ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

この方法は、循環腫瘍DNAを分析する癌の診断ツールとして使用することができる。この技術は、単一の反応におけるクラスター突然変異の領域における複数の遺伝的変化を尋問する。これは貴重な患者のサンプルを救うのに役立つ。

この方法は、その突然変異プロファイル上の腫瘍負担に対する洞察を提供することができる。また、qPCRの代替として分子解析に適用して、核酸標的配列の絶対定量化を得ることもできます。7ミリリットルのEDTAチューブで血液サンプルを収集します。

2つのチューブは、プラズマの約4ミリリットルを収集することをお勧めします。血液サンプルを遠心分離し、血液から3時間以内に820倍の重力で10分間血液サンプルを遠心分離し、赤血球、白血球、血漿を分離する。サンプリングと遠心分離の間の時間は、白血球から放出されたDNAで汚染されていない高級なT細胞フリーDNAを得るために重要です。

遠心分離後、血清ピペットを使用して、白血球層に触れることなく上清を採取する。およそ2ミリリットルのプラズマは、通常、EDTAチューブあたり回収される。プラムを2つのミリリットルチューブに移した後、16,000倍の重力でアリコートを15°Cで10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除く。

慎重にペレットを乱すことなく、プラズマを収集し、2ミリリットルの極低温管に転送します。必要になるまでマイナス80°Cで保管してください。まず、400マイクロリットルのプロテイナーゼKを50ミリリットルのチューブに加えます。

次に、抽出キットから1マイクログラムのキャリアRNAを含む4ミリリットルの血漿と3.2ミリリットルのACLリシスバッファーを加えます。チューブを閉じ、30秒間渦を混ぜて均質な溶液を得る。その後、摂氏60度で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、7.2ミリリットルのバッファーACBをライセートに加えて、循環核酸とシリカ膜への結合を最適化する。15~30秒間渦を混ぜます。その後、氷の上にチューブを5分間インキュベートします。

カラムと20ミリリットルのエクステンダーを真空ポンプに取り付けます。真空吸引を可能にするために未使用部分を閉じます。チューブを一時的に遠心した後、慎重にチューブエクステンダーに混合物を導入します。

その後、真空ポンプのスイッチを入れ、ライセートを完全に柱に引き抜きます。チューブエクステンダーを取り外して捨てます。次に、600マイクロリットルのバッファACW1をカラムに塗布します。

バッファ ACW1 がカラムを通して引き出された場合、750 マイクロリットルの ACW2 バッファを加え、最後に 750 マイクロリットルの 96 ~ 100%エタノールを加えます。次に、カラムをきれいな2ミリリットルの回収チューブに入れ、遠心分離機をフルスピードで3分間入れてエタノールを除去します。カラムを新しい2ミリリットルの回収チューブに入れた後、蓋を開けてから56°Cで10分間インキュベートし、膜を完全に乾燥させます。

インキュベーションの後、カラムを清潔な1.5ミリリットルの低結合チューブに入れる。0.04%のアジドナトリウムで36マイクロリットルのRNaseフリーウォーターを慎重に塗布してください。その後、蓋を閉め、室温で3分間インキュベートします。

核酸を溶出させるために再び全速力で遠心分離機。その後、必要になるまでマイナス20°Cで保存します。クリーンなPCRフードで反応成分を室温まで解凍し、平衡化することで始めます。

その後、RNaseとDnaseフリー蒸留水でプライマーとプローブを20回混合し、各プライマーを18マイクロモル濃度、各プローブを5マイクロモル濃度で調製します。すべての個々のPCR反応について、2回のddPCRスーパーミックスの10マイクロリットル、プライマーとプローブの20倍の1マイクロリットルの混合、および20マイクロリットルの蒸留水中のDNAサンプルの最大10ナノグラムを組み合わせてサンプルミックスを調製します。反応混合物を十分に渦化し、均質性を確保する。

そして、分配する前にチューブの底に内容物を収集するために簡単に遠心分離機。ddPCRカートリッジをホルダーに挿入し、液滴生成のために20マイクロリットルのサンプル反応ミックスをカートリッジの中間ウェルにロードします。下の井戸に70マイクロリットルの液滴発生油を加えます。

ガスケット付きのカートリッジを液滴発生器に挿入します。液滴はカートリッジの上部ウェルで生成されます。カートリッジから40マイクロリットルの液滴をゆっくりとそっと吸い込み、96ウェルPCRプレートに分配します。

液滴を移す直後にプレートシーラーを使用して、蒸発を避けるために、最終PCRプレートをアルミホイルでシールします。プレートを簡単に遠心分離して、井戸の底に内容物を集める。サーマルサイクラーで従来のPCR増幅を実行します。

ランが完了したら、プレートを一時的に遠心分離して、井戸の底に内容物を集める。PCR 増幅後、液滴リーダーを使用して、メーカーの指示に従って PCR 陽性および PCR 負の液滴をカウントします。以下は、ドロップオフddPCRアッセイの最適化ステップ中に得られた代表的な結果である。

この画像は、100%変異型DNA、5%変異DNA、および100%野生型DNAを含む反応における変異型DNAおよび野生型DNAの検出を示す。この画像は、KRASおよびEGFRドロップオフddPCRアッセイで分析された血漿サンプルの例を示し、KRASの2つのエキソンにおける一ヌクレオチドおよび複数置換の検出およびEGFRエキソン19における欠失を示す。この手順を試みる間は、この方法の重要なステップである液滴生成において、各ステップで注意を払って慎重に進めることが重要です。

その開発後、この技術は、がん研究の研究者と臨床医が液体生検を用いて腫瘍突然変異解析を最適化する道を開いた。