Name: バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ海ヤツメウナギのフェロモン同定法。固相抽出とろ過蒸発で化合物を単離し、嗅上皮電気記録と行動実験で機能を評価する化学生態学の手法です。新規化合物とフェロモン機能を結びつけ、水生生物の化学的コミュニケーション理解に貢献します。

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米国地質調査ハモンド湾生物ステーションの研究施設の利用、米魚類野生生物局と水産のスタッフと海カナダ海ヤツメウナギを提供するために感謝しますこの研究は、李維、柯李五大湖漁業委員会からの補助金によって支えられました。

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魚は、化学の世界はまだ識別される化合物の完全に住んでいます。バイオアッセイ誘導分別識別しサクラマス31、アジア象32、および海ヤツメウナギ33で観察など、多くの化学的相互作用を仲介する生理活性分子を特徴付ける重要な証明されています 34,35。バイオアッセイ誘導分別が正確にトレースし、pinpoint 開始から生理活性物質を抽出精製されたアクティブな化合物に効果的です。このアプローチを使用すると、特定の生理活性化合物は、化合物知られている生合成経路からを予測することがないユニークな化学スケルトンを小説を明らかにできます。
眼球は、どの留分や化合物を引き出す嗅覚応答を決定するため行われています。いくつかの技術的な考慮事項は、眼球と推定されるフェロモン嗅覚応答を正確に測定することが不可欠。まず、機関動物ケア...

フェロモンは、食料源を検索、検出捕食者および個体1の社会的な相互作用を仲介することでそれらを支援する個人によってリリースされた特定の化学信号です。昆虫のフェロモン ・ コミュニケーションはずっとよく勉強2;しかし、化学的同定と水生脊椎動物フェロモンの生物学的機能が検討されていないとして広く。Id の知識とフェロモンのリリースの機能は、絶滅危惧種3,4または制御害虫種5,6の回復を容易に適用できます。これらの技術のアプリケーションは、分離・生理活性フェロモン成分の同定を必要とします。
フェロモンの同定は、天然物化学の枝です。フェロモン研究の進歩は、フェロモン分子自身の性質上、部分的に制限されています。フェロモンは、不安定になり、少量でリリースされた、揮発性7,8または9水溶性化合物の微量を検出するだけいくつかのサンプリング手法が存在します。フェロモン的なアプローチには、1) 知られている化合物、2) メタボロミクス、および 3) バイオアッセイ誘導分別の対象となるスクリーニングが含まれます。知られている化合物の標的スクリーニングは、フェロモンとして機能するいると仮定の生理的過程の市販の代謝の副産物をテストします。研究者のみ知られており、利用可能な化合物をテストできますので、この方法は制限されています。ただし、それをもたらしました金魚の性ホルモンの成功した識別関数フェロモン10、11,12として。メタボロミクスは、潜在的な生物学的システム13内低分子代謝産物を区別する第 2 フェロモン同定アプローチです。2 つのグループ (すなわちアクティブと非アクティブのエキス) の代謝プロファイルの比較により、潜在的な代謝プロファイルの id 構造の解明から代謝物を精製し、生物活性は確認された14です。特定の混合物の複雑な配合の添加剤または相乗効果、代謝物は一緒にではなく、分数13のシリーズとしてと見なされるために、メタボロミクスで検出される可能性が高い。まだ、メタボロミクスの実装は、結果のデータは、新規構造の解明を促進しないので合成参照の可用性に依存します。
バイオアッセイ誘導の分別、2 つのフィールドにまたがる統合、反復的なアプローチ: 化学および生物学。このアプローチは、分離とアクティブなフェロモン化合物の同定をガイドするのに生理・行動生物検定の結果を使用します。粗野なエキスは、 (すなわち、分子サイズ、極性等)の化学的性質によって分別され、生物検定および/または電気 olfactogram (EOG) 録音でのテストです。生理活性成分をスクリーニング、分別および EOGs および/または生物検定の手順を繰り返ししています。分子量と合成される化合物のテンプレートを生成する構造情報提供分光法と分光学的方法により純粋な活性化合物の構造を明らかにします。バイオアッセイ誘導の分別には、多様な代謝と生合成の経路から予測される可能性が高いではないユニークな化学のスケルトンと潜在的新規フェロモンをもたらすことができます。
ここでは、分離し、男性の海ヤツメウナギ セックス フェロモン化合物の生物活性を評価するために使用するバイオアッセイ誘導分別のプロトコルについて述べる。海ヤツメウナギ (カワヤツメ属 marinus) は、これらの魚は大きく 3 つの段階から成る、さくの生活史を仲介する化学手掛かりの嗅覚の検出に依存するため、フェロモン ・ コミュニケーションを研究する理想的な脊椎動物のモデルです。幼虫、少年、大人。海ヤツメウナギ淡水ストリームの底に穴を掘る、抜本的な変態、湖または海洋大ホスト魚を寄生彼らに移行する少年に変換します。ホストの魚からデタッチ後大人は産卵ストリームに戻って移行, ストリーム居住者幼虫15,16,17,18,19 発表渡り鳥のフェロモンに導かれて.成熟した雄は産卵場に登る、仲間を集めるし、約一週間、断続的に産卵して死ぬ15,20の多成分性フェロモンをリリースします。海ヤツメウナギ フェロモンの同定は、フェロモン通信システムの変調がラウレンツィアーナ五大湖21の侵襲の海ヤツメウナギにオプションの中では重要です。

<table><tbody><tr><td>フィラメント付きプレミアムスタンダード壁ホウケイ酸キャピラリー&nbsp;</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>G150F-4</td><td>記録および参照電極(外径1.5 mm、内径0.86 mm)</td></tr><tr><td>ピペットプーラー機器</td><td>成茂</td><td>PC-10</td>は<td>EOG用電極を引っ張ります</td></tr><tr><td>ダイヤモンド先端ガラスカッター</td><td>EOG用電極</td><td>の一般的な</td><td></td>カットチップ</tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>1B150-4</td><td>EOG</td></tr><tr><td>用臭気剤送達管記録電極ホルダー Eシリーズ ストレートボディ ガラスキャピラリー用Ag/AgClペレット 外径1.5mm</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>ESP-M15N</td><td>記録電極</td></tr><tr><td>ホルダー Eシリーズ ハンドル付&nbsp;Ag/AgClペレット&nbsp;ガラスキャピラリー用 外径 1.5 mm</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>E45P-F15NH</td><td>参照電極ホルダー</td></tr><tr><td>1 mm ピン</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>WC1-10</td><td>ブリッジ用基準電極ホルダー</td></tr> 2 <tr><td>mm ピン</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>WC2-5</td><td>ブリッジ用基準電極ホルダー</td></tr> 記録電極ホルダー <tr><td>寒天</td><td>シグマ</td><td>A1296</td><td>溶融寒天</td></tr>培地 電極を充填<tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>シグマ</td><td>P9333</td><td>3M KCl電極と電極ホルダーを充填する</td></tr>マイクロ<tr><td>ピペット マイクロフィル</td><td>ワールド精密機器</td><td>電極と電極ホルダーを充填する</td><td>MF28G-5</td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>シグマ</td><td>A5006EOG</td><td>用ポジティブコントロール臭気剤</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>カスタムメイド</td><td>N/A</td><td>EOGの臭気物質を保持</td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸エチルエステル(MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaine1G</td><td>EOG麻酔薬</td></tr><tr><td>ガラミントリエチオジド</td><td>シグマ</td><td>G8134-5G</td><td>EOG麻痺性</td></tr><tr><td>1mLシリンジ</td>BD<td>バイオサイエンス</td><td>301025</td><td>麻痺性</td></tr>皮<tr><td>下針26G 5/8</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>305115</td><td>麻痺性</td></tr><tr><td>ローラークランプ</td>を投与する<td>ワールドプレシジョン器械</td><td>14043-20</td>は<td>ヤツメウナギの口への麻酔薬の流動度を調節する</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>0.9%生理食塩水の準備のための</td></tr><tr><td>試料の段階としてV字型プラスチック スタンド</td><td>カスタムメイド</td><td>のN/A</td><td>はEOGの間にヤツメウナギを保持</td></tr><tr><td>プラスチックトラ</td>フ <td>カスタムメイド</td><td>のN/A</td><td>はEOGのメスの刃の間にV字型のプラスチックスタンドを保持する</td></tr> - <tr><td>#11</td><td>EOG</td><td>解剖用</td>ファインサイエンスツール<td>10011-00</td></tr><tr><td>メスハンドル-#3</td> EOG解剖用<td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12</td><td>EOG解剖用</td></tr><tr><td>ストレート超微細鉗子</td> EOG解剖用<td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td>、デュモン #5SF 鉗子</td></tr><tr><td>湾曲した超微細鉗子</td> EOG解剖用<td>ファインサイエンスツール</td><td>11370-42</td><td>、モリアMC40B</td></tr><tr><td>ストレートプリングハサミ</td><td></td><td>EOG解剖のための</td>ファインサイエンスツール<td>15003-08</td></tr><tr><td>EOG解剖のための</td><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ディスカバリーV8</td></tr><tr><td>イルミネーターライト</td><td>EOG解剖のための</td><td>ツァイス</td><td>CL 1500エコ</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>再循環EOGセットアップとウォーターバスを接続する</td><td>ための汎用</td><td></td></tr><tr><td>臭気剤送達チューブ</td><td>カスタムメイド</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inラインフィルターとガスケットセット</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MM-3</td><td>電極と臭気物質送達毛細管を配置する</td></tr><tr><td>磁気保持装置</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>バルブドライバー</td><td>Arduino</td> 臭<td>気刺激用バルブの開度を制御する</td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>電磁弁</td><td>Leeニ</td><td>オイ刺激用バルブ</td><td></td></tr><tr><td>NeuroLog AC/DCアンプ</td><td>Digitimer Ltd.LFAA1201618H会社</td><td>NL106</td><td></td></tr>は<tr>、ヘッドステージ<td>Digitimer株式会社</td>とエリクトリカル信号<td>NeuroLog DCプリアンプ</td>の振幅を増加させる。<td>NL102G</td>は<td>、エリクトリカル信号の振幅を大きくする</td></tr><tr><td>ローパス60Hzフィルター</td>デ<td>ジタイマー株式会社</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>デルコンピュータ(OptiPlex 745) Axoscopeデータ取得ソフトウェア</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScopeバージョン10.4</td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>カスタムメイド</td><td>N/A</td><td>電磁ノイズシールド</td></tr><tr><td>2択迷路</td><td>カスタムメイド</td><td>N/A</td><td>プラスチックライナーで覆われた防水マリングレードの合板</td></tr><tr><td>ゴミポンプ</td><td>ホンダ</td><td>WT30XK4A</td>、<td>近くの川からの水で迷路を埋めます</td></tr><tr>チューブ<td>付き</td><td>コールパーマー</td><td>マスターフレックス07557-00</td> 迷路<td>の臭気物質を管理する</td></tr><tr><td>インバーター発電機</td><td>ホンダ</td><td>EU1000i</td><td>はパースタルティックポンプをパワーします</td></tr><tr><td>リリースケージ</td><td>カスタムメイド</td><td>N/A</td><td>迷路でヤツメウナギを順応させるために使用される</td></tr><tr><td>メッシュ</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>迷路の寸法を封じ込め、メッシュローラーで水の乱気流を最小限に抑えるために使用されます</td></tr><tr><td>バケツ (5ガロン)</td>ジェ<td>ネリック</td><td></td><td>臭気物質を混合するために</td></tr><tr><td>流量計</td><td>マーシュ・マクバーニー</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>排出を測定するために</td></tr><tr><td>XAD 7 HP 樹脂</td><td>ダウ化学</td>薬品 <td>37380-43-1</td><td>調整水の抽出用&nbsp;</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>34860</td>(<td>調整水の抽出用)&nbsp;</td></tr><tr>調整水の抽出のための<td>ウォーターバス</td><td>ヤマト</td><td>BM200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Labconco</td><td>CentriVap コンセキュレーター コンセクター コンセクション水抽出用</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>CX1050</td><td>フラ</td></tr><tr>クションプールの分離用<td>シリカゲル 70-230</td>メッシュ <td>シグマ</td><td>112926-00-8</td> フラ<td>クションプールの分離用</td></tr><tr><td>シリカゲル 230-400</td>メッシュ <td>シグマ</td><td>112926-00-8</td><td>フラクションプールの分離用</td></tr> プレ<tr><td>コートシリカゲルTLCプレート</td> フラ<td>クションプールの分離のための</td><td>シグマ</td><td>99571</td></tr><tr><td>アニサルデヒド</td> フラ<td>クションプールの分離のための</td><td>シグマ</td><td>A88107</td></tr><tr><td>セファデックスLH-20</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0090-01</td><td>フラクションプールの分離のための</td></tr><tr><td>アンバーライトXAD 7 HP樹脂</td> 調整<td>水の抽出のための</td><td>シグマ</td><td>XAD7HP</td>&nbsp;</tr><tr><td>4、2.5L容量ガラスコラム</td><td>エースガラス株式会社</td><td>5820</td><td>調整水の抽出用&nbsp;</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマ</td><td>650501</td><td>、調整水の抽出用&nbsp;</td></tr><tr><td>TQ-S TOF LC 質量分析計(または同等品)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>構造解明用</td></tr><tr><td>バイナリーHPLCポンプ</td><td>Waters Co.</td><td>フラクションプール/化合物の分離のための</td><td>1525</td></tr><tr><td>Agilent NMR分光計、900MHz(または同等品)</td><td>構造解明のための</td><td>Agilent</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Rotovap乾燥システム</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>調整水の抽出用&nbsp;</td></tr><tr><td>UVランプ (254 nm)</td><td>スペクトロニクス株式会社</td><td>ENF-240C</td><td>薄層クロマトグラフィー用&nbsp;</td></tr></tbody></table>

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

バイオアッセイ誘導の分別は、生理・行動生物検定の結果を使用して分離とアクティブなフェロモン化合物の同定をガイドする反復的なアプローチです。このメソッドは、幅広い動物種のフェロモンとしてその関数化学信号の正常性状に起因しました。海ヤツメウナギは行動または生理学的な応答を仲介するフェロモンを検出する嗅覚に頼る。私たちはこの魚の生物学の知識を使用して推定されるフェロモンの機能を仮定するし分離とアクティブなフェロモン成分の同定。クロマトグラフィーは、抽出、集中、およびエアコンの水から化合物の分離に使用されます。電気 olfactogram (EOG) 録音する分数は嗅覚応答を引き出すを決定するため行われています。2 つの選択肢迷路行動アッセイは、臭気の分数のいずれかがアクティブな行動もし、好みを誘発するかどうかを決定する使用されます。分光法と分光学的方法は、分子量や構造解明を支援する構造の情報を提供します。純粋な化合物の生物活性を EOG と行動実験で確認しました。迷路の中にみられる行動応答は最終的に自然のストリーム設定の機能を確認するためのフィールド設定で検証しなければなりません。これらの生物検定は、1) 分別プロセスをガイドし、2) 確認するデュアル役割と、分離されたコンポーネントの活性の定義します。ここでは、分別のバイオアッセイ誘導アプローチの有用性を例証する海ヤツメウナギ フェロモン同定の代表的な結果を報告します。海ヤツメウナギ フェロモンの同定は、フェロモン通信システムの変調が侵襲的海ヤツメウナギ ラウレンツィアーナ五大湖にオプションの中では特に重要です。このメソッドは、イチイの広範な配列の化学交信を特徴付けるし、水系の化学生態学に光を当てるに容易に適応できます。

バイオアッセイ誘導分別のプロトコルで説明されている手順をまとめた図を図 1に示します。プロトコルには、分離し、構造、嗅覚の効力 5 推定海ヤツメウナギ フェロモン (図 2) の行動の活性を評価する手順が含まれます。質量分析および NMR データ (図 3および図 4) を使用して、petromyzene A B と petromyzone A ~ C の構造を完備の成熟した男性海ヤツメウナギ22,29水から解明しました。
眼球運動記録 (図 5</stron...

ここでは、分離し、構造、嗅力海ヤツメウナギの推定フェロモン化合物の行動応答を評価するためのプロトコルを提案する.

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

この方法は、フェロモンの同定など、化学生態学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、新規化合物をフェロモン機能に結びつけることです。この手順を開始するには、摂氏16〜18度に維持された250リットルの曝気ヒューロン湖の水が供給されたタンクに15〜30匹の性的に成熟したオスのウミヤツメウナギを置きます。固相抽出によって調整された水を抽出するには、ポンプシステムを介してタンクからカラムの上部に水を渡します。水は、1リットルの容量のガラスカラム4本に含まれる中極性ポリマーイオン交換樹脂の2キログラムのベッドを通過します。次に、有機溶媒を取り出し、40°Cの減圧下で5時間ロータリーエポベーションして抽出物を回収します。フラクションプールを単離するには、シリカゲルを初期移動相に 30 分間浸します。溶媒を含むゲルをガラスカラムに移し、そのバルブを開いて移動相を通過させます。次に、抽出物をシリカゲルと十分に混合し、シリカゲル床上の液体クロマトグラフィーカラムにロードします。95%クロロホルム-メタノールから100%メタノールまでの勾配で溶出し、合計2.5リットルにした後、溶離液を個々の10ミリリットルバイアルに回収します。その後、サンプルを開始ラインに塗布し、プレートの開始ラインを密封されたガラスタンク内の現像溶媒に浸すことにより、プレコートされたシリカゲルプレートでTLC実験を行います。現像液がエンドラインに到達したら、プレートをタンクから取り出し、溶媒が蒸発するまで10分待ちます。まず254ナノメートルの紫外線下でスポットを視覚化し、次にクロマトグラフィー噴霧器を使用して5%アニスアルデヒドの酸性メタノール溶液を噴霧し、摂氏85度で3分間加熱してプレートを染色します。その後、摂氏40度の減圧下で約30分間、回転蒸発させることにより、フラクションを残留物に濃縮します。EOG記録を行うには、極性キャピラリー電極と、塩化銀銀ペレットでプレハブされた固体電極ホルダーに、マイクロピペットを使用して3モルの塩化カリウムを充填します。次に、極まった電極を電極ホルダーに挿入します。次に、10からマイナス5モルのL-アルギニンを木炭ろ過水に10〜マイナス5モルのL-アルギニンを10〜マイナス2モルのL-アルギニンストック溶液で調製します。濃度応答曲線には、フラクションプールの10倍希釈液を10ミリリットル調製します。次に、麻酔をかけたヤツメウナギをV字型のスタンドに向け、濡れたペーパータオルで包んで乾燥を防ぎます。MS222のリットルあたり50ミリグラムを含む再循環通気水のチューブを頬腔に挿入します。流量を調整し、鰓の開口部から水が出るようにして、鰓を連続的に灌漑します。臭気物質供給チューブをろ過水で洗い流し、マイクロマニピュレーターに取り付けられたバルブに接続

the-identification-sea-lamprey-pheromones-using-bioassay-guided

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

成人臍orangeworm（の電気生理学的応答の測定による急速に画面宿主植物揮発性物質の方法...

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

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ホスホリパーゼ活性アッセイ:Anthopleura dowii由来の粗毒抽出物中のホスホリパーゼ活性を測定するためのゲル拡散アッセイ

海のヤツメウナギは変態期胆嚢や胆管、人間の胆道閉鎖症と同様のプロセスを失う。新しい固定および清澄法（CLARITY）はレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて全体胆ツリーを視覚化するために変更されました。この方法では、胆管の変性を研究するための強力なツールが用意されています。...

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液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

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爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

嗅覚神経からの細胞外多単位記録は、海洋魚の嗅覚感受性を評価するための敏感で堅牢で再現性の高い方法である。それは一次感覚入力を記録し、外部の分量に依存しない。...

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神経ペプチドの質量分析特性評価は、配列、定量、および局在化情報を提供します。この最適化されたワークフローは、神経ペプチド研究だけでなく、他の内因性ペプチドにも有用です。ここで提供されるプロトコルは、LC-ESI-MS、MALDI-MS スポッティング、および MALDI-MS イメージングを使用した神経ペプチドのサンプル調製、MS 取得、MS...

カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査

ここでは、イソギンチャクから粗毒抽出物を取得し、その溶血作用およびホスホリパーゼ活性を検出するためのプロトコールについて記載する。...

簡単なバイオアッセイによる海アネモンからの粗抽出物中の溶血性およびホスホリパーゼ活性の同定

Caenorhabditis elegansにおける揮発性性フェロモン抽出と化学吸引アッセイ

このプロトコールは、水および脂質が豊富な魚組織からのジオスミンおよび2-メチルイソボルネオールの抽出のための完全に自動化されたワークフローを示しています。この方法により、これらの分子が臭気の閾値に達する前に早期に検出できます。水産養殖環境からの代表的なデータが提供されます。...

大容量吸着抽出プローブとGC-MSを用いた、水および魚中のGeosminおよび2-メチルイソボルネオールの抽出と検出

学ぶ海ヤツメウナギのフェロモン同定法。固相抽出とろ過蒸発で化合物を単離し、嗅上皮電気記録と行動実験で機能を評価する化学生態学の手法です。新規化合物とフェロモン機能を結びつけ、水生生物の化学的コミュニケーション理解に貢献します。

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギフェロモンの同定

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