生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系

この方法では、アブラムシの培養の一般的な手順とアブラムシの遺伝子分析の手順について説明します。これらの方法は、アブラムシの進化と生態学、およびアブラムシの生物学の根底にある分子メカニズムにおける重要な質問に答えるために適用できます。この手法の主な利点は、一般的にほとんどのアブラムシ種に適用でき、比較的低コストで実行できることです。

土壌が井戸の上部に達するように注意しながら、標準的な苗トレイに発芽混合土壌を充填することから始めます。すべての井戸が満たされたら、各井戸の土壌に3センチの深さの穴を開け、各穴に1つの種子を置きます。種子を覆う土壌が飽和するまで細胞に水をやり、トレイを温室に置き、毎日から隔日で水をまきます。

苗木が成長すると、最初の完全な葉のセットが、縁から約5センチメートル下まで、4インチの丸い鉢を培養土で満たします。鉢の底に達するのに十分な深さの土に全体を作り、成熟した苗を手でそっとすくい取り、新しい鉢の穴の奥深くに置きます。次に、苗を土で覆い、適度な土壌水分レベルを維持するために、毎日から隔日で苗に水をやります。

植物が少なくとも3〜4セットの完全な葉を育て、高さが少なくとも10センチメートルになったら、不要な害虫がないか植物を手動で検査し、マウスピペットを使用して、収集された単一の繁殖フィールドである成虫のアブラムシを最初の植物の葉に慎重に移し、アイソクローンラインを作成します。すべてのアブラムシが移されたら、カスタムメイドのカップケージで植物をしっかりと覆い、アブラムシが蔓延した植物を制御された環境チャンバーに置きます。ストックの個体数を維持するために、マウスピペットを使用して、1〜3匹の2番目または3番目の幼虫と1匹の成虫の老化アブラムシを毎週新しい植物に安全に移します。

そして、示されているように、各植物を新しい培養用のカップケージで覆います。単一の成体アブラムシからのDNA抽出の場合は、液体窒素を含む滅菌済みの1.5ミリリットルの微量遠心チューブの底近くにアブラムシを置き、乳棒でアブラムシを挽きます。次に、100マイクロリットルの溶解バッファーを微量遠心チューブに加え、破砕したアブラムシをサンプルが目に見えて崩壊するまで粉砕し続けます。

乳棒をさらに100マイクロリットルの溶解緩衝液で洗い、粉砕したアブラムシを摂氏65度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、14マイクロリットルのaemulor酢酸カリウムをチューブに加え、反転させて混合します。氷上で30分後、遠心分離によって細胞の破片を収集し、ペレットを乱さずに上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

上清に200マイクロリットルの冷たい100%分子グレードのエタノールを加え、チューブを反転させて混合します。室温で15分後、沈殿したDNAを遠心分離により回収し、ピペットでエタノールを除去します。ペレットを200マイクロリットルの冷たい70%分子グレードのエタノールに再懸濁し、フリックして2回目の遠心分離洗浄を行います。

そして、ペレットを200マイクロリットルの新鮮で冷たい100%分子グレードのエタノールに再懸濁します。3回目の遠心分離後、チューブをティッシュペーパーの上に水平に置き、5〜10分間風乾させます。そして、DNAペレットを80マイクロリットルの低トリスEDTAに再懸濁します。

次に、再懸濁したDNAを分光光度計で定量し、残りのサンプルを摂氏4度で保存します。示されているように、最大5匹の成虫アブラムシを液体窒素で粉砕した後、サンプルをヒュームフードに移し、800マイクロリットルのグアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルム抽出試薬をサンプルチューブに加えます。サンプルを乳棒でホモジナイズし、ホモジネートを室温で5分間インキュベートします。

次に、160マイクロリットルのクロロホルムをサンプルに加え、続いて手で15秒間激しく振とうします。次に、サンプルを室温で2〜3分間インキュベートし、遠心分離して抽出したRNAを収集します。RNAを沈殿させるには、中間相を乱さずに水相を新しいRNSフリー微量遠心チューブに移し、RNAに400マイクロリットルのイソプロパノールを添加します。

マイナス20°Cで10分間インキュベートした後、沈殿したRNAを遠心分離して回収します。次に、ジエチルピロカーボネート処理水で1ミリリットルの75%エタノールでサンプルを2回洗浄し、ゆっくりとボルテックスして遠心分離してフェノール汚染物質を除去します。2回目の洗浄後、主に滅菌ベンチでペレットを5〜10分間風乾し、RNAペレットを30マイクロリットルの超純水に穏やかにピペッティングして溶解し、摂氏55〜60度で10〜15分間インキュベートします。

種子は、季節にもよりますが、植え替えるのに十分な大きさに成長するのに約2〜4週間かかります。植え替えられた苗木は、アブラムシの培養に最適なサイズに成長するのにさらに2〜4週間かかります。成虫のアイニアアイは、暗いカウダによって区別され、翼がないか翼があるかのどちらかです。

発達中の翼パッドは、ニンフが3番目のインスターに達すると見えるようになります。単一の成体アイニアアイは、DNAのマイクロリットルあたり約100〜200ナノグラム、RNAのマイクロリットルあたり150〜300ナノグラムを生成します。その後、異なる処理条件下での候補遺伝子の相対発現を計算することができます。

この手順を試みるときは、アイソクローナル株を汚染しないことが重要です。また、アブラムシの品質は植物の品質に大きく依存することを忘れないでください。この手順に続いて、アブラムシの生物学の根底にある分子メカニズムについての質問に答えるために、他の抽出およびシーケンシング技術を実行することができます。