Name: ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶニューロンとアストロサイトの三次元共培養法。ヒト多能性幹細胞から機能的に成熟した細胞を生成し、シナプス回路活動を測定する再現性のある手法です。神経再生研究や創薬開発に応用可能です。

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博士マイケル区 (NIH) iNeuron 分化に関する技術的な助言のため、予備的な画像解析のサバ Barlas これらのプロシージャの設計上の知的入力を博士エリック Ullian (UCSF) に感謝したいと思います。

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは神経共培養系の 3 D 球の生産のための体系的な方法をについて説明します。球は hPSCs から独立して派生はニューロンとアストロ サイトので構成されます。しかしこのプロトコルのフォーカスではない、hPSCs28からアストロ サイトの純粋な人口の世代の重要なステップし、経験することがなく実行される場合、技術的に挑戦することができます。これらのシナプス回路の生成のこの最初のステップは、細部への細心のタイミングと実行必要があります。HPSC 由来アストロ サイトの利用制限は長い分化過程;ただし、将来のためを固定できる細胞の大量生産で解凍実験の時間 (手順 2.1.5 参照) hPSC 初期段階からプロセスを開始する必要があります。両方の特性がグリア12,35の存在によって強化特に形質転換 hPSCs から生成された iNeurons によるシナプス形成、自発的なシナプス後電流を展示する能力を持っているが、このプロトコルの詳細、hAstros を含みます。したが...

アストロ サイトは、さまざまな構造サポートを超える機能責任中枢神経系 (CNS) の中で非常に豊富なグリア細胞型。確立および開発1の中に成熟したシナプスのクラスタ リングによるシナプス形成可溶性因子と細胞外マトリックス (ECM) の分泌をアストロ サイトを支援します。彼らはまたから細胞外シグナル伝達2,3,4、5シナプスの可塑性、健康を維持するために重要な役割を果たすし、恒常性の長期的な安定性に貢献細胞外カリウム、グルタミン酸とエネルギー基質および ATP6,7,8の分泌を調節することによって環境。最後に、彼らは櫛谷電流9に影響を与える神経伝達に貢献できる、髄鞘化10の推進など他のセルタイプを通じた活動に直接に影響を与えることができます。重要なは、異常やアストロ サイトの機能不全は、多くの神経発達症候群や成人神経につながることができます、ので、改良するために設計された神経回路網内のニューロンとアストロ サイトを含めるには明白な必要性内因性の脳環境のモデル。アストロ サイトの不可欠な特性は、神経シナプス1,11,12フォーム動的相互作用する能力です。グリア細胞がない場合は、ニューロンは、シナプスは、一般的にも不足機能成熟度13の限られた数を形成します。
人間のアストロ サイト、転写、形態学的および機能的特性を表示-増加のサイズと、分岐として種特異的な遺伝子の複雑さなど-ことがない齧歯動物12,14で締めくくっています。 15。その結果、ひと多能性幹細胞 (hPSC) を利用した研究-派生神経細胞文化パラダイム16 や傷害モデル、新規治療法を開発しながら培養中枢神経系疾患を調べる手段として広くなるが ,17。さらに、hPSCs は、人間のシナプス形成と一次組織18,19を必要とせず関数の研究を許可します。
シナプス回路機能に貢献するさまざまなセルタイプおよび信号の理解にバリアは、人間の脳の関連モデルの欠如です。そのシナプス ネットワーク高再現性と再現性を要約する適切なプラットフォームの必要性があります。3次元培養システムの生産に関心が最近、浮上している ('organoids、' として広く知られている「回転楕円体、' または 'ミニ脳') 携帯とマクロのレベルで構造の複雑な三次元 (3 D) をモデル化する20 。3次元培養システムは、典型的な 2D 共パラダイム21,22の中には通常不在か限られた ECM と細胞間の相互作用を保持します。テクニックの豊富さは 3 D 神経スフェロイド23,24,25; を養殖、します。しかし、多くは長い培養期間を必要とする (月への年) 自発的な開発とレイヤー保存、ユーザーと出展出力を非常に小さな制御。
ここでは、急速に体系的な方法を示すし、一貫して複数の細胞のタイプ (前分化ニューロンとアストロ サイト) 間強酸細胞間相互作用に由来する hPSCs 球共培養系 (「小惑星')26 に細胞を組み立てることによって3 D で人間固有の形態学的複雑さを要約します。この高密度の神経システムは、時間をかけて成熟したプロパティとすることができます上映または高スループット方法で試金される均等に分散ニューラル サブタイプを生成します。初めて人間のアストロ サイトがこれらの三次元共培養系におけるシナプス ネットワーク バースト活動を誘発することを示す.さらに、このプロトコルは、中枢神経系の地域別の id に指定されたセルを利用して必要に応じて他の複数の細胞型の相互作用を研究する、異なるサイズの球体を生成に容易に適応。

<table><tbody><tr><td>6ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>オリンパスプラスチックス</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>シグマ</td><td>A6964-100ML</td><td>剥離液</td></tr><tr><td>アグリウェルプレート Stemcell</td><td>Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>抗付着リンス液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>細胞の予防マイクロウェルプレートへの接着</td></tr><tr><td>アンチ/アンチ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td>メディアサプリメント</td></tr><tr><td>BrainPhys ニューロン媒体</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>神経生理学的基礎培地代替品</td></tr><tr><td>円形ガラスカバースリップ</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>クライオスター CS10</td><td>ステムセル技術</td><td>7930</td><td>10% DMSO DMEM</td></tr><tr><td>/F12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10565-042</td><td>GlutaMAXサプリメント</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>危険性:飲み込むと有毒です。作業濃度:2 &mu;M</td></tr><tr><td>Donkeyの血清</td><td>Lampireの生物工学的な実験室</td><td>7332100</td><td>働く集中:第一次ブロッキング緩衝液の5%、二次ブロッキング緩衝液の1%</td></tr><tr><td>塩酸ドキシサイクリン(Dox)</td><td>シグマ</td><td>D3072-1ml</td><td>危険:妊婦のための有毒。作業濃度:2 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>上皮成長因子(EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>使用濃度:10 ng/mL</td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子-2(FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>使用濃度:10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 実装液</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>使用濃度:一次ブロッキング緩衝液で5%、二次ブロッキング緩衝液で1%、血</td></tr><tr><td>球計算計または自動セルカウンター</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3149-50KU</td><td>使用濃度:2 mg/mL</td></tr><tr><td>磁気プレート</td><td></td><td>DLAB 8030170200</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル膜マトリックス</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>ECMコーティングソリューション。作業濃度:80 &mu;g / mlです。氷上で準備し、ピペット、チューブ、およびメディアが事前に冷やされていることを確認してください。</td></tr><tr><td>MEA 2100 システム</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>マウントソリューション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17502048</td><td>メディアサプリメント</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>凍結切片用組織包埋ソリューション</td></tr><tr><td>パップペン (アクアホールド)</td><td>科学機器研究所</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>HAZARD:吸入すると有毒です。使用濃度:PBS</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-ornithine(PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>使用濃度:0.5 mg / mL</td></tr>長方形ガラス<tr><td>カバースリップ</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td>剥離<td>と継代試薬</td></tr><tr><td>Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>使用濃度:10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>使用濃度:2 &mu;M</td></tr><tr><td>スピナーフラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S5-3</td><td>使用濃度:PBS</td></tr><tr><td>T25 培養フラスコ</td>で 20% または 30% <td>オリンパスプラスチック</td><td>25-207</td><td>ベントキャップ</td></tr><tr><td>T75 カルチャーフラスコ</td><td>オリンパスプラスチック</td><td>25-209</td><td>ベントキャップ</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>洗剤.使用濃度:1%</td></tr><tr><td>TeSR-E8基礎培地</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>ヒト多能性幹細胞(hPSC)培地</td></tr><tr><td>TeSR-E8サプリメント</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>ヒト多能性幹細胞培地用サプリメント</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>細胞透過化用洗剤。使用濃度:ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>一次抗体; 星状細胞 シナプス周囲</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>一次抗体; 星状細胞</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>一次抗体; 星状細胞</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>ジェフリー・ロススタイン博士からの贈り物</td><td>n/a</td><td>一次抗体; 星状細胞</td></tr><tr><td>ホーマー</td><td>シナプス 系</td><td>160 011</td><td>一次抗体; ニューロン、シナプス後</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Synaptic Systems</td><td>188 004</td><td>一次抗体; neurons</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>一次抗体; neurons, post-synaptic</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>一次抗体; 星状細胞</td></tr><tr><td>Synapsin 1 Synaptic</td><td>Systems</td><td>106 103</td><td>一次抗体; neurons, pre-synaptic</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta;3-チューブリン (TUBB3)</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-435P</td><td>一次抗体; ニューロン</td></tr></tbody></table>

ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

シナプス回路機能に貢献するさまざまなセルタイプおよび信号の私達の理解への障壁は、人間の脳の研究に関連するモデルの欠如です。この問題に対処する 1 つの新興技術、'organoids' または '楕円'、細胞接着分子を含む細胞間相互作用の長期保全のためと呼ばれる 3 つの次元 (3 D) 神経細胞文化の使用であります。ただし、これらの文化のシステムは時間がかかり、体系的に生成されません。ここでは、我々 は急速にかつ一貫して神経細胞の三次元共培養系を生成する方法を詳しく説明、アストロ サイトひと多能性幹細胞。まず、あらかじめ差別化アストロ サイトと神経前駆細胞は解離し、カウントされます。球の形成にセルを結合する次に、Rho キナーゼ阻害剤と再現可能なサイズの球を生成する特定の比率の料理。浮球として文化の数週間後共培養系 (「小惑星」)、最後に染色の断面またはシナプス密度と強度を測定する多配列にメッキ。一般に、このプロトコルが制限されて成熟細胞型マーカーを表示機能性シナプスを形成、自発的なシナプス ネットワーク バースト活動の展示、3 D 神経球をもたらすことが期待されます。一緒に、このシステムは、単層培養と比較してより適切なモデルの薬剤のスクリーニングおよび病気のメカニズムへの調査を許可します。

正しく実行される、アストロ サイト28,33,34とニューロンの35 (図 1 a-1C)、hPSCs から生成された機能共培養系の定義された集団としてこのプロトコルを生成します。以前26の詳細し、手順 2.1-2.2 でここで説明します。マイクロウェル プレートを使って、このステップワイズ見込まれて一貫性のあるサイズと形状 (ステップ 3.3; 3 D 神経球図 1)均等に分散した細胞と細胞死の重要な兆候なし。セル密度から始まるセルの種類の任意の比率の範囲は、さまざまなサイズの球になります。マイクロウェル プレートがない場合では、セルの結合...

このプロトコルの結合解離ひと多能性幹細胞由来神経細胞の再現性のある手法を目指して、アストロ サイト 3 D に一緒に球共培養系、これら球無料浮動小数点条件とその後の維持免疫分析によって行い電極の録音と球のシナプス回路活性を測定します。

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

この方法は、複数のヒト神経細胞タイプ間の細胞間コミュニケーションがシナプス回路の形成と機能にどのように寄与するかという神経科学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、ヒト多能性幹細胞から機能的に成熟したアストロサイトとニューロンの三次元共培養球を迅速かつ体系的に生成します。これらは、厳密な実験的調査に活用できます。このプロトコルの再現性とスケーラビリティは、新しいオルガノイド技術に対する明確な代替手段です。これらは、新規薬剤の開発や、傷害や病気後の神経再生を促進するための細胞生着療法に期待が寄せられています。まず、ローキナーゼ阻害剤Y-27632を含む2ミリリットルのHPSC培地にHPSCのクラスターをECMコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに装着します。幹細胞が約50%コンフルエントになるまで維持し、その後、培地をSB431542とDMH1を含む神経培地に変更して神経誘導を促進します。細胞が約95%コンフルエントになったら、各ウェルを1対6で新しいECMコーティングウェルに分割します。14日目に細胞を剥離溶液で解離し、各ウェルの内容物をY-27632を含む培地でコーティングされていないT25フラスコに移し、凝集体の形成を促進します。自発的に形成された3D凝集体にアストロサイト前駆細胞とアストロサイトを生成するには、EGFとFGF2を含む神経培地に切り替え、4〜6か月後にアストロサイトの同一性が確認されるまで3〜4日ごとに栄養を与えます。デフォルトでは、このプロトコルは背側皮質アストロサイトを産生します。しかし、アストロサイトのサブタイプは、必要に応じてパターニングモルフォゲンを添加することにより、地域的に特定することができる。週に一度、暗い中心が現れたら、遠心分離によって球体を回収し、H-astro凝集体を剥離液で穏やかに解離させます。非CNS細胞や非神経細胞の継代を避けるために、自発的に付着しない球体のみを再播種してください。増殖後4〜6か月後、メーカーの指示に従って凍結および凍結保存培地で細胞の同一性を確認するか、すぐに実験に使用してください。ニューロン、またはHニューロンにおける非トランスジェニックニューロン前駆細胞の作製のためには、14日目のHPSC由来神経前駆細胞を、ウェルあたり2ミリリットルの神経媒体とY-27632を含むECMコーティングされた6ウェルプレートに播種します。ドキシサイクリン誘導性iNeuronsを使用する場合は、細胞が約35%コンフルエントなときにドキシサイクリンを含む神経培地を添加して、分化を誘導し、遺伝子発現を活性化します。2日後、トランスジェニックおよび非トランスジェニック系統に、1日あたりウェルあたり2ミリリットルのニューラルメディアを給餌します。細胞が70%の密度で持ち上げる準備ができるまで続けます。共培養では、まずH-astroを3D凝集体から分離液で穏やかに解離します。次に、Hニューロン、またはiニューロンを2D単分子膜から解離します。まず、6ウェルプレートから培地を取り出し、単層培養物を含む各ウェルに500マイクロリットルの剥離溶液を加えます。摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、2〜3ミリリットルのDMEM-F12培地を静かに加えて、付着した細胞を取り除きます。その後、細胞を培地に集め、15ミリリットルの円錐管に入れ、Gの300倍で1分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの新鮮な培地を追加し、1, 000マイクロリットルのマイクロピペットで穏やかに上下にピペットを動かして、単一細胞懸濁液を実現します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、各細胞タイプをカウントします。解離したH-astrosとH-ニューロン(iNeurons)の所望の比率を、マイクロプレートの各ウェルに総容量2ミリリットルで加えます。プレートをGの100倍で3分間遠心分離し、インキュベーターに2日間戻します。1日後、プレート内に密集したマイクロスフェアが形成されているはずです。1, 000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、マイクロウェルから球体を静かに除去します。マイクロウェルの底に媒体で軽く力を加えて、追加の付着した球体を取り除きます。15ミリリットルの円錐管にすべての球を集めた後、落ち着かせます。次に、最初に古い培地を吸引し、次に少なくとも2ミリリットルの新鮮な培地を追加して球体を洗います。50〜60ミリリットルのメディウムが入ったスピナーフラスコに球体を追加します。フラスコをインキュベーター内の60RPMに設定された磁気攪拌板の上に置きます。シナプス形成には最低3週間の培養が必要です。まず、各多電極アレイ(MEA)の表面を1ミリリットルのポリオルニチンでコーティングして表面を親水性にし、摂氏37度で最低4時間インキュベートします。インキュベーション後、ポリオルニチンを除去し、各MEAの表面を脱イオン水で洗浄します。その後、1ミリリットルの細胞外マトリックスを加え、インキュベーターに最低4時間戻ります。準備ができたら、細胞外マトリックスを取り出し、1.5ミリリットルの培地に入った球体をMEA表面に塗布し、球体が電極アレイの上に配置されるようにします。2日間接着します。神経球の電気的活動を測定するには、MEAを温度制御されたヘッドステージに置きます。5 ヘルツのハイパス フィルターと 200 ヘルツのローパス フィルターを使用し、標準偏差の 5 倍のスパイクしきい値を使用して、自発的な電気的アクティビティを記録します。統計解析のために、スパイク周波数や振幅などの生データを保存します。ニューロンのMAP2やアストロサイトのGFAPなど、神経細胞型の制限タンパク質マーカーは、3D球体内のニューロンにおけるアストロサイトの均一な配置と成熟度を視覚的に示しています。アストロサイトの形態と分岐の最大投影は、膜結合GFPでまばらに標識されたH-astrosの代表的な3D球体で示されています。成熟したH-astrosはGFAPを含むマーカーを発現します。iNeuronsは左の画像に示すように、シナプス前タンパク質とシナプス後タンパク質を発現していますが、H-astroの存在と共培養により、シナプス密度は大幅に向上します。記録中、MEAに配置されたiNeuronsの健康な球体は、一貫した発火周波数で40マイクロボルトを超える電圧スパイクを自発的に引き起こします。コカルチャースフィアは、H-astroの存在によりネットワーク接続性が向上し、その結果、スパイクの同期ネットワークバーストが増加します。この手順に続いて、シナプス活動に対するアストロサイトの生理学的応答を測定するために、カルシウムイメージングなどの他の方法を実施することができる。さらに、既存のシナプス回路との接続性を調べるために、動物モデルへの移植を行うことができます。この生物工学的アプローチに従うことで、細胞外バイオマテリアルと、オリゴデンドロサイト、マイクログリアン、エテロール細胞などの追加の細胞タイプを特定の比率で組み込んで、脳で発生する複雑なシグナル伝達をモデル化することができます。

synaptic-microcircuit-modeling-with-3d-cocultures-astrocytes-neurons

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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