Name: ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学ぶdrop-off ddPCR法によるctDNAの高感度検出と定量法。単一反応で複数の遺伝子変異を同時検出し、希少な患者サンプルを節約し、スループットを向上させる。がん診断と液体バイオプシー研究に応用可能。

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この作品は、Institut キュリー SiRIC (グラント インカ DGOS 4654) によって支えられました。著者感謝したいまたキャロライン ヘゴ ビデオへの彼女の貢献のため。

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何人かの著者を葉緑体の検出に関連する 2 つの特許出願 (EP17305920.5、EP18305277.8) の発明者と呼びます。

効率的なドロップオフ ddPCR アッセイを設計、最適化が重要であり、プロトコルを慎重に従う必要があります。プライマーとプローブの各組み合わせが一意の PCR 反応効率。したがって、個々 のアッセイは、貴重な試料を使用する前にコントロールのサンプルを注意深く検証します。最適化、検証、ピーク信号検出を証明し、特異性と感度を評価する重要です。プロトコルに従って、「プローブ 2」によってカバーされる対象領域にあるすべての変異体潜在的尋問されることができます。「プローブ 2」の 5' または 3' 端に位置する突然変異の確認を推奨するそれにもかかわらずドロップオフの試金の効率に影響を与える可能性がありますこれら以来。
ここで紹介した方法は、FFPE 組織、文化や血液の細胞を含む、「組織」の任意の型から抽出した DNA を実行できます。ただし、核酸抽出の質は劇的に ddPCR の結果に影響を与えます。ヘパリン、蛋白質、ヘム、フェノール、プロテアーゼ、コラーゲン、メラニン、洗剤や塩などの PCR 阻害物質があるサンプリングと精製工程中に可能な限り除去します。DdPCR の PCR 阻害物質の影...

何千もの癌の開発に関連する体細胞突然変異は報告された1をされています。これらのうち、いくつかの標的療法2,3の有効性予測マーカー、遺伝のこれらの突然変異のスクリーニングは今日常診療。液滴デジタル PCR (ddPCR) の技術は高い検出精度と突然変異の有無を監視するため、非侵襲的な液体生検4、5と高い互換性。ただし、試金 ddPCR 現在主に先天的な知られている突然変異を検出する設計されています。突然変異が知られている場合、これは深刻な検出ツールとして ddPCR の使用が制限されます。確かに、従来の ddPCR デザインの野生型対立遺伝子 (WT プローブ) を認識し加水分解プローブは突然変異体の対立遺伝子 (MUT プローブ) (図 1 a) を認識し、特定のプローブと競合します。高い親和性プローブは、テンプレートに交配し、対応する遺伝子の性質を示す、その蛍光を解放します。各液滴の得られた蛍光データは、別の次元で WT とムトのプローブによって放出される蛍光を表す散布で視覚化できます。従来の ddPCR の試金のための典型的な結果の概略は、図 1 aに提示されます。この例では、青、雲は水滴、MUT の対立遺伝子が増幅され MUT プローブによって識別されるに対応する赤い雲に対し WT プローブによって識別される WT 対立遺伝子を含んでいる小滴に対応します。反応に読み込まれている DNA の量、に応じて WT とムトの産物を含む二重肯定的な液滴は (緑雲) を表示できます。光の灰色の雲は、空の液滴に対応します。
以来、ほとんどのプラットフォームは、フルオロ (通常 2、5 までが) の限られた数の検出を実現、従来の ddPCR のスループットが制限されています。したがって、複数の隣接する遺伝子変異を有する地域をターゲット技術的に困難な多重 ddPCR 試金または並行各突然変異を対象とする複数の反応の使用の設計が必要です。WT 加水分解プローブの一意のペアを使用してターゲット領域内の遺伝的改変を検出できる可能性があるので、ドロップオフ ddPCR 戦略はこの制限を克服します。ターゲット地域と 2 番目のプローブ (プローブ 2) に隣接する非可変シーケンスは突然変異が、対象地域の WT シーケンスに補足最初のプローブ (プローブ 1) のカバーには、(図 1 b) が期待されています。最初のプローブは、反応における無衝突分子の合計量を定量化中、2 番目のプローブは突然変異体シーケンスにサブ最適な交配によって WT とムトの対立遺伝子を識別します。プローブ 2 は、複数のターゲット地域 (単一または複数のヌクレオチドの置換、削除、等)6の突然変異の種類を識別できます。従来の ddPCR のように光の灰色の雲は、DNA 分子を含まない水滴に対応します。それはこのタイプの試金、WT とムトの雲の最適な分離は WT だけを含んでいる小滴から WT とムトのターゲット遺伝子を含んでいる小滴を区別できないので、反応に読み込まれている DNA の量に依存していることを思い出すことが重要フォーム。したがって、この試金はほとんど水滴が目標とされた遺伝子の 1 つ以上のコピーを含める必要があります。

<table><tbody><tr><td>K2EDTAの管(色コード:ラベンダー)</td><td>BD</td><td>の367863</td><td>EDTAの管が全血またはEDTA血漿サンプル</td></tr><tr><td>QIAampの循環核酸のキット(手動プロトコル)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>人間の血漿からの自由な循環DNAの分離のため</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSPの循環DNAのキット(自動化されたプロトコル)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>人間の血漿からの自由な循環DNAの分離のため</td></tr><tr><td>QIAsymphony SPシステム</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>cfDNA、DNAまたはRNA精製のための完全統合および自動化システム</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>最大24個のcfDNAを同時に精製</td></tr><tr><td>Qubit蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Qubit蛍光光度計は、DNA</td></tr><tr><td>QX100またはQX200</td><td>リーダーBio-Rad</td><td>の定量用のベンチトップ蛍光光度計です186-3003または186-4003</td> リーダーは、<td>各液滴の蛍光強度を測定し、液滴が検出器を通過するときのサイズと形状を検出します</td></tr><tr><td>QX100またはQX200液滴発生器</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002または186-4002、それぞれ</td><td>液滴生成に使用される機器</td></tr><tr><td>C1000サーマルサイク</td><td>ラーBio-Rad</td><td>1851196</td><td>モジュール式サーマルサイクラープラットフォームには、C1000タッチサーマルサイクラーシャーシ、96ウェル高速反応モジュール</td></tr><tr><td>プレートシー</td><td>ラーBio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&tradeが含まれます。PCRプレートシーラー</td></tr><tr><td>DG8カートリッジホルダー</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>液滴発生のための装置内でDG8カートリッジを配置し、保持</td></tr>する <tr><td>液滴発生器カートリッジとガスケット</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>マイクロ流体DG8カートリッジは、サンプルとオイルを混合して液滴を生成するために使用されます。DG8ガスケットは、蒸発を防ぎ、液滴形成に必要な圧力を適用するためにカートリッジをシール</td></tr>します <tr><td>PCRスーパーミックス</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR プローブ用スーパーミックス(dUTPなし)</td></tr><tr><td>96ウェルPCRプレート</td><td>エッペンドルフ</td><td>951020362</td><td>96ウェルセミスカートプレート</td></tr><tr><td>ホイルシール</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>ピアス可能なホイルヒートシール</td></tr><tr><td>ddPCRドロップレットリーダー Oil</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td> リード液滴生成<td>に使用されるオイル</td></tr><tr>プローブ<td>用オイル</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>液滴生成用オイル</td></tr><tr><td>DNA loBind チューブ 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind チューブは、サンプルと表面の結合を大幅に減らすことにより、サンプル回収を最大化し</td></tr>ます <tr><td>マルチプレックス I cfDNA リファレンス標準セット</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Multiplex I cfDNA Reference Standards は、体細胞変異を検出する cfDNA アッセイの性能を評価するために使用される、高度に特徴付けられた生物学的に関連する参照材料です</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>HS アッセイは、RNA 上の二本鎖 DNA (dsDNA) に対して高い選択性を持ち、10 pg/&micro からの初期サンプル濃度に対して正確になるように設計されています。Lから100 ng /&micro;L</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Qubit Assay Tubesは500 &microです。L 薄肉ポリプロピレンチューブ (Qubit Fluorometer と併用)</td></tr></tbody></table>

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応 (ddPCR) は、ナノサイズの水-油の個々 の反作用の数千にサンプル分別に基づく高感度の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法です。最近では、ddPCR は循環腫瘍 (葉緑体) DNA 検出の最も正確で重要なツールとなっています。標準的な ddPCR 技術の主要な限界の 1 つは、特定加水分解プローブ各対立遺伝子のバージョンを認識し、必要な反応あたり上映することができます変異数の制限です。別の方法、ドロップオフの ddPCR では、プローブで検出し、対象地域における潜在的すべての遺伝的変化を定量化するの 1 つのペアだけが必要なので、スループットが向上します。ドロップオフの ddPCR は、単一の反作用で突然変異の大きい数を検出の利点と従来の ddPCR の試金に匹敵する感度を表示します。コスト効率の高い、貴重な試料を節約、変異をアプリオリに知られていないとき検出ツールとして使用することができます。

概念実証研究 FFPE 組織やドロップオフ ddPCR 戦略6を使用して癌から血漿検体でKRASエクソン 2 変異 (コドン 12 と 13) とegfr 遺伝子エクソン 19 削除を調べた。
KRASドロップオフ プローブは、複数人間癌11既知のKRAS変異の 95% 以上あるのエクソン 2 のKRAS遺伝子の変異を含む 16 bp の領域を尋問しました。基準プローブは 20 bp の長さと位置 3 bp 下流。2 最も頻繁に変異したKRASのアミノ酸を含む細胞から抽出した DNA を用いて我々 の分析を最適化する: G12V (c.35GT、SW480) と G13D (c.38GA、HCT 116)。
<p class="jove_con...

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

この方法は、循環腫瘍DNAを分析する癌の診断ツールとして使用することができる。この技術は、単一の反応におけるクラスター突然変異の領域における複数の遺伝的変化を尋問する。これは貴重な患者のサンプルを救うのに役立つ。この方法は、その突然変異プロファイル上の腫瘍負担に対する洞察を提供することができる。また、qPCRの代替として分子解析に適用して、核酸標的配列の絶対定量化を得ることもできます。7ミリリットルのEDTAチューブで血液サンプルを収集します。2つのチューブは、プラズマの約4ミリリットルを収集することをお勧めします。血液サンプルを遠心分離し、血液から3時間以内に820倍の重力で10分間血液サンプルを遠心分離し、赤血球、白血球、血漿を分離する。サンプリングと遠心分離の間の時間は、白血球から放出されたDNAで汚染されていない高級なT細胞フリーDNAを得るために重要です。遠心分離後、血清ピペットを使用して、白血球層に触れることなく上清を採取する。およそ2ミリリットルのプラズマは、通常、EDTAチューブあたり回収される。プラムを2つのミリリットルチューブに移した後、16,000倍の重力でアリコートを15°Cで10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除く。慎重にペレットを乱すことなく、プラズマを収集し、2ミリリットルの極低温管に転送します。必要になるまでマイナス80°Cで保管してください。まず、400マイクロリットルのプロテイナーゼKを50ミリリットルのチューブに加えます。次に、抽出キットから1マイクログラムのキャリアRNAを含む4ミリリットルの血漿と3.2ミリリットルのACLリシスバッファーを加えます。チューブを閉じ、30秒間渦を混ぜて均質な溶液を得る。その後、摂氏60度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、7.2ミリリットルのバッファーACBをライセートに加えて、循環核酸とシリカ膜への結合を最適化する。15~30秒間渦を混ぜます。その後、氷の上にチューブを5分間インキュベートします。カラムと20ミリリットルのエクステンダーを真空ポンプに取り付けます。真空吸引を可能にするために未使用部分を閉じます。チューブを一時的に遠心した後、慎重にチューブエクステンダーに混合物を導入します。その後、真空ポンプのスイッチを入れ、ライセートを完全に柱に引き抜きます。チューブエクステンダーを取り外して捨てます。次に、600マイクロリットルのバッファACW1をカラムに塗布します。バッファ ACW1 がカラムを通して引き出された場合、750 マイクロリットルの ACW2 バッファを加え、最後に 750 マイクロリットルの 96 ~ 100%エタノールを加えます。次に、カラムをきれいな2ミリリットルの回収チューブに入れ、遠心分離機をフルスピードで3分間入れてエタノールを除去します。カラムを新しい2ミリリットルの回収チューブに入れた後、蓋を開けてから56°Cで10分間インキュベートし、膜を完全に乾燥させます。インキュベーションの後、カラムを清潔な1.5ミリリットルの低結合チューブに入れる。0.04%のアジドナトリウムで36マイクロリットルのRNaseフリーウォーターを慎重に塗布してください。その後、蓋を閉め、室温で3分間インキュベートします。核酸を溶出させるために再び全速力で遠心分離機。その後、必要になるまでマイナス20°Cで保存します。クリーンなPCRフードで反応成分を室温まで解凍し、平衡化することで始めます。その後、RNaseとDnaseフリー蒸留水でプライマーとプローブを20回混合し、各プライマーを18マイクロモル濃度、各プローブを5マイクロモル濃度で調製します。すべての個々のPCR反応について、2回のddPCRスーパーミックスの10マイクロリットル、プライマーとプローブの20倍の1マイクロリットルの混合、および20マイクロリットルの蒸留水中のDNAサンプルの最大10ナノグラムを組み合わせてサンプルミックスを調製します。反応混合物を十分に渦化し、均質性を確保する。そして、分配する前にチューブの底に内容物を収集するために簡単に遠心分離機。ddPCRカートリッジをホルダーに挿入し、液滴生成のために20マイクロリットルのサンプル反応ミックスをカートリッジの中間ウェルにロードします。下の井戸に70マイクロリットルの液滴発生油を加えます。ガスケット付きのカートリッジを液滴発生器に挿入します。液滴はカートリッジの上部ウェルで生成されます。カートリッジから40マイクロリットルの液滴をゆっくりとそっと吸い込み、96ウェルPCRプレートに分配します。液滴を移す直後にプレートシーラーを使用して、蒸発を避けるために、最終PCRプレートをアルミホイルでシールします。プレートを簡単に遠心分離して、井戸の底に内容物を集める。サーマルサイクラーで従来のPCR増幅を実行します。ランが完了したら、プレートを一時的に遠心分離して、井戸の底に内容物を集める。PCR 増幅後、液滴リーダーを使用して、メーカーの指示に従って PCR 陽性および PCR 負の液滴をカウントします。以下は、ドロップオフddPCRアッセイの最適化ステップ中に得られた代表的な結果である。この画像は、100%変異型DNA、5%変異DNA、および100%野生型DNAを含む反応における変異型DNAおよび野生型DNAの検出を示す。この画像は、KRASおよびEGFRドロップオフddPCRアッセイで分析された血漿サンプルの例を示し、KRASの2つのエキソンにおける一ヌクレオチドおよび複数置換の検出およびEGFRエキソン19における欠失を示す。この手順を試みる間は、この方法の重要なステップである液滴生成において、各ステップで注意を払って慎重に進めることが重要です。その開発後、この技術は、がん研究の研究者と臨床医が液体生検を用いて腫瘍突然変異解析を最適化する道を開いた。

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Research

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