ひと多能性幹細胞からのニューロンとアストロ サイトの三次元共培養系によるシナプス局所回路におけるモデリング

この方法は、複数のヒト神経細胞タイプ間の細胞間コミュニケーションがシナプス回路の形成と機能にどのように寄与するかという神経科学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、ヒト多能性幹細胞から機能的に成熟したアストロサイトとニューロンの三次元共培養球を迅速かつ体系的に生成します。これらは、厳密な実験的調査に活用できます。

このプロトコルの再現性とスケーラビリティは、新しいオルガノイド技術に対する明確な代替手段です。これらは、新規薬剤の開発や、傷害や病気後の神経再生を促進するための細胞生着療法に期待が寄せられています。まず、ローキナーゼ阻害剤Y-27632を含む2ミリリットルのHPSC培地にHPSCのクラスターをECMコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに装着します。

幹細胞が約50%コンフルエントになるまで維持し、その後、培地をSB431542とDMH1を含む神経培地に変更して神経誘導を促進します。細胞が約95%コンフルエントになったら、各ウェルを1対6で新しいECMコーティングウェルに分割します。14日目に細胞を剥離溶液で解離し、各ウェルの内容物をY-27632を含む培地でコーティングされていないT25フラスコに移し、凝集体の形成を促進します。

自発的に形成された3D凝集体にアストロサイト前駆細胞とアストロサイトを生成するには、EGFとFGF2を含む神経培地に切り替え、4〜6か月後にアストロサイトの同一性が確認されるまで3〜4日ごとに栄養を与えます。デフォルトでは、このプロトコルは背側皮質アストロサイトを産生します。しかし、アストロサイトのサブタイプは、必要に応じてパターニングモルフォゲンを添加することにより、地域的に特定することができる。

週に一度、暗い中心が現れたら、遠心分離によって球体を回収し、H-astro凝集体を剥離液で穏やかに解離させます。非CNS細胞や非神経細胞の継代を避けるために、自発的に付着しない球体のみを再播種してください。増殖後4〜6か月後、メーカーの指示に従って凍結および凍結保存培地で細胞の同一性を確認するか、すぐに実験に使用してください。

ニューロン、またはHニューロンにおける非トランスジェニックニューロン前駆細胞の作製のためには、14日目のHPSC由来神経前駆細胞を、ウェルあたり2ミリリットルの神経媒体とY-27632を含むECMコーティングされた6ウェルプレートに播種します。ドキシサイクリン誘導性iNeuronsを使用する場合は、細胞が約35%コンフルエントなときにドキシサイクリンを含む神経培地を添加して、分化を誘導し、遺伝子発現を活性化します。2日後、トランスジェニックおよび非トランスジェニック系統に、1日あたりウェルあたり2ミリリットルのニューラルメディアを給餌します。

細胞が70%の密度で持ち上げる準備ができるまで続けます。共培養では、まずH-astroを3D凝集体から分離液で穏やかに解離します。次に、Hニューロン、またはiニューロンを2D単分子膜から解離します。

まず、6ウェルプレートから培地を取り出し、単層培養物を含む各ウェルに500マイクロリットルの剥離溶液を加えます。摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、2〜3ミリリットルのDMEM-F12培地を静かに加えて、付着した細胞を取り除きます。

その後、細胞を培地に集め、15ミリリットルの円錐管に入れ、Gの300倍で1分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの新鮮な培地を追加し、1, 000マイクロリットルのマイクロピペットで穏やかに上下にピペットを動かして、単一細胞懸濁液を実現します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、各細胞タイプをカウントします。

解離したH-astrosとH-ニューロン(iNeurons)の所望の比率を、マイクロプレートの各ウェルに総容量2ミリリットルで加えます。プレートをGの100倍で3分間遠心分離し、インキュベーターに2日間戻します。1日後、プレート内に密集したマイクロスフェアが形成されているはずです。

1, 000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、マイクロウェルから球体を静かに除去します。マイクロウェルの底に媒体で軽く力を加えて、追加の付着した球体を取り除きます。15ミリリットルの円錐管にすべての球を集めた後、落ち着かせます。

次に、最初に古い培地を吸引し、次に少なくとも2ミリリットルの新鮮な培地を追加して球体を洗います。50〜60ミリリットルのメディウムが入ったスピナーフラスコに球体を追加します。フラスコをインキュベーター内の60RPMに設定された磁気攪拌板の上に置きます。

シナプス形成には最低3週間の培養が必要です。まず、各多電極アレイ(MEA)の表面を1ミリリットルのポリオルニチンでコーティングして表面を親水性にし、摂氏37度で最低4時間インキュベートします。インキュベーション後、ポリオルニチンを除去し、各MEAの表面を脱イオン水で洗浄します。

その後、1ミリリットルの細胞外マトリックスを加え、インキュベーターに最低4時間戻ります。準備ができたら、細胞外マトリックスを取り出し、1.5ミリリットルの培地に入った球体をMEA表面に塗布し、球体が電極アレイの上に配置されるようにします。2日間接着します。

神経球の電気的活動を測定するには、MEAを温度制御されたヘッドステージに置きます。5 ヘルツのハイパス フィルターと 200 ヘルツのローパス フィルターを使用し、標準偏差の 5 倍のスパイクしきい値を使用して、自発的な電気的アクティビティを記録します。統計解析のために、スパイク周波数や振幅などの生データを保存します。

ニューロンのMAP2やアストロサイトのGFAPなど、神経細胞型の制限タンパク質マーカーは、3D球体内のニューロンにおけるアストロサイトの均一な配置と成熟度を視覚的に示しています。アストロサイトの形態と分岐の最大投影は、膜結合GFPでまばらに標識されたH-astrosの代表的な3D球体で示されています。成熟したH-astrosはGFAPを含むマーカーを発現します。

iNeuronsは左の画像に示すように、シナプス前タンパク質とシナプス後タンパク質を発現していますが、H-astroの存在と共培養により、シナプス密度は大幅に向上します。記録中、MEAに配置されたiNeuronsの健康な球体は、一貫した発火周波数で40マイクロボルトを超える電圧スパイクを自発的に引き起こします。コカルチャースフィアは、H-astroの存在によりネットワーク接続性が向上し、その結果、スパイクの同期ネットワークバーストが増加します。

この手順に続いて、シナプス活動に対するアストロサイトの生理学的応答を測定するために、カルシウムイメージングなどの他の方法を実施することができる。さらに、既存のシナプス回路との接続性を調べるために、動物モデルへの移植を行うことができます。この生物工学的アプローチに従うことで、細胞外バイオマテリアルと、オリゴデンドロサイト、マイクログリアン、エテロール細胞などの追加の細胞タイプを特定の比率で組み込んで、脳で発生する複雑なシグナル伝達をモデル化することができます。