Name: 角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ角膜上皮摩耗法によるマウス角膜創傷治癒の細胞・分子メカニズム。蛍光可視化と上皮前駆細胞の動態解析により、眼科学・創傷治癒研究に応用可能な信頼性の高いモデルを確立する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

カイサ Ikkala 中央研究質問への実装中に後でだけでなく、彼女の貴重な技術支援と洞察力に富んだヘルプこのメソッドを実現するときのために感謝したいと思います。獣医の仕事のガイドラインの計画に彼女の助けのため実験動物センターとアンナ Meller に感謝したいと思いますも。

すべての実験は、全国の動物実験委員会によって承認されています。
1. 準備
<ol><li>すべてのソリューションを準備し、特記されない場合はで部屋の温度を維持します。Dispose が使用される材料およびソリューション廃棄物規則に従ってください。</li>
	<li>使用当所と ICR ザイモグラム株、どちらかの性別と年齢 4-12 週の間。C57BL/6 株を使用している場合手順 1.3.2 でケタミン-メデトミジン調製法に従ってください。その他の手順については、1.3.3.-1.3.5 に記載されている指示に従います。</li>
	<li>新鮮で時間操作を開始する前に、獣医学を準備します。カルプロフェンは後で使用される、従ってこの時点でそれを準備する必要はありません。<ol>
<li>麻酔のケタミン-メデトミジンのソリューションを準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 ml (Ketaminol 獣医) ケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジン (Cepetor 獣医) の滅菌 0.9 %1.25 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 1 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>C57bl/6 マウスの麻酔のケタミン-メデトミジンのより希薄溶液を準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 mL とケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジンの滅菌の 0.9% の 2.5 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (3.75 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 0.5 mg/kg) を管理します。 注: これは大人 c57bl/6 マウスの唯一の代替手順です。</li>
		<li>鎮痛のため buprenorfin を準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 0.3 mg/mL) 1.9 mL 滅菌の 0.9% に buprenorfin の塩化ナトリウム。0.2 mL/20 g のマウスの重量 (0.15 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>麻酔を中止のアチパメゾールを準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 5 mg/mL) の 0.9 %4.9 mL に対するアチパメゾールの塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウスの重量 (0.75 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>鎮痛後麻酔中カルプロフェンを使用します。0.1 mL を追加 (ストック濃度 50 mg/mL) カルプロフェン 0.9 %4.9 ml の塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg) を管理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光染色液を準備します。<ol>
<li>コバルト ブルーの光 (図 1) の下で耐摩耗性を可視化する蛍光ソリューションを使用します。微細なスケールとフルオレセイン塩の最初の測定 10 mg 0.1% フルオレセイン液を準備し、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) で 10 mL に追加します。</li>
		<li>フルオレセイン溶液の光から保護、シェーカーで 5 分間振る。 注: フルオレセイン ソリューションは、光に敏感な;光からカバー ソリューションをしてください。このソリューションは、2 ~ 3 日は +4 ° C に格納できます。用では、点眼薬に使用されるスポイト ボトルにフルオレセイン ソリューションを配置することをお勧めします。ドロッパー ボトルにソリューションを移動するときは、滅菌フィルターを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前に、と使用後に眼のバリのヒントをきれいまず PBS とし、70 %etoh。場合同じ操作中にいくつかのマウスにキズを作って、各マウスのクリーニングの手順を行います。</li>
	<li>(37 ° C) の温水プレートを入れて、ペーパー タオルを置きます。</li>
</ol>2. 角膜上皮剥離
注意: とき防護服 (白衣、手袋) を使用してマウスを処理します。管理する薬の量を見積もるには、マウスの重量を量る。
<ol><li>片手スクラッフィング メソッドを使用して、マウス23を処理します。ケタミン-メデトミジン混合物を腹腔内管理 (i. p.) 左下腹部に。個々 のケージにマウスを置くし、眠りに落ちるを待ちます。これは通常 5 分未満がかかります。その後、最初の buprenorfin をクリックし、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。同じ処理テクニックを使用します。 注: 麻酔を指定すると、プロトコル必要があります一時停止できません任意の時点で。</li>
	<li>前に、加熱面が暖かいことを確認します。加熱平板上麻酔下のマウスを置きます。尾反射はつま先反射が存在が不在の場合は、麻酔のレベルをお勧めします。尾と、つま先の指または鉗子でつまんでこれらの反射を確認します。過度の力を使用しないでください。麻酔は、最後の 20-25 分です。</li>
	<li>キズをするためには、洗浄の眼のはりを使用します。摩耗させる振動をオンにするバリのベースを回転させます。バリが正しく機能しているとき、手に振動を感じる。<ol>
<li>別に指でまぶたを保持することによって一度に 1 つ目を開いています。その後しっかりとギザギザが角膜に触れるし、眼表面の楽器同様、前後の移動は横に限り。バリ振動はゼロ; を実行します。押して、振るか角膜を引き裂きます。角膜中央部 20 研磨表面の動きが傷を誘導するために十分です。バリを持ち上げ、磨耗する角膜の領域に滞在してください。標準サイズの摩耗を取得いくつかのラウンド練習が必要になります。</li>
	</ol>
 注: 角膜無菌は、betadine 点眼液を使用して摩耗する前に達成することができます。</li>
</ol>3. 摩耗のイメージング
<ol><li>コバルト ブルーのペンライト (図 1) とフルオレセインのソリューションを使用して研磨領域を照らします。眼の表面は周囲の光で無色の表示されます。フルオレセイン アプリケーション後研磨領域蛍光を発する緑色の光ペンで目を照らすとき。<ol>
<li>必要な場合、2.3 同様に研磨目を開き、ドロッパー ボトルからフルオレセイン液の一滴を管理します。PBS または 0.9% 回、目を洗う、フルオレセインの背景を減らすために、NaCl。洗浄用スポイト ボトルやピペットを使用します。ソフトのワイプで液体を離れて吸い出しなさいし、に応じて、まつげの汚れを落としてください。余分な液体は通常涙運河の開口部の近くに、目の鼻側の境界に収集します。 注意: は、マイナーな擦り傷が誘発されるかもしれないと cleaining、角膜に触れることを避けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>角膜上皮剥離の写真を撮る。<ol>
<li>各撮像セッション中に類似画像を取得するには、コバルト ブルーのペンライトと一眼レフ カメラ (図 2) の安定した添付ファイルのツールを使用します。このプロトコルは、(図 2) を繰り返しやすいセットアップを提供します。<ol>
<li>ペン ライトとカメラを添付するには、テーブル ランプ フレキシブル アームとクランプ調整可能なカメラの腕と、クランプでそれぞれ使用します。ケーブルタイ テーブル ランプとマウスの目のすぐ上の位置に光のペン。光を異なる位置決め、耐摩耗性の可視化を変更可能性があります。これらのツールを位置決めのための提案は、図 2で説明します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>目の写真を撮るための一眼レフ カメラを使用します。部屋の光に必要な距離と位置とフォーカス カメラ (1:12) に動物を配置します。その後、コバルト ブルーのペンライトを除く他のすべてのライトを閉じます。 注: をペン ライト ハンドルをテープまたはイメージ投射の間のすべての時間にライトを保つためにゴムバンドを使用します。これは、画像が不鮮明になる場合に役立つかもしれない。同僚とイメージング手順を実行する簡単です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 角膜上皮剥離後に目覚める
<ol><li>最初 buprenorfin し、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。2.1 と同じ処理方法を使用します。</li>
	<li>抗菌、フシジン酸酸眼軟膏 (Isathal) に潤いと麻酔後細菌からきれいな眼の表面を保つすりむいたと非摩耗の目に一滴を配置します。</li>
	<li>マウスは 5 ~ 20 分加熱平板上で美味しいが、麻酔後のウェイク アップ期間中にマウスを観察します。モバイルになれば、個々 のケージに配置します。 注: 目を覚ます時間がかかります、加熱パッドで檻の中にマウスを置くをクリックするか、または加熱平板上全体のケージに配置、マウスを定期的に監視します。麻酔が身に着けている間、マウスは通常振るし、体前葉と上向きに達する。この現象は、3-4 時間で正常に返す必要があります、共有ケージに戻るマウスをいただくことができます。</li>
	<li>手順 2.2 同様、摩耗後 2 日連続で鎮痛・眼軟膏のカルプロフェン i. p. を管理します。4.2 と。</li>
</ol>5. 創傷治癒過程におけるイメージング
<ol><li>このプロトコルで使用時間は、傷の閉鎖を観察する摩耗後の 18 h、72 h を指します。<ol>
<li>連続イメージング 2.2 で説明したように、マウスを麻酔します。</li>
		<li>3 で説明したように、写真を撮る。</li>
		<li>アチパメゾール i. p. を持つ動物を覚ます、4.3 で説明したように、ウェイク アップ期間を監視します。 注: いない場合はフォロー アップを継続、5.1.2 の直後にマウスを安楽死させます。安楽死は、6.1 で説明されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 角膜コレクションとパラフィン包埋
<ol><li>最後の時間以降は、動物を犠牲に。CO2を満たすことができるチャンバーにマウスを配置します。CO でチャンバー内の空気を埋める2.動物、モバイル、尾の根元からしっかりと引っ張ってくると同時に頸部を押し、頸椎を脱臼します。 注意: 常に動物愛護の体のガイドラインに従ってください。</li>
	<li>目の側に解剖はさみで皮膚の開口部を切断することによって全体の眼球を収集します。眼球の下ではさみを置き、軌道から目玉をポップに眼神経をカットします。目は簡単に出ない場合は、鉗子を使用します。<ol>
<li>眼の中のソリューションの無料浸透を許可する 26 G 針で網膜側で、目の後ろの穴を作る。 注: は、乾燥の代わりになる、プロトコルを続行まで PBS に目をさせてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS で 2 mL チューブに眼球を収集します。この時点で実験を一時停止しません。</li>
	<li>PBS を削除し、4 ~ 5 時間 +4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で眼球を修正します。</li>
	<li>組織カセット ティッシュの処理のために固定の眼球を移動します。組織の加工機械と次のプログラムを使用します。<ol>
<li>PBS で洗い。</li>
		<li>2 x 45 分 70% エタノール室温で孵化させなさい。</li>
		<li>2 x 1 h 94% エタノール室温で孵化させなさい。</li>
		<li>室温での無水エタノールで 3 x 45 分を孵化させなさい。</li>
		<li>常温、37 ° C で最後キシレン キシレンの 3 x 1 h を孵化させなさい</li>
		<li>60 ° C でパラフィン ワックスで 3 × 1 h を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>処理組織後、眼球に埋め込む組織埋め込みブロックを使用した流動パラフィン (+ 60 の ° C)。ブロック内目を置き、それが横にいると周辺の境界線上を向いています。クール プレートに 5-10 分を固めるブロックができます。</li>
</ol>7. 角膜のパラフィン切片
<ol><li>機関のまたは製造元の指示に従って断面のミクロトームを準備します。 注意: は、シャープのミクロトーム刃を処理するとき注意してください。</li>
	<li>ミクロトームの横にある室内温純水と場所 1 浴と別超純水 +50 ° C に加熱</li>
	<li>眼球の 5 μ m 厚いセクションを確認します。 注: 断面中に簡単にレンズ改。これを避けるためには、セクションの新しい行を起動するたびに湿った組織切削の表面を拭いてください。ティッシュを湿らせて、水道水を使用します。</li>
	<li>室温水お風呂で互いに横にセクションを配置し、スライド グラスの助けを借りてお湯のお風呂に移動します。湯浴まですべてしわリラックスおよびセクションになるマット内のセクションをストレッチします。</li>
	<li>37 ° C で一晩のセクションのスライド ガラスを乾燥します。</li>
	<li>+60 ° C で加熱平板上 1 分スライドを維持することでセクションをスライドに添付します。この後、セクションことができます直接処理染色、免疫組織学的手法や +4 ° C で保存</li>
</ol>

<ol><li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li>
<li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+In+Corneal+Epithelium%3B+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li>
<li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO1+in+Corneal+Epithelium%3A+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li>
<li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713(1960).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1%2B+Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li>
<li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li>
<li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2%2FEphrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936(2012).</li>
<li>Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li>
<li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li>
<li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li>
<li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370(2015).</li>
<li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li>
<li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1V%CE%B26+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505(2011).</li>
<li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262(2013).</li>
<li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+sheet+movement%3A+Protein+and+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li>
<li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+%26%2334%3Bpurse+string%26%2334%3B+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound%2C+providing+coordinated+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin &#34;purse string&#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li>
<li>Lyu, J., Joo, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li>
<li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776(2015).</li>
<li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li>
<li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BALB%2Fc+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li>
<li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li>
<li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL%2F6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital%2C+ketamine+and+nitrous+oxide%2C+but+not+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K14+%2B+Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li>
<li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+cleavage+of+the+%CE%B24+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

負傷メソッドは、角膜の恒常性と病態のさまざまな側面を研究するための人気のあるツールです。耐摩耗性モデルでは、眼科に関連する問題に対処するため、よく制御された方法を提供しています。ただし、プロトコルの特定の重要なポイントは強調する価値が。特に、獣医、創傷治癒のタイムライン、および結果について説明詳細はザイモグラム技研や ICR 株式での使用に最適化されたが、マウス26系統の間で異なる場合があります。このプロトコルでは、約 20 分間、実験動物を麻酔残ります。これは、摩耗を実行する時間の短いが十分なウィンドウです。しかし、眼のはりを使用している場合、非常に高速な操作耐摩耗性自体を作る、このタイム フレームで実行できる必要があります。
簡単かつアクセス可能な可視化は、摩耗モデルの主な利点の 1 つです。分子生物学の方法と組み合わせると、これはすばらしい細部で上皮細胞研究への可能性を開きます。すりむいた角膜の組織学的や免疫学的染色の処理され、蛋白質または核酸が収集し、さらに検討します。Pajoohesh がんじらは、角膜上皮...

多くの器官の上皮層は、傷害にさらされています。ただし、創傷治癒過程での組織の損失を賠償する能力も含まれます。角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供しています。それは眼の外部表面を形作り、敏感な眼機械の保護レイヤーを提供します。したがって、角膜は、病原体や水の損失に物理的な障壁として機能します。3 つの層から成り立っています上皮、実質、内皮細胞。角膜の上皮は角膜の最も外側の層になります。上皮細胞は互いにタイトな接合1,2,3を厳密に遵守することで角膜のバリア機能を維持します。無細胞性角膜基底膜、ボーマン膜は、難治性の実質細胞が含まれている広範な間質から上皮を分離します。実質の下で血管内皮細胞チャネル栄養素、水、および上位層への酸素。
角膜の傷、クリニック4で非常に一般的です。角膜への傷害は様々 で、主にほこりや砂、傷、または他の異物のような小さな粒子によって引き起こされます。プロトコルは、角膜上皮の摩耗、臨床的に関連するタイプを再現するために目的を紹介します。そうでは、このプロトコルは、臨床医や角膜科学者が独自の研究で実装するため制御し、精液メソッドを提供します。鈍く眼バリ、Algerbrush II と組織を研磨し、マウス角膜の体内の損傷修復アッセイを行った。ここでは、ターゲット中心部の角膜上皮にのみ耐摩耗と損傷することがなく器官の他の部分を残して。したがって、移行、増殖と分化体内5のセル プロトコルは再上皮化時に研究角膜上皮細胞や基底膜に最適です。最近では、このモデルは、前駆細胞の動態解析けが6、7の後角膜上皮幹細胞ニッチを再確立する差別化された角膜上皮細胞の容量を発表するだけでなくマウス角膜を分析に使用されました。次の摩耗、角膜はその通常の透明性、引張強さに返します。興味深いことに、その再上皮化が細胞増殖8なし発生する生体外で研究が示されます。このプロトコルでは、マウスの角膜で中断のない癒しのタイムラインについて説明します。したがって、メソッドは癒しのパターンと速度で薬の効果をテストする適用です。
角膜は、創傷治癒の研究に広く使用されています。しかし、多くの研究は、傷害の他のモデルに依存しています。9角膜表面にフィルター ペーパーの有無、角膜損傷の確立モデルは水酸化ナトリウム (NaOH) を適用することによって実行されるアルカリ火傷です。角膜の上皮だけでなく、結膜と実質9,10に影響大とびまん性損傷でアルカリ暴露します。強いアルカリ液は血管新生9混濁、角膜潰瘍を誘発する示されています。炎症細胞は、通常 6 時間以内実質に侵入し、24 h11までそこに残る。したがって、アルカリ外傷は間質の活性化に関連する研究のことをお勧め方法です。化学傷害の別のタイプは、角膜9,10ジメチルスルホキシド (DMSO) を適用することによって加えることができます。他の一般的に使用される傷害モデル、実質14,15の上の部分に制限されて実質と角膜切除の傷を貫通切開創の傷があります。これらのメソッドは、間質の創傷治癒に関する質問に回答もな。異なった傷害モデルには、独自の長所と短所があります。摩耗、または角膜の上皮のデブリードマンは最初鈍くメスやブレードを使用して前のヴィヴォ角膜16に開発されました。このメソッドは、使用される生体内でマウス、ラット、ウサギ17,18,19,20,21,22後されています。眼のはり (図 1) を使用して、我々 上皮の残りの部分は影響を受けないまま、上皮の選択した領域のみを削除します。このように、角膜のさまざまな部分に上皮の除去を細かく指定することが可能です。さらに、摩耗のサイズは、フルオレセイン染色と評価できます。さらに、ここで我々 は治癒期間中摩耗閉鎖を従います。
このメソッドは、いくつかの利点をもたらす、i) 化学損傷では不可能です、耐摩耗のサイトの正確な位置を含む ii) 耐摩耗性を実行するクイック、iii) 非侵襲的です。ここで、しかし、これはラット、ウサギ、ヒトの角膜障害を研究するために使用の一般的なモデルであるだけでなく遺伝的マウスモデルの広大な配列に適用される可能性がモデルとしてザイモグラムの当所のマウスを使用して方法を述べる.

<table><tbody><tr><td>NMRIマウス</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>使用滅菌</td></tr><tr><td>メデトミジン</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>市場名:Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>市場名:Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>市場名:Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion製薬</td><td>Vnr471953</td><td>市場名:Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>市場名:Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1%フシジン酸性眼軟膏</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>市場名:Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush II眼のバリ(0.5 mmチップ)</td><td>アルジャーブラシ</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>コバルトブルー ペンライト</td><td>SPサービス</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>デジタル一眼レフカメラ</td><td>ニコン</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>調整可能なカメラアームとクランプ</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>高さ 28 cm</td></tr><tr><td>フレキシブルアームとクランプ付きテーブルランプ</td><td>プリズマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトワイプ</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖ツールセット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G 針</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL エッペンドルフ チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュカセット</td><td>サクラファインテック</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ加工機 ASP200S</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>ミリポア</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ埋め込み型 32×25×6mm</td><td>サクラファインテック</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td></td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>切片用ウォーターバス</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ライカ</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>フェザー</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>Th.Geyer GmbH & Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>ミリポア</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

マウス角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供します。角膜は、目の最も外側の層となる傷害に最初の防衛.実際には、クリニックの目傷害の最も一般的なタイプは角膜上皮剥離です。ここでは、角膜上皮、体内麻酔下マウスの除去、摩耗を誘発する眼バリを利用します。このメソッドは、ターゲットで再現可能な上皮の中断、その他の部分をそのままにできます。また、フルオレセイン染色とすりむいた上皮の可視化を記述する、すりむいた角膜を視覚化する方法について具体的なアドバイスを提供しています。創傷治癒の 0、18、および 72 時間後摩耗、傷は再 epithelialized までのタイムラインを従います。角膜損傷の上皮摩耗モデルは、上皮細胞の増殖, 移行および角膜の層の再上皮化に関する研究に最適です。ただし、このメソッドは眼のバリが間質細胞の層に浸透していないため創傷が治癒過程における間質の活性化を研究するが最適ではありません。このメソッドは、薬の効果の前臨床試験などの臨床応用に適しています。

このプロトコルは、マウス角膜への摩耗損傷を負わせるモデルについて説明し、従うし、摩耗後の癒しのプロセスを視覚化する方法を示唆しています。最近では、創傷治癒の6中に角膜上皮幹細胞の役割を研究するこのメソッドを採用しました。確立されたツールの使用は正常な摩耗実験への鍵です。我々 などは、擦り傷6,7,24を実行するのに Algerbrush II 眼はり (図 1) を使用しています。このツールは、離れてドリルや角膜上皮の鋏ではなくブラシ サイズで 0.5 mm の鈍くバリ先端をあります。したがって、このツールは角膜の摩耗損傷として推奨される選択であります。
このモ...

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

この方法は、角膜創傷治癒中に関与する細胞および分子メカニズムに関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、角膜挿入の場合、つまり目の表面に摩耗や引っかき傷がある場合に、緊急治療室の状況を反映することです。この方法を最初に思いついたのは、角膜上皮前駆細胞と、角膜の恒常性維持が困難な状況でのそれらの挙動を研究していたときでした。角膜の摩耗を行うことは困難であり、練習が必要なため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。まず、コバルトブルーライトの下での摩耗を視覚化するための0.1%フロレシン溶液を、10ミリグラムのフロレシン塩を細かいスケールで測定することにより調製します。次に、10ミリリットルのFosfate緩衝生理食塩水に塩を加えます。フロレシン溶液を光から保護し、5分間振とうします。滅菌フィルターで溶液をスポイトボトルに入れ、光から保護します。フロレシン溶液は、摂氏4度で2〜3日間保存できます。使用前と使用後に眼のバリの先端を清掃してください。まずPBSを使用し、次に70%エタノールを使用します。まず、麻酔をかけたマウスを、摂氏37度に加熱した温め皿の上のペーパータオルの上に置きます。尻尾つまみとつま先つまみを施して麻酔のレベルを確認します。麻酔のレベルは、尾反射がなく、つま先反射が存在する場合に良好です。バリのベースを回転させてバイブレーションをオンにします。まぶたを指で離して、擦り減らす目を開きます。次に、バリを角膜にしっかりと触れ、バリを持ち上げずに眼面上で器具を前後左右に動かします。バリの振動により傷がつきます。角膜を押したり、振ったり、破ったりしないでください。.角膜中央部では、表面上の20回の擦り傷運動が創傷を誘発するのに十分である。角膜の摩耗は難しく、練習が必要です。正しい圧力に注意を払い、1回の試行で摩耗を行うようにしてください。スポイトボトルから擦り切れた目に1滴のFlourecine溶液を投与します。.次に、0.9%生理食塩水で一度目を洗い、フロレシンのバックグラウンドを減らします。余分な液体を柔らかいワイプで吸収し、必要に応じてまつげをきれいにします。摩耗をイメージするには、コバルトブルーのペンライトが取り付けられたテーブルランプをマウスの目のすぐ上に配置します。ペンライトのボタンをテープで留めて、一人で作業するときにライトを点灯させておくことができます。室内の光の中で一眼レフカメラの焦点を合わせ、コバルトブルーのペンライトを除く他のすべてのライトをオフにします。コバルトブルーのペンライトで照らすと、凹凸のある表面に閉じ込められたフロレシン分子により、摩耗した領域が緑色に蛍光を発します。一眼レフカメラを使用して、目の写真を撮ります。目のイメージング後、マウスを温めたプレートに戻します。抗菌性のフシジン

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここで説明されているのは、上皮組織の本来の微小環境における損傷応答のメカニズムを調査するために使用できる、臨床的に関連性のあるex vivo模擬白内障手術モデルの確立です。...

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。...

角膜創傷治癒を研究するための上皮擦過傷モデル

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

この記事では、角膜の解剖学と組織学、およびその治癒過程を研究するために開発された新しい動物モデルについて説明します。この新しい動物モデルは、ヒトの角膜と多くの類似点を持つ角膜を持つモンゴルスナネズミを使用しています。...

創傷治癒の動物モデルとしてのモンゴルスナネズミ

本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を...

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

このプロトコルは、細胞レベルでのその後の創傷閉鎖を評価するために、擦過傷によってゼブラフィッシュの眼表面を損傷することに焦点を当てている。このアプローチは、眼のバリを利用して角膜上皮を部分的に除去し、走査型電子顕微鏡を使用して創傷閉鎖中の細胞形態の変化を追跡する。...

ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒:擦過傷から創傷閉鎖画像分析まで

ここでは、角膜を神経支配する感覚線維を損傷する3つの異なる方法を提案します。これらの方法は、マウスの軸索再生の研究を容易にします。これら3つの方法は、他の動物モデルにも適応可能であり、角膜神経支配の生理学と再生の研究に最適です。...

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

私たちは、角膜上皮の掻爬術と角膜縫合糸の組み合わせにより、重度の角膜炎症のラットモデルを開発しました。この研究では、炎症条件下での角膜の炎症パターン、上皮の増殖、および辺縁系幹細胞の変化を評価しました。...

角膜上皮掻爬術と角膜縫合糸の併用に基づくラットにおける重篤な角膜炎症モデルの確立

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

学ぶ角膜上皮摩耗法によるマウス角膜創傷治癒の細胞・分子メカニズム。蛍光可視化と上皮前駆細胞の動態解析により、眼科学・創傷治癒研究に応用可能な信頼性の高いモデルを確立する。

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

さらに動画を探す