Name: 生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぶ アブラムシの培養と遺伝子発現解析の手法。Aphis neriiを用いた植物・昆虫相互作用の研究に適用でき、低コストで多種のアブラムシに応用可能です。生態学と進化生物学の基礎研究に貢献します。

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著者が明らかに何もありません。

長いこと、ディアボルスA. neriiパターンと植物の防御、特に化学隔離18,37への抵抗のメカニズムに洞察力を提供できるが認識されています。ゲノム リソースの数は、 A. nerii10, A. neriiを使用して、モデルとして生態学的機能のゲノム研究の新しい機会を提供するため最近浮上しています。アブラムシ、植物文化のこの種の今後の作業がられるゲノムおよび機能の生態学的アプローチを活用した研究を伴う可能性が高いことを前提に、分子/ゲノム技術の基本的なプロトコルの概要を説明します。カルデノライド解毒とA. neriiで隔離の意義とメカニズムについて多くの未解決の問題が残っています。RNAi などの方法によってノックダウン式または遺伝子編集アプローチをこの点で貴重な証明します。
アブラムシを培養する際の課題の 1 つは繁殖と分散戦略のための驚異的な...

アブラムシは、世界中の多様な植物家族の植民地 hemimetabolous、小さな昆虫です。最も特にから不足している栄養素を供給する酵母や細菌の共生とその偏栄養共生と離散 polyphenisms 循環単為生殖を含む複雑なライフ サイクルのいくつかの機能の独特であります。sap の1工場の彼らの食事療法。ほとんどアブラムシはホスト植物の専門家、いくつか種がどちらか直接にある作物で、かなりの経済ダメージを与える重要な作物害虫や病原体やウイルスを介して彼らはベクトル2。最初アブラムシにおけるゲノム学 2010 年エンドウ アブラムシエンドウヒゲナガアブラムシ3、パブリケーション アブラムシの生物学の研究で重要なマイルス トーンをマークは、昆虫のアドレス指定についての遺伝子資源を提供されているため良いコントロールの戦略4につながる可能性のあるものを含む、草食性のライフ スタイルに適応します。それ以来、追加ゲノム リソース大豆アブラムシワタアブラムシ グリシン5注釈ゲノムと別の 3 アブラムシ種 (モモアカアブラムシの公に利用可能な全ゲノム リソースのパブリケーションと蓄積してきたcerasi (ブラック チェリー アブラムシ)、モモアカアブラムシ(桃ジャガイモ アブラムシ)した padi (鳥チェリー エンバク アブラムシ)6。貴重なデ novoトランスクリプトーム リソースが他のアブラムシの数も利用可能 (e.g.,Aphis gossypii (綿アブラムシ)7, Sitobion 褐(穀物アブラムシ)8, Cinarapinitabulaeformis (松アブラムシ)9、ワタアブラムシ nerii (トウワタ キョウチクトウ アブラムシ)10)。
アブラムシは植物11植物昆虫相互作用と生命の生態学の私達の理解に永続的な貢献をしたも。アブラムシが特に重要な貢献をした 1 つの領域は、宿主植物の化学生態学の私達の理解にあります。共同植物の防御、自分の選ぶも克服する植物の防御、およびいくつかの草食性昆虫表現多様な適応は利益12,13,14です。たとえば、トウワタ キョウチクトウ モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ neriiは、明るい黄色、侵襲的なアブラムシ世界中の温帯、熱帯地域は、トウワタ家族 (キョウチクトウ科) 植物の定着です。キョウチクトウ科の植物は、乳状のラテックスとカチオン キャリア Na, K-atpase をバインドし、ジェネラ リスト草食動物15,に効果的な抑止力は、cardenolides として知られている強心配糖体などを含む、多様な化学防御を進化しています。16. トウワタ専門家エクスプレス、cardenolides に対する抵抗性のさまざまなモード、選択的または受動的蓄積や捕食を阻止するための手段としてまたは他の利点の17のための組織の cardenolides を変更あり。A. neriiはこの方法で cardenolides を隔離するメカニズムと機能上の利点のまま不明10,18です。
手で、ゲノム リソース、 A. neriiを提供します優れた実験モデル有毒な宿主植物との専門家の化学生態学的相互作用に関与する分子および遺伝のメカニズムの調査のため草食動物。A. nerii cardenolides19, その時以来の隔離に焦点を当てたの初期の研究のいくつか、 a. neriiの研究が広範な進化と生態学的な質問に洞察力を提供している注目に値する侵襲的な昆虫20と草食動物密度21のボトムアップとトップダウンの規則間の相互作用の遺伝的構造を含みます。A. neriiはこうして特に広範な昆虫植物相互作用の研究のための実験モデルとしての良い候補です。重要なA. neriiと任意の研究の成功に注意カルチャですアブラムシの植物のアブラムシが依存の文化を含む集団として高品質弔データの効率的な生成。私たちの目標は、両方を介してリーダーを指導することです。世代やメンテナンス、温室効果と研究所、DNA と RNA の抽出、マイクロ サテライト解析、 de novoトランスクリプトーム アセンブリおよび注釈、トランスクリプトームで植物とアブラムシの文化のための方法を以下に発現解析と qPCR 性遺伝子が発現。一方、これらのメソッドは、 A. neriiの書かれている、培養、抽出、および分析の一般的な方法をさまざまな種のアブラムシに拡張できます。

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard 発芽ミックス</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2" x 4" ラウンド スタンダード ポット</td><td>アンダーソン ポット</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15596026 SuperScript&reg;III ファーストストランド合成キット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

アブラムシは宿主植物と昆虫の相互作用をめぐる質問に共生の進化と polyphenisms の開発に至る生物の質問の様々 な優れた実験的モデルです。アブラムシ数種の遺伝子資源があり、非モデル生物のゲノムを欠いているに延長されるトランスクリプトーム研究次世代シーケンシングの進化により、です。さらに、アブラムシの文化はフィールドから収集し、生態学的な遺伝学の間のギャップを埋めるための生物・分子の実験で使用する実験室で飼育できます。最後に、多くのアブラムシは無性再現遺伝子型の比較を可能にする永久的な単為のライフ サイクルでの優先ホスト植物研究所で維持できます。ワタアブラムシ nerii、トウワタ キョウチクトウ アブラムシは、生物分子の実験を使用して有毒な植物と昆虫の相互作用を研究するようなの 1 つのモデルを提供します。世代と温室効果と研究所、DNA および RNA の抽出、マイクロ サテライト解析、 de novoトランスクリプトーム アセンブリおよび注釈、トランスクリプトーム発現の植物とアブラムシの文化の維持の方法分析、および特異的発現遺伝子の qPCR 検証は概説し、ここで説明します。

植物の文化:種子は季節に応じて約 2 〜 4 週間の時間がかかります、大きく十分に鉢植え (図 1A)。再鉢植え苗は、アブラムシの文化 (図 1B) の最適なサイズに成長する別の 2 〜 4 週間かかります。
アブラムシ文化:大人A. neriiいくつかの暗い馬尾によって区別され、翼のあるかもしれない (無翅、図 3A、 B) または翼 (翼、図 3C, D)。ニン...

アブラムシワタアブラムシ nerii付いているバシクルモン家族 (Apocyanaceae) で強く擁護した植物の定着植物昆虫の相互作用を研究する多くの機会を提供しています。ここでは、我々 の文化と生成分子の解析植物とアブラムシの保守のためのプロトコルのシリーズの紹介とA. nerii用プロファイルー データ。

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

この方法では、アブラムシの培養の一般的な手順とアブラムシの遺伝子分析の手順について説明します。これらの方法は、アブラムシの進化と生態学、およびアブラムシの生物学の根底にある分子メカニズムにおける重要な質問に答えるために適用できます。この手法の主な利点は、一般的にほとんどのアブラムシ種に適用でき、比較的低コストで実行できることです。土壌が井戸の上部に達するように注意しながら、標準的な苗トレイに発芽混合土壌を充填することから始めます。すべての井戸が満たされたら、各井戸の土壌に3センチの深さの穴を開け、各穴に1つの種子を置きます。種子を覆う土壌が飽和するまで細胞に水をやり、トレイを温室に置き、毎日から隔日で水をまきます。苗木が成長すると、最初の完全な葉のセットが、縁から約5センチメートル下まで、4インチの丸い鉢を培養土で満たします。鉢の底に達するのに十分な深さの土に全体を作り、成熟した苗を手でそっとすくい取り、新しい鉢の穴の奥深くに置きます。次に、苗を土で覆い、適度な土壌水分レベルを維持するために、毎日から隔日で苗に水をやります。植物が少なくとも3〜4セットの完全な葉を育て、高さが少なくとも10センチメートルになったら、不要な害虫がないか植物を手動で検査し、マウスピペットを使用して、収集された単一の繁殖フィールドである成虫のアブラムシを最初の植物の葉に慎重に移し、アイソクローンラインを作成します。すべてのアブラムシが移されたら、カスタムメイドのカップケージで植物をしっかりと覆い、アブラムシが蔓延した植物を制御された環境チャンバーに置きます。ストックの個体数を維持するために、マウスピペットを使用して、1〜3匹の2番目または3番目の幼虫と1匹の成虫の老化アブラムシを毎週新しい植物に安全に移します。そして、示されているように、各植物を新しい培養用のカップケージで覆います。単一の成体アブラムシからのDNA抽出の場合は、液体窒素を含む滅菌済みの1.5ミリリットルの微量遠心チューブの底近くにアブラムシを置き、乳棒でアブラムシを挽きます。次に、100マイクロリットルの溶解バッファーを微量遠心チューブに加え、破砕したアブラムシをサンプルが目に見えて崩壊するまで粉砕し続けます。乳棒をさらに100マイクロリットルの溶解緩衝液で洗い、粉砕したアブラムシを摂氏65度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、14マイクロリットルのaemulor酢酸カリウムをチューブに加え、反転させて混合します。氷上で30分後、遠心分離によって細胞の破片を収集し、ペレットを乱さずに上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。上清に200マイクロリットルの冷たい100%分子グレードのエタノールを加え、チューブを反転させて混合します。室温で15分後、沈殿したDNAを遠心分離により回収し、ピペットでエタノールを除去します。ペレットを200マイクロリットルの冷たい70%分子グレードのエタノールに再懸濁し、フリックして2回目の遠心分離洗浄を行います。そして、ペレットを200マイクロリットルの新鮮で冷たい100%分子グレードのエタノールに再懸濁します。3回目の遠心分離後、チューブをティッシュペーパーの上に水平に置き、5〜10分間風乾させます。そして、DNAペレットを80マイクロリットルの低トリスEDTAに再懸濁します。次に、再懸濁したDNAを分光光度計で定量し、残りのサンプルを摂氏4度で保存します。示されているように、最大5匹の成虫アブラムシを液体窒素で粉砕した後、サンプルをヒュームフードに移し、800マイクロリットルのグアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルム抽出試薬をサンプルチューブに加えます。サンプルを乳棒でホモジナイズし、ホモジネートを室温で5分間インキュベートします。次に、160マイクロリットルのクロロホルムをサンプルに加え、続いて手で15秒間激しく振とうします。次に、サンプルを室温で2〜3分間インキュベートし、遠心分離して抽出したRNAを収集します。RNAを沈殿させるには、中間相を乱さずに水相を新しいRNSフリー微量遠心チューブに移し、RNAに400マイクロリットルのイソプロパノールを添加します。マイナス20°Cで10分間インキュベートした後、沈殿したRNAを遠心分離して回収します。次に、ジエチルピロカーボネート処理水で1ミリリットルの75%エタノールでサンプルを2回洗浄し、ゆっくりとボルテックスして遠心分離してフェノール汚染物質を除去します。2回目の洗浄後、主に滅菌ベンチでペレットを5〜10分間風乾し、RNAペレットを30マイクロリットルの超純水に穏やかにピペッティングして溶解し、摂氏55〜60度で10〜15分間インキュベートします。種子は、季節にもよりますが、植え替えるのに十分な大きさに成長するのに約2〜4週間かかります。植え替えられた苗木は、アブラムシの培養に最適なサイズに成長するのにさらに2〜4週間かかります。成虫のアイニアアイは、暗いカウダによって区別され、翼がないか翼があるかのどちらかです。発達中の翼パッドは、ニンフが3番目のインスターに達すると見えるようになります。単一の成体アイニアアイは、DNAのマイクロリットルあたり約100〜200ナノグラム、RNAのマイクロリットルあたり150〜300ナノグラムを生成します。その後、異なる処理条件下での候補遺伝子の相対発現を計算することができます。この手順を試みるときは、アイソクローナル株を汚染しないことが重要です。また、アブラムシの品質は植物の品質に大きく依存することを忘れないでください。この手順に続いて、アブラムシの生物学の根底にある分子メカニズムについての質問に答えるために、他の抽出およびシーケンシング技術を実行することができます。

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Genetics

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学ぶ アブラムシの培養と遺伝子発現解析の手法。Aphis neriiを用いた植物・昆虫相互作用の研究に適用でき、低コストで多種のアブラムシに応用可能です。生態学と進化生物学の基礎研究に貢献します。

生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系

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