核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ
2018年7月29日
このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。
この方法は、原子力力学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、細胞内の核を変形させるのに必要な力はどれくらいですか?細胞および核成分は、変形に対する核抵抗性にどのような役割を果たしていますか?
それとも、細胞構造との核結合は細胞の種類によって異なりますか?この技術の主な利点は、プロービング力を適用して、生きた接着細胞内の統合核細胞骨格を変形させることができることです。この方法は、NIH-3T3細胞の核機械的特性に関する洞察を提供するために使用されてきましたが、Hutchinson-Gilford老人細胞の核機械的特性の調査など、あらゆる接着細胞タイプにも適用できます。
この手順を開始するには、35ミリメートルのガラス底皿に5マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンをコーティングします。次に、10%ドナーウシ血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEMでNIH 3T3線維芽細胞を、コーティングされた皿上で37°Cで所望の合流性になるまで培養します。実験の直前に、PBSで細胞を2回洗浄し、続いて完全増殖培地で1回洗浄します。
その後、ガラス底皿に3ミリリットルの完全成長培地を加えます。この手順では、マイクロインジェクターの電源を入れます。液浸油スポイトを使用して、対物レンズに液浸油を一滴垂らします。
次に、ディッシュをディッシュホルダーにしっかりと固定し、ディッシュホルダーをステージにロードします。実験中は、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%に維持する必要があることに注意してください。次に、対物レンズの高さを調整して、セルに焦点を合わせます。
顕微鏡ステージを動かして、目的の細胞を見つけます。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットホルダーを最も高い位置に移動します。その後、直径0.5マイクロメートルのチップが付いたマイクロピペットをピペットホルダーにロードします。
次に、ファインコントロールを調整して、対物レンズの焦点面を平面Aより上に、セルの上部を平面Bに上げます。次に、マイクロマニピュレータを粗い制御位置にセットします。マイクロピペットのシルエットを観察しながら、マイクロピペットに完全にピントが合うまで、マイクロピペットをゆっくりと平面Bまで下げます。
マイクロピペットの先端にピントが合ったら、マイクロマニピュレーターを微調整に設定します。次に、対物レンズを細胞の赤道面まで下げ、マイクロピペットをその約15マイクロメートル上に下げます。マイクロインジェクターの補償圧力を希望の圧力に設定します。
圧力が安定するまで数秒待ちます。ピペットの先端が壊れたり詰まったりしていないか確認することが重要です。そうしないと、力の測定が不正確になります。マイクロマニピュレーターパネルのクリーンセッティングを使用してマイクロピペットが詰まっていないことを確認し、マイクロピペットの先端から気泡が出てくることを確認してください。
次に、マイクロピペットの先端を核表面に軽く触れるまで細胞に挿入します。マイクロピペットの先端と核膜の間にシールを作り、圧力供給チューブをマイクロインジェクションシステムから外し、マイクロピペットの端を大気に開きます。このステップにより、原子核表面の補償圧力に等しい負圧が発生します。
次に、画像収集ソフトを開きます。画像収集ソフトウェアで、ビデオ用のAVI集録または画像のND集録を設定します。次に、対応する蛍光イメージングチャンネルに切り替えて、イメージングを開始します。
核がマイクロピペットから離れるまで、マイクロピペットの先端を細胞の本体から離します。この図は、NIH 3T3マウス線維芽細胞核の強制力を示しています。マイクロピペットの先端が右に移動すると、核が変形し、最終的にはマイクロピペットの先端から外れます。
原子核の長さひずみは、吸引力の増加とともに増加することがわかります。原子核の前縁は核の突起を形成し、後縁は元の位置から変位します。突起の長さは後縁の変位よりもはるかに大きく、核と周囲の細胞質との間に密接な統合があることを示唆しています。
時間スケールは、核前端と核後端の緩和の略です。直接力プローブを使用して、核内および細胞骨格構造の変形に対する核の抵抗への寄与を決定しました。蛍光画像は、示された条件での前後の核のオーバーレイを示しました。
F-アクチン破壊または微小管破壊後に核の変形または翻訳に有意な差は見られませんでしたが、siRNAベースのノックダウンによってメンテンの発現を減少させると、核の翻訳と変形が有意に増加しました。このことは、線維芽細胞のメンテン中間フィラメントが、核が局所的な力に抵抗するのを助けた主要な細胞骨格要素であることを示唆しています。このビデオを見れば、生きた接着細胞の核に制御された既知の力を加える方法についてよく理解できるはずです。
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概要
本プロトコルでは、生細胞の核に制御された力を加えるためのマイクロピペット法について説明し、接着細胞における核の力学的特性の解析を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞力学
- 核力学
- 生物物理学
背景
- 核の力学を理解することは、さまざまな生物学的プロセスにおいて極めて重要です。
- 核を変形させるために必要な力を測定することで、細胞の挙動に関する知見を得ることができます。
- 細胞の種類によって、変形に対する核の応答は異なる可能性があります。
- 本手法は、これまでにNIH-3T3細胞に適用されています。
研究目的
- 生細胞において核を変形させるために必要な力を決定すること。
- 核の耐性に対する細胞成分および核成分の寄与を探索すること。
- 細胞構造との核の結合が細胞型によってどのように異なるかを評価すること。
使用された手法
- 核に力を加えるためのマイクロピペット操作技術。
- 核変形を観察するためのライブセルイメージング。
- さまざまな接着細胞種における核の機械的特性の解析。
- Hutchinson-Gilford早老症細胞を含む、異なる細胞株を用いた比較研究。
主な結果
- 本手法により、生細胞における核変形の測定に成功した。
- 核の機械的特性に関する知見を得た。
- 細胞種によって核の応答に多様性があることが実証された。
- 核力学における今後の研究に向けた枠組みを提供した。
結論
- このマイクロピペット法は、核力学を研究するための有用なツールとなります。
- 本手法は、NIH-3T3以外の様々な接着細胞型にも適用可能です。
- 今後の研究では、本手法を活用して疾患状態における核の挙動を探索することができます。
よくある質問
業界における重要性
核の力学的特性を理解することは、疾患モデルや薬剤スクリーニングにおける機械的ストレスに対する細胞応答を評価する上で極めて重要です。ダイレクトフォースプローブを用いることで、核と細胞骨格の統合性を定量的に測定でき、線維症、がん、およびラミノパチーにおけるターゲットバリデーションを裏付ける機序的な知見が得られます。このアプローチは、接着細胞系においてサブセルラーレベルの力学を表現型のアウトカムに結びつけることで、予測の信頼性を高めます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 核を変形させるのに必要な力を測定し、核の耐性に対する細胞骨格の寄与を解析することを可能にする。
- 運用の価値： 核の機械的安定性を調節する、メンテン中間フィラメントなどの特定の細胞骨格要素を特定する。
- 予測的価値： ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群細胞のような疾患関連システムにおける、核と細胞骨格の結合に関する仮説検証をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 適用された吸引力と相関する、定量的な長さひずみおよび変位の読み取り値を生成します。
- 再現性： 精密に制御されたマイクロピペット圧を使用することで、実験全体を通じて一貫した力の適用を保証します。
- 拡張性： 生細胞イメージングと互換性があり、核変形のハイコンテント解析に適応可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性： プロジェリアおよびその他のラミノパチーモデルに適用し、機械的負荷条件下での核の脆弱性を評価できる。
- メカニズムによるリスク低減： F-actin、微小管、および中間フィラメントが核の耐性にどのように寄与しているかを分析し、経路特有の影響を明確にする。
- トランスレーショナルな連続性： 異なる細胞型間で核の機械的表現型の比較を可能にし、前臨床段階での標的選択に役立てる。
パイプラインおよびワークフローの統合
ダイレクトフォースプローブは、化合物スクリーニングに先立つターゲットバリデーションやアッセイ開発に有用なバイオメカニカルなリードアウトを提供することで、初期の創薬ワークフローに適合します。
- 探索生物学：既知の力の下での核変形を定量化することで、核と細胞骨格の統合に関する仮説を検証します。
- スクリーニング：遺伝学的または薬理学的な摂動の比較に適した、標準化された定量的な核ひずみ測定値を提供します。
- 分析：核の機械的表現型の統計的比較を可能にする、力-変位データを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：核の力学を疾患モデルに結びつけ、メカノパチーにおけるバイオマーカーの整合性を支援します。
- エンタープライズ再利用：多様な接着細胞株にわたって核の機械的特性を評価するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 核の剛性に対する細胞骨格の寄与を分離することで、核メカノバイオロジーにおけるメカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値： マイクロピペット吸引圧による力適用の標準化を可能にし、ラボ間の再現性を向上させる。
- 戦略的価値： 核の機械的レジリエンスを変化させる細胞骨格ターゲットを明らかにすることで、意思決定（go/no-go決定）に有用な情報を提供する。
- ポートフォリオへの影響： 核-細胞骨格間のメカノトランスダクションに関与するターゲットのリスク調整済み優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- マイクロピペット操作および、制御された環境条件下での生細胞イメージングに関する専門知識が必要です。
- 校正済みのマイクロインジェクターシステムおよび、細胞接着のためにフィブロネクチンでコーティングされたガラスボトムディッシュを使用します。
- 力測定の精度を確保するため、吸引圧設定の標準化およびマイクロピペットチップの作製が必要です。
- 核のサイズや細胞骨格の組成が異なる別の細胞タイプに本手法を適用する場合、調整を検討する必要があります。
- 力の平衡を決定するために、核の脱離を直接的に視覚的にモニタリングする必要がある点に制限があります。
