Name: 核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶマイクロピペット法による細胞核への力印加技術。接着細胞における核の機械的特性と変形抵抗メカニズムを評価し、細胞骨格との力学的統合を解析する方法です。

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この作品は、NIH R01 EB014869 によって支えられました。

1. イメージング用細胞を準備
注: 任意の付着性のセルのタイプの直接力プローブ (DFP) を使用できます。ここでは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞は、このプロトコルのモデル細胞ラインとして使用されます。
<ol><li>文化 NIH 3T3 線維芽細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 1% と 10% ドナー牛血清ペニシリン-ストレプトマイシン 35 ミリメートルのガラスの下に目的の confluency まで皿します。37 ° C と 5% の CO2の細胞を維持します。<ol>
<li>必ずイメージングのための NIH 3T3 細胞を播種する前に 5 μ g/ml のフィブロネクチン (または類似の ECM 蛋白質) のすべての 35 mm ガラス底培養皿をコートしてください。 注: セルする必要が完全に普及して実験用皿に付着。DFP メソッドが動作するための密度の面で制約があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験直前にセルを洗浄して完全な培地で一回の洗浄が続く PBS で 2 回。</li>
	<li>ガラス底皿に完全な成長培地 3 mL を追加します。</li>
</ol>2. 顕微鏡と画像の取得
注: 倒立蛍光顕微鏡 (または同等) 側の腕は、メーカーの推奨事項に従ってインストール マイクロマニピュレーターと。顕微鏡は、37 ° c、温度および 5% の CO2レベルを維持するために環境チャンバーを装備する必要があります。マイクロマニピュレーターとマイクロインジェクター顕微鏡に接続も必要です。油浸漬 40 x/1.3 NA または 60 x/1.49 NA (または同等の目標) は実験のためにお勧めします。顕微鏡は、除振台にマウントする必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> 図 1.核変形と顕微鏡の焦点 A. 最大の核変形と核変形の緩和。最大の核の変形を計算する前に核の形態の背面のエッジが変形核の翻訳を修正する最初一致しました。ピペット先端部が抜け出る瞬間に核の形は引く前に初期の原子核の形にかぶせてありました。2 つの図形間の領域の違いを測定した Δ1。最大の核の変形は ΔA1 元の核の面積で割った値として定義されました。同様に、2 番目のパラメーター、Δ2、元の原子核の形でマイクロ ピペット剥離後最終的な定常状態の原子核の形を重ねることによって定義されるかもしれません。B. 焦点平面にセル、平面 B マイクロ ピペット チップを見つけるまで焦点の平面を移動します。画像の中に、マイクロ ピペットは右 (オレンジ色の矢印の方向) に翻訳しました。この図は、Neelamらから変更されています。15.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol><li>製造元のプロトコルごとマイクロインジェクターを入れます。</li>
	<li>対物レンズの上に液浸オイルの一滴を適用、浸漬オイル ドロッパーを使用します。</li>
	<li>料理を皿ホルダーにしっかりとクランプし、ステージ上に皿ホルダーをロードします。 注: セルは、実験を通じて CO2を 37 ° C、5% に保たれなければなりません。</li>
	<li>焦点 (平面 A図 1 b) にセルを持って目的の高さを調整します。</li>
	<li>目的のセルを検索する顕微鏡ステージに移動します。</li>
	<li>ピペット ホルダーをトップの位置に移動するマイクロマニピュレーターにジョイスティックを回転させます。0.5 μ m 径のヒント マイクロ ピペット ピペット ホルダーに読み込みます。<ol>
<li>ピペットへの細胞接着を避けるためには、あらかじめ室温で 0.3 mg/ml の 1 h の PLL g ペグ ソリューション マイクロ ピペット チップを扱います。任意の吸引圧力なし核にマイクロ ピペットを触れるし、核からピペットを翻訳密着性をテストします。密着性の不在は、核変形と翻訳の完全な欠如から識別できます。 注: パッケージを開く製造の提案に従ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細かい制御を調整することによって面 A と面 B のセルの上部の客観的焦点面を上げる (図 1 b、ステップ 2.4 を参照)。</li>
	<li>粗制御に変えればエンブリオバイオプシーに対応を設定します。ゆっくりピペットが焦点に完全にくるまをマイクロ ピペットのシルエット見て平面 B にマイクロ ピペットをもたらします。</li>
	<li>マイクロ ピペットのチップは、フォーカス、マニピュレーターを微調整に設定します。</li>
	<li>(平面 A、図 1 b) 細胞の赤道面に目標を下げるし、(図 1 b、破線ピペット) 平面の上約 15 μ m のマイクロ ピペットを下げます。</li>
	<li>圧が得られる; マイクロインジェクター on 補正圧力 (Pc)圧力を安定させるために数秒を待ちます。 注: 最適な圧セット ポイントはセルの種類および実験の特定の目的に依存します。ほとんどの場合、300 hPa は良い出発点になります。</li>
	<li>マイクロマニピュレーター パネルのクリーン設定を使用して、マイクロ ピペット チップから出てくる空気の泡を確認するためにチェックして、ピペットが詰まっていないことを確認します。</li>
	<li>先端は核の表面を軽く触れるまでマイクロ ピペットを徐々 に下げることによって、先端をセルに挿入します。 注: マイクロ ピペットを下げるとマイクロ ピペット チップのシルエットが焦点になるよう明確ななります。マイクロ ピペットに触れる核、前に上げる目的のフォーカス、核 (同じ x と y 座標、z 面の高い) とマイクロ ピペット チップを合わせます。フォーカスを核 (平面 A、図 1 b) の赤道面に戻り、マイクロ ピペット チップを徐々 に下げます。</li>
	<li>それにより大気中にマイクロ ピペット チューブの端を開くマイクロインジェクション システムから圧力供給管を切断してマイクロ ピペット チップと核膜のシールを作成します。この手順は、核の表面にPcに等しい負圧を作成します。</li>
	<li>顕微鏡画像コレクション ソフトウェアが画像を取得します。Avi ファイルの取得 (ビデオの) または nd 取得 (イメージ) をコレクションの画像ソフトで設定します。 注: 任意のイメージング ソフトウェアを取得、リアルタイムのビデオ画像や短い時間間隔でタイムラプス映像買収を設定します。</li>
	<li>対応するイメージング チャンネルに切り替え (すなわちGFP、RFP、等)、イメージングを開始。</li>
	<li>(右側、図 1 b) にセルの体からマイクロ ピペット チップを翻訳核は、マイクロ ピペットから外れるまで引っ張ります。 注: は、(ビューのフィールドの右側) に肯定的な x 方向のヒントを引き出します。引き率のプログラムやコンピューターによって制御されるジョイスティックを手動で移動することがでくことができます。引っ張って相関が見つかっていない率と核変形15を強制的に主に弾性応答を示唆しています。</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>利用できる基本的な画像処理ソフトウェアで画像解析を実行します。長さひずみ (Ɛ) または領域のひずみ (図 1 a) のいずれかによって核変形の程度を定量化することができます。式 1 を使用して長さひずみを定量化、L と L0はそれぞれ最大変形と初期位置で核の長さを表します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(関係式 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

彼らはいずれかの隔離された核 (核は細胞骨格から分離) を必要とするためピペット吸引16など、最新の方法のための挑戦は、細胞骨格に核の機械的統合を測定または核浮遊細胞 (細胞外の力、牽引力などは欠席)。力は、軸ひずみを膜17,18; に付着性のセルに適用することで、核に適用されています。ただし、この手法は、核の力が不明であるという事実によって制限されます。原子間力顕微鏡 (AFM) プローブは、そのまま細胞に核をインデントに使用されています。これらのオファーは、彼らが中に核の力学特性を明らかにする利点は、細胞骨格と統合されて。核12,13,14を特徴付けるため既存の体内手法を加える機械的付着細胞で核をプローブにしたまま簡単で堅牢な方法を開発しました。周囲の骨格に統合されて...

癌などの疾患は、核の形状と構造1,2, '' 核3,4の軟化に伴う一般的に変化を含みます。原子力機械変形抵抗は、隔離された核5に力を適用することで一般的に特徴づけられています。
細胞核は細胞骨格に Nucleoskeleton リンカーと細胞骨格 (バイオス) 複雑な6,7,8,9分子接続されます。その結果、核は、細胞骨格と、細胞-基質間の癒着、細胞外マトリックスを機械的に統合されています。機械的に付着性細胞の中の核を探るこの機械的統合への洞察力を提供できます。マイクロ ピペット吸引10、11、および原子間力顕微鏡12,13,14生きた細胞中の核を操作するメソッドが含まれます。最近生活付着性のセル15に核に直接機械的な力を適用する直接力プローブ (DFP) について述べる。
ここでは、我々 は付着性細胞の核に直接知られているナノ機械的な力を適用する顕微鏡施設で利用可能なインジェクション システムを使用する手順を概説します。Femtotip (0.5 μ m 径マイクロ ピペット チップ) がマウントされ、チューブでのインジェクション システムに接続されています。まで核の表面に隣接して、培養皿の表面に対して 45 ° の角度で配置されている、先端が低下します。チューブは切断し、核の表面に負の吸引圧を作成し、核の表面に対してマイクロ ピペット先端をシール大気開放します。マイクロ ピペット チップの翻訳を通じて核は変形し、最終的に (力の大きさ) によって、マイクロ ピペットを切り離します。この剥離は、核および細胞、によって出される、復元 (耐熱) 力、ピペットによって適用される吸引力の等しい場合に発生します。核の変位を測定することによって分析を行うことが長さひずみ (式 1)、または領域のひずみ (図 1 a)。

<table><tbody><tr><td>フルオロディッシュ</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>フェムトチップ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>エッペンドルフ</td><td>NA</td><td>販売終了、現行相当機種:InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>現行モデル FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan フッ素油浸 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF 油浸 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ドナーウシ血清 (DBS)</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 血清</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)</td><td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 ミディアムサプリメント</td></tr><tr><td>浸漬油タイプ LDF 非蛍光</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>対物レンズ用浸漬油&nbsp;</td></tr></tbody></table>

核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

核の機械的性質は、細胞で生成された機械的な力への応答を決定します。核が細胞骨格の分子に連続しているため付着細胞での力学的挙動を調べるための方法が必要です。ここでは、付着性細胞の核に直接力を適用するためのツールとして直接力プローブ (DFP) について述べる。我々 は、吸込みを伴う核の表面に細いピペットを添付します。マイクロ ピペットは、翻訳を変形させ、核を引き起こす核から変換されます。復元力が吸引力に等しい、核はデタッチし、弾性を緩和します。吸引圧が正確に知られているために、核の表面に働く力が知られています。このメソッドは、ナノの力が変形し、付着細胞で核を翻訳するのに十分なされ、力に抵抗する核を可能にする骨格の要素を明らかにしました。DFP を使用して、細胞内の核の力学特性に細胞や原子力部品の貢献を分析できます。

図 2 aは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞核の強制を示しています。マイクロ ピペット チップの右側に翻訳核変形、最終的にマイクロ ピペット チップから切り離します。吸引力 (図 2 b) とともに増加する核の長さのひずみが見られます。核 (端を引っ張ってマイクロ ピペット) の前面の端を形成する核の突起とトレーリング エッジが元の位置からずれています。突起の長さはトレーリング エッジの変位 (図 2)、核と細胞質の間の緊密な統合を示唆よりも大きくなります。時間スケールが核の前面の端のための短いリラクゼーション (&lt; 1 s)、および核の背面の端 (&lt; 2 s) (図 2 D)。
<img alt="F...

このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

この方法は、原子力力学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、細胞内の核を変形させるのに必要な力はどれくらいですか?細胞および核成分は、変形に対する核抵抗性にどのような役割を果たしていますか?それとも、細胞構造との核結合は細胞の種類によって異なりますか?この技術の主な利点は、プロービング力を適用して、生きた接着細胞内の統合核細胞骨格を変形させることができることです。この方法は、NIH-3T3細胞の核機械的特性に関する洞察を提供するために使用されてきましたが、Hutchinson-Gilford老人細胞の核機械的特性の調査など、あらゆる接着細胞タイプにも適用できます。この手順を開始するには、35ミリメートルのガラス底皿に5マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンをコーティングします。次に、10%ドナーウシ血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEMでNIH 3T3線維芽細胞を、コーティングされた皿上で37°Cで所望の合流性になるまで培養します。実験の直前に、PBSで細胞を2回洗浄し、続いて完全増殖培地で1回洗浄します。その後、ガラス底皿に3ミリリットルの完全成長培地を加えます。この手順では、マイクロインジェクターの電源を入れます。液浸油スポイトを使用して、対物レンズに液浸油を一滴垂らします。次に、ディッシュをディッシュホルダーにしっかりと固定し、ディッシュホルダーをステージにロードします。実験中は、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%に維持する必要があることに注意してください。次に、対物レンズの高さを調整して、セルに焦点を合わせます。顕微鏡ステージを動かして、目的の細胞を見つけます。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットホルダーを最も高い位置に移動します。その後、直径0.5マイクロメートルのチップが付いたマイクロピペットをピペットホルダーにロードします。次に、ファインコントロールを調整して、対物レンズの焦点面を平面Aより上に、セルの上部を平面Bに上げます。次に、マイクロマニピュレータを粗い制御位置にセットします。マイクロピペットのシルエットを観察しながら、マイクロピペットに完全にピントが合うまで、マイクロピペットをゆっくりと平面Bまで下げます。マイクロピペットの先端にピントが合ったら、マイクロマニピュレーターを微調整に設定します。次に、対物レンズを細胞の赤道面まで下げ、マイクロピペットをその約15マイクロメートル上に下げます。マイクロインジェクターの補償圧力を希望の圧力に設定します。圧力が安定するまで数秒待ちます。ピペットの先端が壊れたり詰まったりしていないか確認することが重要です。そうしないと、力の測定が不正確になります。マイクロマニピュレーターパネルのクリーンセッティングを使用してマイクロピペットが詰まっていないことを確認し、マイクロピペットの先端から気泡が出てくることを確認してください。次に、マイクロピペットの先端を核表面に軽く触れるまで細胞に挿入します。マイクロピペットの先端と核膜の間にシールを作り、圧力供給チューブをマイクロインジェクションシステムから外し、マイクロピペットの端を大気に開きます。このステップにより、原子核表面の補償圧力に等しい負圧が発生します。次に、画像収集ソフトを開きます。画像収集ソフトウェアで、ビデオ用のAVI集録または画像のND集録を設定します。次に、対応する蛍光イメージングチャンネルに切り替えて、イメージングを開始します。核がマイクロピペットから離れるまで、マイクロピペットの先端を細胞の本体から離します。この図は、NIH 3T3マウス線維芽細胞核の強制力を示しています。マイクロピペットの先端が右に移動すると、核が変形し、最終的にはマイクロピペットの先端から外れます。原子核の長さひずみは、吸引力の増加とともに増加することがわかります。原子核の前縁は核の突起を形成し、後縁は元の位置から変位します。突起の長さは後縁の変位よりもはるかに大きく、核と周囲の細胞質との間に密接な統合があることを示唆しています。時間スケールは、核前端と核後端の緩和の略です。直接力プローブを使用して、核内および細胞骨格構造の変形に対する核の抵抗への寄与を決定しました。蛍光画像は、示された条件での前後の核のオーバーレイを示しました。F-アクチン破壊または微小管破壊後に核の変形または翻訳に有意な差は見られませんでしたが、siRNAベースのノックダウンによってメンテンの発現を減少させると、核の翻訳と変形が有意に増加しました。このことは、線維芽細胞のメンテン中間フィラメントが、核が局所的な力に抵抗するのを助けた主要な細胞骨格要素であることを示唆しています。このビデオを見れば、生きた接着細胞の核に制御された既知の力を加える方法についてよく理解できるはずです。

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この論文では、DNAベースのテンションプローブを使用して免疫細胞によって加えられる受容体力を画像化するための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、受容体の力&gt;4.7pNをリアルタイムでマッピングし、時間の経過とともに力を積分することができます。...

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。...

3D磁力アクチュエータと多機能蛍光イメージングを組み合わせて核メカノバイオロジーを研究

HCNチャネルとそれらの補助サブユニット間の相互作用は、大うつ病性障害における治療標的として同定されています。ここで、このタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための蛍光偏光ベースの方法が提供されます。...

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

学ぶマイクロピペット法による細胞核への力印加技術。接着細胞における核の機械的特性と変形抵抗メカニズムを評価し、細胞骨格との力学的統合を解析する方法です。

核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

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