バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

この方法は、フェロモンの同定など、化学生態学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、新規化合物をフェロモン機能に結びつけることです。この手順を開始するには、摂氏16〜18度に維持された250リットルの曝気ヒューロン湖の水が供給されたタンクに15〜30匹の性的に成熟したオスのウミヤツメウナギを置きます。

固相抽出によって調整された水を抽出するには、ポンプシステムを介してタンクからカラムの上部に水を渡します。水は、1リットルの容量のガラスカラム4本に含まれる中極性ポリマーイオン交換樹脂の2キログラムのベッドを通過します。次に、有機溶媒を取り出し、40°Cの減圧下で5時間ロータリーエポベーションして抽出物を回収します。

フラクションプールを単離するには、シリカゲルを初期移動相に 30 分間浸します。溶媒を含むゲルをガラスカラムに移し、そのバルブを開いて移動相を通過させます。次に、抽出物をシリカゲルと十分に混合し、シリカゲル床上の液体クロマトグラフィーカラムにロードします。

95%クロロホルム-メタノールから100%メタノールまでの勾配で溶出し、合計2.5リットルにした後、溶離液を個々の10ミリリットルバイアルに回収します。その後、サンプルを開始ラインに塗布し、プレートの開始ラインを密封されたガラスタンク内の現像溶媒に浸すことにより、プレコートされたシリカゲルプレートでTLC実験を行います。現像液がエンドラインに到達したら、プレートをタンクから取り出し、溶媒が蒸発するまで10分待ちます。

まず254ナノメートルの紫外線下でスポットを視覚化し、次にクロマトグラフィー噴霧器を使用して5%アニスアルデヒドの酸性メタノール溶液を噴霧し、摂氏85度で3分間加熱してプレートを染色します。その後、摂氏40度の減圧下で約30分間、回転蒸発させることにより、フラクションを残留物に濃縮します。EOG記録を行うには、極性キャピラリー電極と、塩化銀銀ペレットでプレハブされた固体電極ホルダーに、マイクロピペットを使用して3モルの塩化カリウムを充填します。

次に、極まった電極を電極ホルダーに挿入します。次に、10からマイナス5モルのL-アルギニンを木炭ろ過水に10〜マイナス5モルのL-アルギニンを10〜マイナス2モルのL-アルギニンストック溶液で調製します。濃度応答曲線には、フラクションプールの10倍希釈液を10ミリリットル調製します。

次に、麻酔をかけたヤツメウナギをV字型のスタンドに向け、濡れたペーパータオルで包んで乾燥を防ぎます。MS222のリットルあたり50ミリグラムを含む再循環通気水のチューブを頬腔に挿入します。流量を調整し、鰓の開口部から水が出るようにして、鰓を連続的に灌漑します。

臭気物質供給チューブをろ過水で洗い流し、マイクロマニピュレーターに取り付けられたバルブに接続します。次に、臭気物質送達毛細管を嗅上皮腔内に留置し、ろ過した水を嗅上皮に送達することで、臭気物質を投与していないときの乾燥を防ぎます。次に、記録電極と参照電極をマイクロマニピュレータに取り付けます。

参照電極を鼻孔近くの外部皮膚に下げます。実体顕微鏡を使用して、記録電極を下げて、嗅上皮の表面にほとんど触れないようにします。続いて、バックグラウンドろ過水からの臭気物質送達チューブの取り込みを、マイナス5モルのL-アルギニン溶液に10に移します。

コンピュータ、アンプ、フィルタ、デジタイザの電源を入れます。バルブドライバーソフトウェアを使用して、T1のチェックボックスをオンにし、Tを4秒に設定し、データ収集ソフトウェアの T2.In のチェックボックスをオンにして、4秒間の臭気物質の単一パルスを投与する手順をプログラムし、取得モードを高速オシロスコープに設定します。[再生]アイコンをクリックし、バルブドライバーの[開始]をクリックして、臭気パルスをトリガーします。

ブランクコントロールであるL-アルギニンの記録を開始し、次に低濃度から高濃度までの臭気物質の記録を開始し、アプリケーション間でろ過水を2分間フラッシュします。行動的に活発な画分を特定するには、性的に成熟したメスのウミヤツメウナギを迷路のリリースケージに5分間順応させます。ウミヤツメウナギを放流し、ヤツメウナギがそれぞれ河川水を含む実験水路と制御水路で過ごした累積時間を10分間記録します。

次に、蠕動ポンプを使用して、車両内のランダムに割り当てられた実験チャネルにテスト刺激を制御チャネルに適用し、毎分 200 ミリリットルの一定速度で 5 分間、次に車両内でテスト刺激をさらに 10 分間適用し、ヤツメウナギが実験チャネルと制御チャネルで費やした累積時間を記録します。この手順では、セファデックスLH-20カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーで活性画分をさらに化合物に精製します。初期移動相の 0.5 mL でサンプルを調製し、クロロホルム-メタノールカラム、次にメタノールカラムにロードし、活性画分を溶出して化合物を得ます。

精製した化合物をHPLCの初期移動相で溶解および希釈して、1ミリリットルあたり約1マイクログラムの10マイクロリットル溶液を形成します。次に、サンプル溶液をHPLCバイアルに移し、HPLCのオートサンプラーにセットします。サンプルをエレクトロスプレーイオン化質量分析に注入し、クロマトグラフィー質量分析計を使用して高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを記録します。

選択した重水素化溶媒にサンプルを完全に溶解して、ミリリットルあたり約0.1〜10ミリグラムの範囲の濃度の溶液を形成します。サンプル溶液をNMRチューブに移し、900メガヘルツのNMR分光計に1Dおよび2DのNMRスペクトルを記録します。ここに示されているのは、600メガヘルツのNMR分光計です。

5つの新規推定ウミヤツメウナギフェロモンが同定され、その構造が分光法および分光法で解明されました。これらの推定フェロモンは、成虫のウミヤツメウナギの嗅上皮を刺激し、電気嗅覚記録の検出閾値が低かった。2択迷路行動アッセイでは、排卵した雌のウミヤツメウナギは、Petromyzone A、Petromyzene A、およびPetromyzene Bに引き付けられ、Petromyzone Cから反発されました。

この手順に続いて、X線結晶構造解析や誘導体化反応などの他の方法を実行して、化合物の立体化学などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、天然物や神経行動学の分野の研究者が、ウミヤツメウナギのような水生生物のフェロモンの生合成と生物学的機能を探求する道を開きました。クロロホルムの取り扱いは非常に危険であり、この試薬を取り扱う際には、ケミカルフードでの作業、手袋の着用、安全ゴーグルの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。