Name: ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶImageJを用いた蛍光タンパク質の公平な定量解析法。ショウジョウバエの神経変性モデルにおけるタンパク凝集体とオートファジー流動態を正確に測定し、選択バイアスを最小化して再現性の高い細胞生物学研究を支援します。

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この作品は、シーラとデビッド フエンテ神経因性疼痛研究プログラム大学院研究員 (J.M.B.) に支えられて、ロイス教皇生活フェロー プログラム (セ、Y.Z.、および J.M.B.) (セ) にスナイダー ・ ロビンソン財団を経てフェローシップ博士ジョン T.(セ) にマクドナルド財団契約、(R.G.Z.)、健康 (NIH) の HHSN268201300038C、R21GM119018、および R56NS095893 の国立衛生研究所からの助成金と泰山学者プロジェクトによって (山東省、中国の人々 の共和国) (R.G.Z.)。

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著者が明らかに何もありません。

ここで説明されているプロトコルは、しっかりと再現性をもって量的蛍光ベースのイメージングで可視化した細胞生物学的プロセスに使用できます。生物学的文脈と技術的な制限は、実験的なデザインを導くため慎重に検討する必要があります。蛍光マーカー、興味の細胞レベル下の構造の形態と強度によって背景の上区別する必要があります免疫組織化学的、染料ベース、または遺伝的に表現されるかどうか。ショウジョウバエの標的遺伝子の発現をドライブにUA/GAL4システムを用い。次に示す例は蛋白質の集合と中枢神経系におけるオートファジーを調査するのに UA エンハンサーの制御の下で蛍光付けられた蛋白質の転写をアクティブにするのにトランスジェニック系統 GAL4 ドライバーを使用しました。実験の UAS 遺伝子の同時発現が蛍光レポーター遺伝子と共に必要な場合に、対照群にも GAL4 投与量、たとえばの制御を取るに足らない遺伝子の過剰発現の co を含める必要があります。UA GFPまたはUA lacZ。標準化試料ショウジョウバエ中枢神経系および郭清, 固定, マウントを汚す抗体からの視覚...

神経変性疾患は毎年数百万人に影響を与えるし、高齢化人口1の発生率が増加しています。各神経変性疾患では、ユニークな病因を持っているが、誤って折りたたまれたタンパク質の凝集およびプロテオステイシス ネットワークの内訳は、これらの疾患の多くの共通の病理学的特徴です。これらの基礎的かつ相互に関連するプロセスの中断がゆがんで行く方法を解明神経の機能不全や細胞の死に貢献する治療上の介在を導くと同様、神経変性疾患を理解することにとって重要です。蛍光ベースのイメージング ニューロンにおけるこれらの複雑で動的なプロセスの調査と神経細胞生物学の私達の理解に大きく貢献しています。蛍光付けられた蛋白質の分析は挑戦的な特に実験生体内で、コンパクトな組織、多様な細胞の種類、形態の多様性などを行った。手動でアシスト定量化手頃な価格と簡単な多くの場合時間がかかり、人間バイアスの対象です。したがって、イメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性があります。
蛍光イメージング研究の実験モデルから定量的なデータを抽出する強力で自由にアクセスできる画像処理ソフトウェア2,3, フィジー/ImageJ を使用してワークフローをシンプルかつ適応を概説しました。ショウジョウバエを用いた神経変性疾患。蛋白質の集合とオートファジーのフラックスを定量化するこのプロトコルに従うことによって-2 つのセルの神経変性病に関連性の高い生物学的特徴-感度と再現性このアプローチのデモンストレーションを行った。ショウジョウバエ視葉における蛍光タグ変異ハンチンチン (Htt) タンパク質の解析では、数、サイズ、およびタンパク質凝集体の強度を明らかにしました。4コンパートメント環境に応じて異なる発光信号を表示するショウジョウバエ視覚系オートファジー フラックスのタンデム蛍光レポーターを可視化。タンデム記者のレシオ メトリック解析オートファゴソーム形成、成熟およびトランスポート、リソソームで分解するオートファジー ・ リソソーム フラックスの定量的かつ包括的なビューの許可し、脆弱性をさらに強調神経変性条件で破壊のコンパートメント。重要なは、両方の分析我々 はし無意識のバイアスを最小限に抑えるため、サンプリング力を高める同様の研究との比較を容易にする標準プロトコル半自動閾値処理と領域分割の手順が実装されます。簡単なワークフローは強力なフィジー/ImageJ プラグイン (数学的アルゴリズムに基づくコンピューター科学者によって開発された) のためにかと生命科学コミュニティにアクセス可能。

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 シリコーン エラストマー キット</td><td>ダウ コーニング コーポレーション</td><td>PF184250</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>ファルコン 35 mm TC処理されていない イージーグリップ スタイル 細菌学 ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>351008</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-20</td><td>解剖ツール</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S3014</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>リン酸二塩基酸ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S5136</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>リン酸カリウム モノベーシック</td><td>シグマ</td><td>P5655</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>トリトン&nbsp;X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>洗浄剤および抗体インキュベーター溶液.&nbsp;</td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td>固定</td></tr><tr><td>用使い捨て微量遠心チューブ (0.5mL、青)</td> <td>VWR</td><td>89000-022</td><td>固定、洗浄、抗体インキュベーター。</td></tr><tr><td>プレーンおよびつや消しマイクロスライド(25回;75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>共焦点イメージング用スライド</td></tr><tr><td>マイクロカバーグラス、長方形 (22回;40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>共焦点イメージング用スライド</td></tr><tr><td>ラバーセメント</td><td>スライム</td><td>1051-A</td><td>マウンティング</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 退色防止マウンティング Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>スコッチマジック810インビジブルテープ取付 (19mm;25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Mounting</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Antibody incubaton</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td>核酸染色。脱イオン水に溶解して5 mg / mLのストック溶液を作り、-80°Cで保存します。PBTx中のg / mL。</td></tr><tr><td>3.5X-90Xステレオズーム検査工業用顕微鏡</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>解剖スコープ。6W LEDデュアルグースネックイルミネーター</td></tr><tr><td>を装備 ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>SCF_MPI_CBGプラグイン付き(バージョン1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組換えコンストラクト</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

imagej を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

神経変性疾患の有病率上昇、ますます神経機能障害や損失につながる基本的な病態を理解することが重要です。まだイメージング研究から定量データを抽出するための公平な再現性のある、そしてアクセスのアプローチの必要性はまだ蛍光ベースのイメージング ツールとテクノロジを使用細胞神経生物学プロセスの前例のない分析.神経変性疾患のショウジョウバエモデルを用いた蛍光イメージング研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。具体的には、フィジー/ImageJ を使用した 2 つの細胞プロセスの分析に従って簡単、半自動化されたアプローチについて述べる: 最初に、私たち定量化タンパク質集計コンテンツとプロファイルを使用して蛍光タグ変異ショウジョウバエ視葉でhuntingtin 蛋白質;第二に、我々 はオートファジーのタンデム蛍光レポーターのレシオ メトリックに基づく定量化とショウジョウバエ視覚系におけるオートファジー ・ リソソーム フラックスを査定し、なさい。重要なは、ここで説明したプロトコルは、すべての蛍光灯の構造分析選択バイアスを最小化し、微妙な比較の解像度を上げるように半自動抽出法の手順を説明します。このアプローチは、他の細胞生物学的構造の分析の延長が可能し、同様、膜結合区画タンパク質涙点 (ストレス顆粒とシナプス複合体) などの神経変性疾患に関与するプロセス (ミトコンドリアと膜輸送小胞)。まだ適応参照画像の解析と定量化のためのポイントし、フィールド間で信頼性と再現性を促進し、最終的に神経変性のメカニズムの理解を高めるため、標準化されたこのメソッドを提供します。

数、地域、およびショウジョウバエ視葉の蛍光タグ変異 Htt 骨材の強度の定量化
ハンチントン病、タグ付きの RFP の突然変異のショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるミスフォールド蛋白質の集合を調査する非病理学 (UA RFP hHttQ15) または病理学的拡張 (と HttUAS-RFP-hHttQ138) 膜 GFP (UA mCD8::GFP)11名あったパン神経ドライバー elav GAL4下共発現。雌成虫羽化 (DAE) 後 2 日の脳解剖、固定、DAPI 染色プロトコルのセクション 2 によると。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、油浸対物レンズ、1.30 開口数 (NA)、ピクセルあたり 8.0 μ 秒のスキャン速度と 1024 の空間解像度を 1024 ピクセル (ピクセルあたり 12 ビッ...

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

この方法は、ショウジョウバエの神経変性モデルにおける複雑で動的な細胞生物学的プロセスを抽出するために、蛍光ベースのイメージング研究から定量データを抽出するために開発されました。この手法の主な利点は、選択バイアスを最小限に抑え、サンプリングパワーを最大化し、フィールド全体で再現性を達成するための適応性のある半自動画像解析ワークフローです。このアプローチは、神経変性に関与する他のタンパク質性涙点および膜結合コンパートメントの分析に拡張でき、最終的には神経変性疾患のメカニズムの理解を深めます。実体顕微鏡下での解剖中に椎弓板を無傷に保つには、2つの鉗子を網膜の下にスライドさせ、目の真ん中をそっと引き裂いて網膜を取り除きます。鉗子を椎弓板の表面と平行に保つと、椎弓板に付着している残りの網膜組織を引き離します。各グループについて3〜5個の脳を解剖し、適切な固定剤を含む微量遠心チューブに脳を室温で15分間、穏やかに揺さぶって移します。PBSとTriton X-100(PBTx)を併用して15分間洗浄を3回行った後、最後の洗浄液をPBTxで希釈した目的の一次抗体と5%正常ヤギ血清に交換し、アリコートミキサーで摂氏4度のアリコートミキサーで一晩インキュベートします。翌朝、PBTxで15分間の洗浄を3回行い、PBTxで希釈した適切な二次抗体と5%正常ヤギ血清で脳を室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されているように脳を3回洗浄し、組織サンプルごとに1つの顕微鏡スライドの中央にある2枚の透明テープの間に封入剤を滴下します。ブレインを封入剤に1〜2分間入れます。ティッシュが透明になったら、ピペットを使用して、両側から封入剤を慎重に取り除きます。染色された組織を画像化するには、新鮮な封入剤を脳に一滴垂らし、サンプルをカバーガラスで慎重に重ねます。カバーガラスの端をゴムセメントで密封し、スライドを室温で20分間風乾します。次に、顕微鏡で試料を観察し、蛍光顕微鏡の画像検出器制御を調整して、試料の最高のダイナミックレンジで最高のS/N比を捉えます。設定が最適化されたら、別のグループの標本を表示して、設定が実験全体で適切であることを確認します。その後、最初の標本を画像化し、取得パラメータや空間キャリブレーションなどのメタデータを保持できるファイルタイプとして画像を保存するように注意して行うことができます。画像を分析するには、フィジーで画像を開き、[Bio-formats Import Options] ダイアログボックスから [View Stack with Hyperstack] を選択し、カラーモードを [グレースケール] に設定します。Cスクロールバーを使用してチャンネルを表示し、Zスクロールバーを使用して焦点面を移動するために、試料全体で標準化された関心領域として使用できるマーカーチャンネルに基づいて領域を特定します。イメージ解析を簡略化するには、チャネルと焦点面を含む新しいイメージを生成し、[イメージ] と [複製] を選択します。目的のチャンネルとスライスを設定し、選択内容を反映するようにファイル名を変更します。以前に決定された選択基準に基づいて、選択ツールを使用して標準化された関心領域を手動で選択します。「分析」、「ツール」、「Region of Interest Manager」、および「Add」をクリックして、関心領域を「Region of Interest Manager」に追加します。次に、[その他] と [保存] をクリックし、関心領域を反映するようにファイルに名前を付けます。画像を前処理するには、「フィルター」の「処理」をクリックし、適切なフィルターを選択します。ここでは、セグメンテーション中に対象構造の検出を支援するために、エッジを保持しながらノイズを低減するフィルター設定を選択します。前処理された画像をフィジーでアクティブにした状態で、[SCF]、[ラベリング]、および[インタラクティブH_Watershed]をクリックします。コントロールパネルから、シードダイナミクス、強度しきい値、ピークフラッディングを調整して、セグメンテーションを最適化します。セグメンテーション結果が最適化されたら、[エクスポート]、[リージョン]、[マスク]、[エクスポート]の順に選択して、集水域の結果のバイナリ イメージを生成します。保存した標準化された対象領域を開きます。[関心領域マネージャー] から、関心領域識別子を選択して、イメージ内の標準化された関心領域に特徴抽出を制限します。バイナリ集水域マスクで関心領域がアクティブになっている状態で、[分析]、[粒子の分析]、および [マネージャーに追加] を選択してフィーチャを抽出し、セグメンテーション中に描画された各構造の粒子識別子を [関心領域マネージャー] に追加します。次に、識別子の選択が解除され、すべてのパーティクルがzipファイルに保存されるように注意して、追加したパーティクルを保存します。次に、前処理されたRAW画像を開き、目的の構造をキャプチャするために使用されたチャネルまでスクロールします。フィーチャ抽出から取得したパーティクルを開き、[Region of Interest Manager] で [Show All] を選択して、各パーティクルのアウトラインをイメージにオーバーレイします。「解析と測定値の設定」をクリックし、適切な実験測定値を設定します。次に、Region of Interest Managerから「Measure」を選択し、結果をコピーして適切なスプレッドシートプログラムに貼り付け、コンパイルとさらなる計算を行います。標準化された焦点面からショウジョウバエの視葉を通る半自動的にセグメント化されたRFPハンチンチン凝集体の数を定量すると、疾患の原因となるハンチントンQ138拡大によるタンパク質凝集体の蓄積における非病原性ハンチンチンQ15拡大の拡散発現が明らかになります。Huntington Q138を発現する5つの異なる光学ローブの標準化された焦点面から得られたすべての凝集体のサイズと強度プロファイルは、このワークフローの堅牢性と再現性を示しています。画像取得中にアグリゲートが露光オーバーになると、アグリゲートのサイズと数の定量化は、理想的な露光で捕捉されたアグリゲートに匹敵します。ただし、露出オーバーの集合体の強度は、飽和ピクセルが最大強度値を示すため、サイズの関数になります。いくつかのオートファジー関連またはAtg8陽性構造にわたるmCherryおよびGFP強度の可視化により、両方の蛍光色素の高強度がオートファゴソームを示すレポーターの違いが明らかになります。高mCherryと低GFPは、GFPがこの酸性コンパートメントで急冷されるため、リソソームとの融合を示します。そして最後に、mCherryが低いことは、リソソーム内の分解を反映しています。半自動的にセグメント化された各 mCherry Atg8 ポジティブパーティクルの平均蛍光色素強度から生成された散布図は、オートファジーリソソーム経路を通るフラックスを示しており、象限解析によって個別のステップに分離できます。この手順を試行する際は、画像解析ステップのユーザー定義パラメータがアプリケーションに大きく依存することを覚えておくことが重要です。そのため、試料間の一貫性と比較可能性を確保するために、ワークフローを文書化するように注意する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

このビデオでは、遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量を示しています。脳を固定し、洗浄し、埋込前に退色防止剤で処理します。画像は共焦点顕微鏡を使用して取得され、定量化されて変異タンパク質凝集体の伝達を観察します。...

遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。...

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郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

病原性タンパク質凝集体がプリオンのようなプロパティを持つセルの間に広がって神経変性疾患に関連する考えを支持する証拠を蓄積します。ここでは、モデル生物、ショウジョウバエのプリオンのような骨材の細胞-細胞拡散の可視化を可能にする手法について述べる。...

キイロショウジョウバエにおけるプリオン様蛋白質集合体の細胞間伝達を監視

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC)...

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

ここでは、eGFP蛍光を用いた ショウジョウバエ...

eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

この研究では、斬首、固定、凍結切片、蛍光染色、免疫染色、およびイメージングを含む組織処理の簡略化されたプロトコルを提示します。これらは共焦点および多光子イメージングに拡張できます。この方法は、複雑な解剖に匹敵する有効性を維持し、高度な運動能力の必要性を回避します。定量的な画像分析は、広範な調査の可能性を提供します。...

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

学ぶImageJを用いた蛍光タンパク質の公平な定量解析法。ショウジョウバエの神経変性モデルにおけるタンパク凝集体とオートファジー流動態を正確に測定し、選択バイアスを最小化して再現性の高い細胞生物学研究を支援します。

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

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