Name: 円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶ 4C-seq法によるクロマチン相互作用の高スループット解析。PCRバイアスを低減し、転写制御におけるプロモーター・エンハンサー相互作用を正確に捉える技術を解説します。

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<li>Williams, R. L. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li>
<li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li>
<li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li>
<li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787(2017).</li>
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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

4 C の結果規制以前に未知の要素を識別できるクロマチンの相互作用および/特定の生物学的文脈の24,25,26に重要な標的遺伝子を明らかにする可能性があります。ただし、技術的なハードルは、これらの実験から得られたデータを制限可能性があります。4 C のプロトコル テンプレートが過大に増幅から生じる PCR バイアスがあります。このプロトコルは、客観的にサイクルの増幅の最適な数を決定する qPCR を利用してこの問題を解決します。さらに、制限のダイジェストによって増幅逆 PCR 産物から餌のシーケンスの除去は、2 つの理由クロマチンの相互作用の同定を実現できます。まず、シーケンスする材料から非報知的な (餌) 塩基対の長さが短くなります。第二に、そしてその結果としてより多くの読み取りは多様なシーケンス (正確な基本通話に必要なプロパティ) から生成される、従ってより有益な相互作用シーケンスをマップできる可能性が高まります。他のプロトコルは異なる餌シーケン...

遺伝子発現の調節配列の同定は、人間のゲノムの1,2の 80% の機能活動を包括的に注釈百科事典の DNA 要素 (エンコード) プロジェクトによって促進されています。個々 の細胞のタイプの DNA メチル化の修正とエピジェネティックなヒストン DNaseI の過敏症、生体内の転写因子結合部位の同定舗装候補の規制の機能解析の方法ターゲット遺伝子の表現のための要素。これらの知見を武器に、私たちは規制要素と遺伝子の機能的な相互接続性の決定への挑戦に直面されます。具体的には、指定されたターゲット遺伝子とその enhancer(s) との関係は?クロマチン構造のキャプチャ (3 C) メソッド直接関心領域と固定クロマチン3 でキャプチャしたイベントを使用してシーケンスを操作する候補の識別物理的、および可能性があります機能、相互作用によってこの質問に対応します。.クロマチンの相互作用への理解が増すにつれ、しかし、それは事前に選択された候補遺伝子座の調査は遺伝子エンハンサーの相互作用の完全な理解を提供するために不十分である明らかです。たとえば、エンコードは人間のゲノム (1%、パイロット 44 座の設定) のごく一部を調べる高スループット染色体構造キャプチャ カーボン コピー (5 C) 方法を使用し、軌跡の複雑な相互接続性を報告しました。遺伝子と特定された相互作用の増強物多かった線形空間4で離れて kilobases の何百も、2-4 複数の相互作用パートナーの平均。さらに、李ら。対終了タグのシーケンス (嘉ペット) によるクロマチン相互作用解析を使用して全ゲノム プロモーターの相互作用を分析し、RNA ポリメラーゼ II 結合部位の 65% がクロマチンの相互作用に関与していたことを発見します。これらの相互作用のいくつかで起因した大きい、多遺伝子複合体のゲノムの距離、平均を含んでいる kilobases の何百ものスパニング 8 9 遺伝子各5。一緒に、これらの調査結果は、公平なの全ゲノムは染色質相互作用を尋問法の必要性を強調表示します。これらのメソッドのいくつかは、シュミットらで審査されます。6。
最近クロマチン構造キャプチャ研究法と相まって次世代シーケンス (やあ-C と 4 C seq) 有効にする関心6の領域と相互作用する未知のシーケンスの発見。具体的には、次世代シーケンス (seq 4 C) の円の染色体構造のキャプチャは遺伝子座のキャプチャされたクロマチンに近位から DNA の配列によって公平に7に興味のシーケンスとの相互作用を識別するために開発された、3 D 空間に関心の領域。簡単に言えば、クロマチンは、制限の酵素と裂かれ、相互作用する遺伝子座 (図 1) の生物学的関連性の高い「もつれ」をキャプチャする希釈条件下で結紮後そのネイティブ蛋白質 DNA の相互作用を維持するために固定されています。相互リンクは、このように 2 番目の制限の酵素と追加胸の谷間の DNA を残して、タンパク質を削除に逆です。最終的な結紮は、相互作用する遺伝子座の小さい円を生成します。興味のシーケンスにプライマーは、下流の次世代シーケンシングに続いて円形のフラグメントから未知のシーケンスの増幅されたライブラリを生成する使用されます。
既存 4 C seq メソッド8,9,10、11,12に 2 つの主要な変化を試料に焦点を当てて、ここでは、提示されたプロトコルになります。まず、qPCR ベースのメソッドを使用して、経験的判断増幅の最適数 4 C seq ライブラリの準備手順のサイクルし、このようにライブラリが過大に増幅から生じる PCR バイアスの可能性を軽減します。第二に、それはシーケンス装置による正確な基本通話を妨げるし、したがって、それぞれの読み取りにユニークな有益なシーケンスを最大化する知られていた「餌」シーケンスの均一性を減らすための努力で、追加の制限のダイジェスト ステップを使用します。他のプロトコルは、異なる餌シーケンスおよび/または制限のサイト、他の所で達成可能ではないかもしれない実験の量を多く (12-15)8 4 C seq ライブラリをプールすることによってこの問題を回避します。ここに示す変更許可少数の実験のサンプル、および/またはインデックスし、1 車線にプールにレプリケートされます。

<table><tbody><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>CviQI</td><td>NEB</td><td>R0639S</td><td></td></tr><tr><td>DNAオリゴヌクレオチドプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>読者が設計する</td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、メタノールフリー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ニューテーター</td><td>VWR</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>JT ベイカー</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸酸性 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>振とうヒートブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris-HCl</td><td>品質 生物学的</td><td>351-048-101</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/mLグリコーゲン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>MT-46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>qPCRサイクラー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>qPCRプレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>サー</td><td>モフィッシャー</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>PCRストリップチューブ</td><td>MidSci</td><td>AVSST-FL</td><td></td></tr><tr><td>1 M 塩化マグネシウム</td><td>品質 生物学的</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレオトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン三リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>拡張ロングテンプレート PCR システム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermoフィッシャー</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>SYBR グリーン I</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>BioRad</td><td>172-5858</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>エンドイット DNA エンドリペアキット</td><td>Lucigen</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast ラピッド DNA ライゲーションシステム</td><td>プロメガ</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>SYBR セーフ</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS33102</td><td></td></tr><tr><td>Taqポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td></td></tr><tr><td>UltraSieveアガロース</td><td>IBI科学</td><td>IB70054</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquickゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 c seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

指定されたターゲット遺伝子の調節配列の同定は、ターゲット遺伝子に規制要素の位置決めと効果サイズの変動により重要な技術的な挑戦をポーズします。存在の bioinformatic 予測と節約されたトランスクリプション要因結合サイトを用いた活性遺伝子発現に関連する近位のエピジェネティックな修飾の機能はいくつかの進歩をしました。クロマチン構造キャプチャ研究シーケンスの間、全体のゲノムの内であっても物理的なクロマチン連絡先を発見する我々 の能力をもたらしました。次世代シーケンス (seq 4 C) と相まって円形クロマチン構造キャプチャは特に、ターゲット遺伝子や規制などの興味 (視点) の指定されたシーケンスのすべての可能な物理的なクロマチンの相互作用を発見する設計エンハンサー。現在 4 C seq 戦略が直接みた内からシーケンスが、多数を必要として制服の技術的な課題を避けるために同時にシーケンスする多様な観点からベース次世代シーケンシング プラットフォーム (画像) を呼び出します。この実験は、多くの実験室の実用的なできない場合があります。ここで、追加の制限の酵素のダイジェストと多様なシーケンス リードの大きいキャプチャを容易にするための潜在性を軽減するために設計されている qPCR ベースの増幅の手順の両方を組み込んだ 4 C seq プロトコルに変更されたアプローチを報告します。PCR バイアス、それぞれ。私たちの修正 4 C 法はクロマチンのアーキテクチャを評価するための標準的な分子生物学研究室に従う義務があります。

プライマリ ヒト角 2-3 捨てられた新生児包皮から分離した、プール、および補足 KSFM で培養した 30 μ g/ml ウシ脳下垂体抽出物、0.26 ng/mL 組換えひと上皮成長因子、0.09 mM 塩化カルシウム (CaCl2) 37 ° c、5% 炭酸ガス。セルに分割された 2 つのフラスコと 1 つのフラスコ増殖から 1.2 mM 72 h 107セルのための最終的な集中に CaCl2の付加によって区別された人口の 1% に固定されたケラチノ サイトの分化室温で 10 分間のホルムアルデヒド。別に、K562 細胞は 37 ° c、5% 炭酸ガス 10% 牛胎児血清添加 RPMI で栽培されました。10 の7セルは、室温で 10 分間の 1% のホルムアルデヒドで修正されました。
細胞を溶解し, と固定のクロマチンは HindIII で消化され、前述の結紮...

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability を最大化します。

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

この方法は、クロマチン相互作用の役割など、転写調節分野の主要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、関心のある遺伝子座に対する相互作用の比較的公平なキャプチャを提供することです。この方法はプロモーターエンハンサー相互作用に関する洞察を提供することができるが、他のタイプのクロマチン相互作用を同定するために適用することもできる。一般的に、この方法に新しい個人は、プロトコルのために数日かかるため苦労し、プライマーの設計には試行錯誤と非定型プライマーの向きが必要です。選択した細胞におけるクロマチン相互作用を維持するために、1000万個の細胞あたりPBSに1%電子顕微鏡グレードホルムアルデヒドの9.5ミリリットルを加えることによってそれらを架橋する。室温で10分間揺れながら細胞をインキュベートします。反応管を氷に移してクロスリンク反応を消光し、氷冷1モルグリシンを最終濃度の0.125モルに加え、穏やかな反転によって混ぜます。テキストプロトコルに従って遠心分離して細胞を洗浄した後、0.5%SDSおよび1つのXプロテアーゼ阻害剤を用いて5ミリモルEDTAの125マイクロリットルのペレットを再び懸濁させる。氷上の細胞懸濁液を10分間インキュベートする。細胞のlyseが完全であることを確認するために、顕微鏡スライド上のトリパンブルーの6マイクロリットルと細胞の6マイクロリットルを混合し、カバースリップで覆います。顕微鏡下で見て、細胞の内部を青色に見せ、未分解細胞を白く見る。最初の制限消化のために10 X制限酵素バッファーの30マイクロリットル、20%トリトンX-100の27マイクロリットルを細胞懸濁液に加え、水で300マイクロリットルに総容量を調節する。15マイクロリットルのアリコートを取り除き、未消化のコントロールとして摂氏4度で保存します。残りの反応混合物に制限酵素1の200個のユニスを加える。900 RPM攪拌を伴う振度加熱ブロック内の酵素に適した温度で一晩インキュベートする。翌日、酵素を200単位追加し、このインキュベーションを一晩継続します。15マイクロリットルのアリコートを取り除き、消化されたコントロールとして摂氏4度で保存します。消化効率を決定するために、10ミリモルトリス-HClの82.5マイクロリットル、pH 7.5を、各未消化および消化されたコントロールに加える。2.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、65°Cで1時間インキュベートし、ホルムアルデヒドの架橋を逆にします。消化したDNAを分離するには、100マイクロリットルのフェノールクロロホルムをチューブに加えます。いくつかのクイック反転によって混合し、残存タンパク質汚染を除去します。16で遠心分離機、100 Gは室温で5分間。遠心分離後、水相を新しいチューブに移します。酢酸ナトリウム

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

この論文は、染色体外環状DNA（eccDNA）を精製するためのCircle-Seqと呼ばれる高感度な方法を紹介しています。この方法には、カラム精製、残存する直鎖状染色体DNAの除去、ローリングサークル増幅、ハイスループットシーケンシングが含まれます。Circle-Seqは、真核生物のeccDNAのゲノムスケールのスクリーニングや、ゲノムの不安定性やコピー数多型の研究に応用できます。...

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。...

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

円形RNA(circRNA)は、タンパク質間の転写調節および媒介相互作用に役割を有し得る非コードRNAである。circRNAシーケンシングライブラリの構築のための異なるパラメータの評価に続いて、RNase...

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。...

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

ここでは、染色体立体構造捕捉(3C)技術の適応を、学部生の関与と学習に重点を置いて詳細に紹介します。...

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture...

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

CRISPRのような技術に対する大きな障壁は、重要な遺伝子を破壊する可能性のあるオフターゲットイベントです。「Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by...

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

学ぶ 4C-seq法によるクロマチン相互作用の高スループット解析。PCRバイアスを低減し、転写制御におけるプロモーター・エンハンサー相互作用を正確に捉える技術を解説します。

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

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