引っ張ることによって、動物の湿った状態を保ちます。嗅球の上にメラノサイトがないことで、除去に成功したことを確認します。オタマジャクシをセルガードコーティングされた皿の井戸に入れます。高真空グリースでコーティングされたガラスカバースリップを、テクタムの上部を尾端まで覆います。嗅球とプラコードが細胞外媒体にさらされたままであることを確認してください。ピトリ皿に、筋肉の収縮を防ぐために100マイクロモルチューブコクラリンを含むゼノプスリンガーの溶液を充填し

functional-evaluation-of-olfactory-pathways-in-living-xenopus-tadpoles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。...

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

アフリカツメガエルのオタマジャクシは黒/白のタンクの白側水泳を好むツメガエル 。この現象は、それらの視覚によって案内される。この動作に基づいて、我々はオタマジャクシの視覚機能をテストするための簡単​​な分析を提示する。...

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

マウス副嗅球（AOB）は、感覚コーディングのコンテキストで勉強することは困難であった。ここでは、AOBニューロンは、マウスのフェロモンとカイロモンの情報処理の研究を容易にする、その周辺の入力に機能的に接続されたままでいるエクスビボ製剤を生成する解剖を示す。...

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

私たちは、ニューロンの形態とその経時的な発達を視覚化するためのエレクトロポレーションとその後の共焦点レーザースキャンまたは多光子顕微鏡による嗅覚ニューロンのin...

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究するインビボ

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々...

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus...

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ -...

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

ここでは、 ショウジョウバエ...

若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング

学ぶ、アフリカツメガエルのオタマジャクシを用いた嗅覚経路の機能評価法。生体イメージングと行動実験により、神経損傷と回復メカニズムをリアルタイムで観察し、神経可塑性の理解に貢献します。

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

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